Les auteurs remercient le Land de Bade-Wurtemberg et la Europäische Union Europäischer Fonds regionale Entwicklung für die - pour le financement ZAFH-PHOTON n, le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) pour la recherche des subventions non. 1792C08 ainsi que la GmbH Baden-Württemberg-Stiftung pour le financement du projet &quot;Aurami&quot;.

1. Ensemencement et incubation des cellules <ol><li> Cellules individuelles de semences, par exemple U373-MG ou des cellules de glioblastome U-251-MG à une densité typique de 100 cellules / mm 2 sur une lame de verre et les cultiver pour 4872 heures en milieu de culture (par exemple RPMI 1640 supplémenté avec 10% sérum de veau foetal et des antibiotiques) à l&#39;aide d&#39;un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Incuber les cellules avec un marqueur membranaire, par exemple 6-dodécanoyl-2-diméthylamino naphtalène (Laurdan) appliqué pendant 60 minutes à une concentration de 8 pM (dans un milieu de culture) 4, ou un marqueur cytoplasmique, par exemple calcéine acetomethlyester appliqué pendant 40 minutes à une concentration de 5 pM 3, ou un photosensibilisateur associé à la membrane, par exemple lors de la protoporphyrine IX induite 4 heures d&#39;incubation avec son précurseur acide 5-aminolévulinique (5-ALA; 1 mM) 4,5. </li><li> Laver les cellules avec du milieu de culture ou du tampon phosphate salin (PBS) avant la microscopie de fluorescence. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol><li> Utiliser un microscope droit, par exemple Zeiss Axioplan, et remplacer le condensateur par un dispositif d&#39;éclairage, tel que décrit dans la référence. 3 avec un hémi-sphérique ou un prisme de verre semi-cylindrique couplé optiquement à la porte-objet (voir figure 1). </li><li> Utiliser un faisceau laser collimaté parallèle qui, après formation d&#39;image par le prisme de verre et d&#39;autres composants optiques (par exemple un miroir concave) à nouveau les résultats en un faisceau parallèle à la surface de l&#39;échantillon (rayons pupille télécentrique). Veiller à ce que le vecteur de champ électrique est polarisée perpendiculairement au plan d&#39;incidence. </li><li> Utiliser un miroir ajustable à l&#39;intérieur du condenseur qui forme une image dans le plan d&#39;échantillon et illumine l&#39;échantillon sous un angle d&#39;incidence variable (rayon d&#39;objet). Le miroir réglable peut être entraîné par un moteur pas à pas, où chaque position correspond à un angle d&#39;incidence bien définie, telle que déterminée par des mesures goniométriques 3 </sup&gt;. </li><li> Étalonnage de la position angulaire du miroir réglable à l&#39;aide de l&#39;angle critique Θ = 61,3 ° C pour une transition de verre de l&#39;eau en tant que valeur fixe. Θ c peuvent être visualisées sur la variation de Θ quand un colorant fluorescent (par exemple 1 mM flavine mononucléotide, FMN) est dissous dans de l&#39;eau. La position du miroir à Θ = Θ c est stocké dans le programme de positionnement de miroir. </li><li> Définissez les paramètres de la caméra (rétro-éclairé Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR technologie, Belfast, Royaume-Uni 6), dont la température, le gain de temps d&#39;enregistrement, et la vitesse de déplacement. </li><li> Utilisez un objectif de grossissement approprié et de préférence modérée ouverture numérique (par exemple 40 × / 0,75 ou 63 × / 0,90 immersion dans l&#39;eau) et de localiser le porte-objet du microscope. Utiliser de l&#39;huile d&#39;immersion pour assurer un contact optique de l&#39;échantillon avec le prisme de verre. Enregistrer des images de fluorescence des échantillons identiques lors de la variation de laangle d&#39;éclairage (Θ ≥ Θ Θ c avec c, correspondant à 64,5 ° pour une interface cellule-verre). Une plage angulaire de 66 ° -74 ° par pas de 0,5 ° ou 1 ° est recommandé. Utilisez un laissez-passer approprié à long ou un filtre passe-bande pour la détection de la fluorescence. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Lire les images (par exemple au format ASCII) enregistrées à différents angles Θ, ainsi que les paramètres de l&#39;appareil (pour la discrimination de fond), la longueur d&#39;onde d&#39;excitation et les indices de réfraction du verre (n 1 = 1,52) et des cellules (n = 2 1,37) dans le programme d&#39;évaluation (LabView; NanoCell). Pour chaque ensemble de paramètres de la profondeur de pénétration d (Θ) et le facteur de transmission T (Θ) sont calculées automatiquement. </li><li> Sélectionnez les images utilisées pour l&#39;évaluation de la cellule-substrat distances Δ selon l&#39;équation 5 (marqueur membranaire) ou l&#39;équation 4 (marqueur cytoplasme), les images individuelles avec inhomogèneéclairage (e révélatrice, rayures g.) peuvent être exclues. </li><li> Calculer des images de cellules-substrat topologie et sélectionnez un code de couleur approprié pour l&#39;affichage. Pendant des profils d&#39;évaluation de pixels individuels peuvent être affichés, comme le montre la figure 2. Ces profils peuvent être utilisées comme indicateur de la qualité de l&#39;ajustement. </li><li> Rangez le protocole d&#39;évaluation. