Un avantage de ce protocole est que la feuille de ver est facile à manipuler. La feuille a des caractéristiques qui empêchent le séchage, ce qui nous permet d’effectuer l’irradiation des microbes aux animaux vivants, effectuer plusieurs analyses comportementales, et l’observation à long terme. Les canaux microfluidiques de cette feuille de ver sont ouverts, ce qui facilite la collecte des animaux.
Ces feuilles de ver peuvent également être utilisées à plusieurs reprises, ce qui les rend plus économiques. Lorsque nous avons développé cette technique, nous voulions irradier seulement une partie des animaux avec un microbeam sous un microscope. Nous avions donc besoin de copeaux clairs et très fins capables de tenir les animaux.
Pour commencer, placez une feuille mince et transparente sur la scène pour l’utiliser comme film de couverture inférieure. Placez délicatement une feuille de ver sur le film de couverture inférieure avec des pinces plates. Placez au moins trois gouttelettes de solution tampon à la surface d’une boîte de Pétri non traitée de 6 centimètres.
Ensuite, choisissez plusieurs C.elegans adultes avec un cueilleur de platina dans une assiette de culture. Transférer les animaux dans une gouttelette avec le cueilleur de platina et permettre aux animaux de nager dans le tampon pour éliminer les bactéries. Lavez les animaux dans deux gouttelettes séparées et rincez les animaux dans une autre gouttelette.
Ensuite, placez une gouttelette de solution tampon sur la surface de la feuille de ver. Retirez les animaux lavés de la gouttelette tampon et transférez-les sur une gouttelette sur la feuille de ver. Utilisez des pinces plates pour placer un film de couverture PS sur la feuille de ver, et appuyez doucement sur les canaux d’une extrémité de la feuille à l’autre.
Ou tout simplement déposer les animaux dans la gouttelette et sceller doucement avec le film de couverture afin gouttelette s’étend entre le couvercle et les feuilles de ver avec les animaux dans le canal. Confirmez que les animaux sont vivants en vérifiant le mouvement avec un microscope à 1-2x grossissement. Enregistrez les positions des animaux et notez spécifiquement le numéro du canal dans lequel chaque animal est enfermé, et la position de chaque animal dans le canal.
Pour recueillir les animaux immobilisants, utilisez des pinces plates pour enlever le film de couverture de la feuille de ver, puis déposez 10-15 microlitres de solution tampon sur l’un des canaux microfluidiques enfermant les animaux. Sous le stéréomicroscope, observez les animaux lorsqu’ils commencent à tourner. Ensuite, utilisez le ramasseur de platina pour ramasser les animaux de natation et les transférer dans une plaque d’analyse.
Après avoir enfermé les animaux comme démontré précédemment, observez les taches fluorescentes sur les animaux avec un microscope flourescence. Puis image calcium ion wave propagation en utilisant l’acquisition vidéo pour observer les activités dynamiques. Placez la feuille de ver usée sur une boîte de Pétri de six centimètres et placez environ 100 microlitres d’eau ultra-pure stérilisée sur la feuille.
Utilisez des doigts gantés pour étendre l’eau à la surface de la feuille et laver les contaminants. Ensuite, utilisez des lingettes jetables pour éliminer l’humidité de la feuille de ver. Distribuez cinq millilitres d’éthanol à 70 % dans la boîte de Pétri et utilisez des doigts gantés pour étendre l’éthanol sur la feuille de ver.
Enfin, une fois la feuille sèche, déposer la feuille sur une boîte de Pétri stérile et couvrir. En utilisant ce protocole, l’adéquation des différents films de couverture a été étudiée. Il n’y avait aucune différence significative dans la motilité entre les animaux de contrôle et les animaux enfermés dans des canaux microfluidiques avec le film de PS.
En revanche, la motilité a été sensiblement réduite chez les animaux enfermés sous un verre de couverture. La motilité des animaux enfermés dans un film pour animaux de compagnie a également été considérablement diminuée. Il est important de sélectionner soigneusement les films de couverture pour l’étanchéité des canaux microfluidiques.
En utilisant ce protocole, nous avons évalué l’adéquation des différents films de couverture à travers des analyses de locomotion des animaux trois heures après l’immobilisation sur puce. En utilisant cette technique, nous avions l’intention de développer une puce humide ultra-mince uniquement pour l’irradiation des microbes. Cependant, ces feuilles de ver ont déjà été utilisées pour l’imagerie et les analyses comportementales au-delà de leurs applications originales.
