Hirschil Trust, Saperstein Scholars finance la recherche médicale Michael, et la communion NYU Whitehead pris en charge ce travail.

Une. Enrobage du puits de microplaques Remarque: Le but de cette étape est de recouvrir les surfaces de polystyrène avec ICAM-1 pour servir de ligands pour les cellules T de LFA-1. <ol><li> Préparer les solutions suivantes: <ol><li> Préparer la solution de revêtement par remise en suspension recombinante d&#39;ICAM-1 avec un tampon phosphate salin (PBS) (137 mM NaCl, KCl 2,7, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) enrichi en calcium (1 mM CaCl 2) et de magnésium (MgCl 2 nM 2). Assurez-vous que la concentration finale de ICAM-1 est de 10 pg / ml, faites partir d&#39;une solution de 0,7 mg / ml et conservé dans un congélateur à -80 ° C. </li><li> Préparer la solution d&#39;adhérence par l&#39;enrichissement du PBS avec 0,5% de l&#39;homme (ou bovine) de sérum-albumine (HSA / BSA), 2 mM de MgCl2, et 1 mM de CaCl2. </li><li> Préparer la solution de lavage par addition de 2 mM de MgCl2 et 1 mM de CaCl 2 à PBS. Réchauffer toutes les solutions à 37° C avant utilisation. </li></ol></li><li> Laver les puits avec 24 50 ul de solution de lavage. Il s&#39;agira notamment de puits non lavés, (PMA cellules traitées) positifs et négatifs (puits non revêtus) Commandes. Pour chaque condition énoncée au moins trois puits (triple). </li><li> Ajouter 50 ul de solution de revêtement dans chaque puits. Ne pas ajouter aux puits témoins non revêtus. Incuber pendant une heure à l&#39;intérieur 37 ° C incubateur. </li><li> Aspirer la solution de revêtement en douceur, sans permettre à la pointe de toucher le fond des puits. Laver une fois avec 50 ul de solution de lavage. </li><li> Ajouter 50 ul de solution d&#39;adhérence et incuber la microplaque pendant une heure à l&#39;intérieur de 37 ° C incubateur. </li><li> Aspirer délicatement et laver une fois avec 50 solution de lavage ul. Utilisation de la plaque, le même jour, cependant, il est possible de le maintenir à 4 ° C pendant une nuit, et l&#39;utiliser le jour suivant. </li></ol> 2. Cellules T Isolation de sang <ol><li> Ajouter T enrichissement cellulaire humaine cocktail à 50 pl / ml of sang entier (par exemple pour 3 ml d&#39;anticoagulant (héparine, EDTA, ou citrate) sang total, ajouter 150 ul de cocktail). Mélangez bien. </li><li> Incuber 20 min à température ambiante. </li><li> Pour un tube à centrifugation de 50 ml ajouter 3 ml de sang traité et d&#39;un volume égal de PBS (sans calcium ni magnésium) enrichi avec 1% de D-glucose à température ambiante. Mélanger doucement avec une pipette Pasteur. </li><li> Ajouter 15 ml de Ficoll-Paque PLUS pour le tube de centrifugation. </li><li> Superposer soigneusement les 6 ml dilué un échantillon de sang sur le milieu d&#39;isolement des lymphocytes. </li><li> Centrifugeuse à 400 g pendant 20 min à 20 ° C avec de brisure. </li><li> Prélever la couche supérieure à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur propre, en laissant la couche de lymphocytes non perturbée à l&#39;interface. La couche supérieure de plasma peut être conservé pour une utilisation ultérieure. Aide d&#39;une pipette Pasteur propre transférer la couche de lymphocytes à un tube à centrifuger propre. </li><li> Ajouter 3 volumes (9 ml) de PBS pour les lymphocytes. Suspendre les cellules par doucement draaile eux dans et hors d&#39;une pipette Pasteur. </li><li> Centrifuger à 400 g pendant 5 min à 20 ° C. </li><li> Retirer le surnageant. Les lymphocytes devraient maintenant être suspendus dans le milieu approprié à l&#39;application. Transférer les cellules dans un ballon de culture T-75 dans 20 ml du milieu RPMI 1640 contenant 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine. </li></ol> 3. Préparation des cellules Remarque: Une condition préalable est que les cellules devant être étiquetés avec un réactif fluorescent. Dans ce protocole utiliser carboxy succinimidylester fluorescéine (CFSE), la protéine fluorescente cependant verte (GFP) des cellules exprimant sont une alternative acceptable. <ol><li> Comptez 2,4 x 10 6 cellules T (1 x 10 5 pour chaque puits) en utilisant un hématimètre. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture dépourvu de sérum (de privation de sérum). Incuber les cellules pendant 2 heures dans le 37 ° C incubateur. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min (400 x g). Aspirer les médias etremettre en suspension dans 1 ml de PBS. </li><li> Ajouter CFSE à 1:1000 dilution (bouillon à base de 5 mM). Couvrir de la lumière et incuber pendant 8 min à température ambiante. </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 10 ml de PBS 37 ° C et centrifuger à 400 g pendant 5 min. </li><li> Re-suspendre culot de cellules avec 1,2 ml de la solution d&#39;adhérence préchauffé (1 x 10 5 cellules par 50 ul). </li></ol> 4. Stimulation des cellules Remarque: Afin de lancer l&#39;adhérence, les cellules doivent être stimulées. Dans l&#39;expérience suivante, les cellules sont stimulées par l&#39;intermédiaire du TCR l&#39;aide d&#39;anticorps anti-CD3 de reticulation, mais soluble SDF-1 pourrait servir