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Expériences représentatives sont réalisés avec des cellules génétiquement modifiées glioblastome U251-MG aimablement fournis par le professeur Jan Mollenhauer, Département de moléculaire en oncologie, Université du Sud du Danemark, Odense. Dans ces deux sous-clones de cellules U251 les gènes suppresseurs de tumeur TP53 ou PTEN sont surexprimés en utilisant un système Tet-On expression inductible, de sorte que ces cellules présentent un potentiel tumorigène réduite et peut être considéré comme moins malin. Très malignes U251-MG cellules sans gène suppresseur sont utilisés comme témoins, et U251-MG cellules de type sauvage servir pour une autre comparaison. Une diode laser émettant une série quasi continu d&#39;impulsions picosecondes (LDH400 avec chauffeur PDL 800-B, Picoquant, Berlin, Allemagne, longueur d&#39;onde: 391 nm; impulsion d&#39;énergie: 12 pJ; taux de redoublement: 40 MHz) est utilisée comme une source d&#39;excitation. La figure 3 images de TIRFM U251 MG-cellules de glioblastome avec un actif gène suppresseur de tumeur TP53 et incubées avec Laurdan (8 um; 60 min) sont représentées pour des angles d&#39;incidence de 66,0 °, 69,0 ° et 73,0 ° correspondant à des profondeurs de pénétration de l&#39; champ électromagnétique évanescent d&#39;environ 140 nm, 75 nm et 60 nm, respectivement. Avec la diminution de la fluorescence diminue la profondeur de pénétration de l&#39;intensité (voir écailles) et provient de plus d&#39;un des sites superficiels des cellules (par exemple les contacts correspondants sur leurs bords). Cellule-substrat distances (visualisée dans 3d figure par un code couleur allant de 0 à 600 nm) varient fortement sur ​​les cellules entre lely quelques nanomètres (blanc-jaune) et 250-300 nm (rouge foncé), des contacts focaux et les grands c.-à-cellule-substrat distances sont situés à proximité. La même chose vaut pour U251-MG cellules de glioblastome avec un actif gène suppresseur PTEN (figure 4d), ​​tandis que la cellule-substrat distances sont assez constants pour U251-MG contrôle et de cellules de type sauvage avec des valeurs typiques de 80-100 nm (jaune, figure 4b ) et 150-200 nm (rouge-orange; figure 4a). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> Figure 1. Dispositif d&#39;éclairage pour VA-TIRFM dans un microscope droit. Un miroir réglable entraînée par un moteur pas à pas permet une résolution angulaire de ± 0,25 °. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> Le profil d&#39;évaluation Figure 2. Pour un pixel (schéma). Lorsque ln [I F / T (Θ)] est représentée en fonction de 1 / d (Θ), la pente représente la distance Δ substrat cellulaire. Cette pente est généralement déterminée avec une précision de l&#39;ordre de ± 10%. Une valeur - résultant de l&#39;illumination homogène - a été marqué et exclus de l&#39;évaluation. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> Figure 3 images TIRFM de U251-MG cellules de glioblastome avec activées TP53 gène suppresseur par incubation avec Laurdan (8 uM; 60 min). Enregistrées à différents angles d&#39;éclairage (ac); cellule-substrat distances de l&#39;ordre de 0-600 nm montré par un code couleur (d); longueur d&#39;onde d&#39;excitation: 391 nm, détection: ≥ 420 nm; taille de l&#39;image.: 210 um um × 210 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Figure 4 cellules-substrat distances U251-MG cellules glioblatoma dans la gamme de 0-600 nm indiquées par un code couleur;. (A) de type sauvage (b) les contrôles; (c) les cellules avec un gène suppresseur activé TP53; (d) cellules avec PTEN suppresseur gène activé, longueur d&#39;onde d&#39;excitation: 391 nm, détection: ≥ 420 nm; taille de l&#39;image.: 210 um um × 210 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

On décrit une méthode de mesure de la cellule-substrat distances avec une précision nanométrique. À l&#39;heure actuelle, les méthodes de microscopie de super-résolution, fondée par exemple sur l&#39;éclairage structuré 7 ou sur simple 8-10 de détection des molécules ainsi que l&#39;appauvrissement de l&#39;émission stimulée (STED) microscopie à 11 sont d&#39;un intérêt considérable. Aucune de ces techniques, cependant, permet une résolution axiale inférieure...

Lorsqu&#39;un faisceau lumineux se propageant à travers un milieu d&#39;indice de réfraction n 1 répond à une interface avec un second milieu d&#39;indice de réfraction n 2 &lt;n 1, la réflexion totale interne se produit à tous les angles d&#39;incidence Θ, qui sont plus grand que l&#39;angle critique Θ = c arcsin (n 2 / n 1). Tout en étant totalement réfléchie du faisceau lumineux incident évoque un champ électromagnétique évanescent qui pénètre dans le second milieu, et décroît exponentiellement avec la distance perpendiculaire à partir de l&#39;interface z selon I (z) = I 0 ez / d (Θ). I (z) correspond à l&#39;intensité du champ électromagnétique et d (Θ) de la profondeur de pénétration de longueur d&#39;onde λ, telle que donnée par d (Θ) = (λ/4π) (n 1 2 sin 2 Θ - n 2 2) -1 / 2 Comme indiqué dans la littérature 1,2, I 0 </sUB&gt; correspond à l&#39;intensité de la lumière incidente I e multiplié par le facteur de transmission T (Θ) et le rapport n 2 / n 1. Si le vecteur de champ électrique de ce faisceau de lumière est polarisée perpendiculairement au plan d&#39;incidence (c&#39;est à dire le plan défini par l&#39;incident et le faisceau réfléchi), ce facteur de transmission est donnée par T (Θ) = 4 cos Θ 2 / [1 - (n 2 / nL 1) 2] Pour l&#39;intensité de fluorescence détectée à des mesures TIRFM, absorption de la lumière doit être intégrée sur toutes les couches de l&#39;échantillon et multiplié par le rendement quantique de fluorescence du colorant η pertinent ainsi que de l&#39;angle solide de détection de Ω. Comme indiqué précédemment 3, cette intensité peut être décrite par I F (Θ) = A (Θ) OC (z) e-z / j (Θ) dz si tous les facteurs qui sont indépendants f<html> rom l&#39;angle d&#39;incidence Θ et la coordonnée z sont inclus dans l&#39;équation A. constante expérimentale 3 peut être résolu analytiquement, si la concentration (z) c de fluorophores est considéré comme à peu près constante - Soit à toutes les coordonnées z ≥ Δ, par exemple, dans le cytoplasme des cellules ayant un Δ la distance de l&#39;interface. Dans ce cas, l&#39;intégrale doit être calculée à partir de z = Δ z = ∞ entraînant I F = A c T (Θ) d (Θ) e-Δ / j (Θ) - Ou entre z = Δ - t / 2 et z = Δ + t / 2, c&#39;est à dire à l&#39;intérieur d&#39;une couche mince d&#39;épaisseur t, par exemple, une membrane de la cellule située à une distance à partir de l&#39;interface de Δ. Dans ce cas, l&#39;intensité de la fluorescence peut être calculé comme I F = A c T (Θ) te-Δ / j (Θ), si t est faible par rapport à Δ. ent &quot;&gt; De équations (4) et (5) la cellule-substrat distances Δ peut être calculée, si les images d&#39;intensité de fluorescence I F sont enregistrés pour des angles variables Θ, et si ln (I F / T d) (Eq. 4) ou ln (I F / T) (Eq. 5) est évaluée en fonction de 1 / d pour ces angles. Par le marqueur membranaire Laurdan utilisé dans le présent document (a. ci-dessous) l&#39;évaluation a été effectuée selon l&#39;équation. 5. Comme indiqué précédemment 3 d&#39;acquisition d&#39;images, et de l&#39;évaluation nécessite - Une répartition homogène de la lumière d&#39;excitation sur l&#39;échantillon, - La validité d&#39;un modèle de couche 2-(avec les indices de réfraction n 1 et n 2 pour le substrat et le cytoplasme, respectivement). Il en est, si la membrane plasmique est très mince, et si la couche du milieu extracellulaire (entre la cellule et le substrat) est faible par rapport à la longueur d&#39;onde de la lumière incidente. En outre, une ouverture modérée numérique(Typiquement 0,90 ≤ A) de l&#39;objectif de microscope est avantageux d&#39;éviter les écarts de luminosité dues à l&#39;anisotropie du rayonnement dans le champ proche de l&#39;interface diélectrique.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Type </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Incubateur </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> À flux laminaire </td><td> Holten Safe </td><td> S2010 1.2 FR GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% de pénicilline / streptomycine </td><td> BIOCHROM </td><td></td><td> Milieu de culture </td></tr><tr><td> Objet qui glisse en verre </td><td> Marienfeld </td><td> Pur verre blanc </td><td> Procédure de nettoyage spécial utilisé </td></tr><tr><td> 6-dodécanoyl-2-diméthylamino naphtalène (Laurdan) </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td> Marqueur fluorescent (solution stock: 2 mM dans l&#39;éthanol) </td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Carl Zeiss </td><td> Axioplan 1 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Diode laser </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 avec pilote PDL 800-B </td><td> Longueur d&#39;onde: 391 nm </td></tr><tr><td> Simple mode fibre </td><td> Point Source </td><td> kineFlex </td><td> Utilisé avec une optique de collimation </td></tr><tr><td> Caméra EMCCD </td><td> Andor </td><td> DV887DC </td><td> Caméra rétro-éclairé </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

Topologie de surface, par exemple des cellules en croissance sur un substrat, est déterminée avec une précision nanométrique à angle variable par microscopie de fluorescence à réflexion interne totale (VA-TIRFM). Les cellules sont cultivées sur des lames transparentes, et mis en incubation avec un marqueur fluorescent réparti de façon homogène dans la membrane plasmique. Illumination se produit par un faisceau laser parallèle sous des angles variables de réflexion interne totale (TIR) ​​à différentes profondeurs de pénétration du champ électromagnétique évanescent. L&#39;enregistrement des images de fluorescence lors d&#39;une irradiation à environ 10 sous différents angles permet de calculer les distances cellule-substrat avec une précision de quelques nanomètres. Les différences d&#39;adhérence entre différentes lignées cellulaires, les cellules cancéreuses et les cellules par exemple moins malignes, sont ainsi déterminés. En outre, les changements possibles de l&#39;adhésion cellulaire sur un traitement chimique ou photodynamique peut être examiné. En comparaison avec d&#39;autres méthodes de super-résolution exposition à la lumière microscope est maintenudes dommages très petite, et pas de cellules vivantes devrait avoir lieu.

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Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Topologie de l&#39;adhésion cellulaire sur un substrat est mesurée avec une précision nanométrique par microscopie à angle variable fluorescence à réflexion interne totale (VA-TIRFM).

Nanotopology d&#39;adhésion cellulaire sur Microscopie à angle variable de fluorescence à réflexion interne totale (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

10.1K vues.  Institut für Angewandte Forschung. Topologie de l'adhésion cellulaire sur un substrat est mesurée avec une précision nanométrique par microscopie à angle variable fluorescence à réflexion interne totale (VA-TIRFM).

Vidéo: Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l&#39;aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Perles agrégation essais pour la caractérisation de molécules d&#39;adhésion cellulaire putatif

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly interesting for already approved polymers that have a long standing use in medicine because these materials are well characterized and legal issues associated with the introduction of newly synthesized polymers may be avoided. Polytetrafluoroethylene (PTFE) is one of the most frequently employed materials for the manufacturing of vascular grafts but the polymer lacks cell adhesion promoting features. Endothelialization, i.e., complete coverage of the grafts inner surface with a confluent layer of endothelial cells is regarded key to optimal performance, mainly by reducing thrombogenicity of the artificial interface.
This study investigates the growth of endothelial cells on peptide-modified PTFE and compares these results to those obtained on unmodified substrate. Coupling with the endothelial cell adhesive peptide Arg-Glu-Asp-Val (REDV) is performed via activation of the fluorin-containing polymer using the reagent sodium naphthalenide, followed by subsequent conjugation steps. Cell culture is accomplished using Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and excellent cellular growth on peptide-immobilized material is demonstrated over a two-week period.

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

Wet Chemistry and Peptide Immobilisation sur polytétrafluoroéthylène pour l&#39;amélioration de l&#39;adhérence cellulaire

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

Division cellulaire chez les mammifères dans des Matrices 3D par microscopie Quantitative réflexion Confocal

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...