d&#39;alternative. Selon le but des expériences, divers réactifs pharmacologiques pourraient être ajoutés avant ou pendant la stimulation d&#39;étudier l&#39;impact sur l&#39;adhésion cellulaire. Phorbol myristate acétate (PMA) est un ester de phorbol qui est structurellement similaire à la deuxième glycérol messager diacylique (DAG) et active la kinase multiple doncs en aval de la TCR (principalement la protéine kinase C); ici, il est utilisé comme contrôle positif. <ol><li> Réchauffez la microplaque à 37 ° C. </li><li> Diviser les cellules vides dans 8 tubes de 1,5 ml (150 pl dans chaque tube), un tube pour chaque condition. </li><li> Traiter les cellules en conséquence: <ol><li> Stimuler un tube avec de la PMA à 10 ng / ml pour servir de témoin positif. Maintenir trois tubes non traité, pour servir de témoin pour la stimulation (&quot;pas de stimulation&quot;), le contrôle de chargement non lavé (&quot;pas de lavage&quot;), et le contrôle de ICAM-1 revêtement («non couché»). </li><li> Stimuler quatre tubes avec différentes concentrations d&#39;anticorps anti-CD3 (0,1, 1, 5 et 10 pg / ml). Passez à l&#39;étape suivante sans retard. </li></ol></li><li> Aliquotes de 50 pi de mélange de cellules stimulées dans chaque puits vide. Le nombre final de cellules par puits est de 1 x 10 5. </li><li> Placer la microplaque à 37 ° C incubateur pendant 15 min. Remarque: Certaines lignées de cellules T nécessitent une stimulation plus courte<html> temps de tion. Pendant ce temps, les cellules se déposeront au fond du puits et de se conformer aux ligands cibles. </li></ol> 5. Laver à l&#39;extérieur des cellules non-adhérentes Remarque: Le but de cette étape est d&#39;éliminer les cellules qui ne sont pas capables de former des contacts étroits avec les surfaces revêtues de ligands. Utiliser une pipette multicanaux pour cette étape afin de faire en sorte que les mêmes forces physiques sont appliqués à tous les puits. Il est important de conserver les puits témoins non lavées indiqués pour aider au calcul du pourcentage de cellules adhérentes. <ol><li> Ajouter 150 ul de solution d&#39;adhérence à chaud chacun des puits. Secouer doucement la plaque pendant quelques secondes avant de retirer le support des puits. Ne pas toucher le fond des puits avec les conseils. </li><li> Répétez cette étape trois fois. Changer le sens de la pipette lors du pipetage du tampon et de sortie. </li></ol> 6. Détermination du pourcentage de cellules adhérentes _content &quot;&gt; Remarque: Dans cette étape d&#39;un lecteur de plaque fluorescente est utilisé pour mesurer l&#39;intensité de fluorescence dans chaque puits L&#39;intensité est en corrélation directe avec le nombre de cellules adhérentes.. <ol><li> Allumez le lecteur de plaque. Ouvrez le logiciel de lecture de plaque en cliquant sur l&#39;icône de raccourci sur le bureau. <ol><li> Dans le menu &quot;Groupe&quot;, cliquez sur &quot;Nouveau&quot; pour créer un nouveau protocole. </li><li> Dans le menu &quot;Actions&quot;, choisissez l&#39;option &quot;Lire&quot;. Cliquez sur &quot;l&#39;intensité fluorescente&quot; et cliquez sur l&#39;onglet &quot;Ok&quot;. </li><li> Du menu déroulant, sélectionnez &quot;onde d&#39;excitation 485» et «longueur d&#39;onde d&#39;émission 528&quot;. Hit l&#39;onglet &quot;Ok&quot;. </li><li> Dans le menu d&#39;option &quot;optique&quot;, sélectionnez &quot;Bas&quot; et cliquez sur l&#39;onglet &quot;Ok&quot;. Retour au menu &quot;Actions&quot; et régler la température à 37 ° C et cliquez sur &quot;Ok&quot;. </li><li> Insérer la microplaque dans le lecteur de plaque etcliquez sur &quot;Exécuter&quot;. Le résultat sera exporté dans Excel feuille de calcul. </li></ol></li><li> Calculer le pourcentage de cellules adhérentes en utilisant la formule suivante: Pourcentage de cellules adhérentes = (intensité de fluorescence moyenne de lire dans les puits lavés) / (intensité de fluorescence moyenne de lire dans les cellules non lavés) x 100%. </li></ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses.">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li><li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse.">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane.">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li><li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion.">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells.">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Il existe plusieurs tests pour étudier les signaux de LFA-1 et l&#39;activation T adhésion cellulaire 12. La cytométrie en flux est utilisée pour mesurer LFA-1 affinité Etats dans les cellules vivantes en utilisant des anticorps monoclonaux qui se lient sélectivement soit plié ou étendu LFA-1. Une des limites de cette méthode est qu&#39;elle ne tient pas compte de l&#39;avidité des intégrines. essais de migration sont des outils utiles, mais ils mesurent la migration, et non adhérence maigre à un...

L&#39;adhérence des lymphocytes T est un processus fondamental dans la réponse immunitaire 1. Il est nécessaire pour l&#39;interaction des lymphocytes T avec les cellules endothéliales décorer les parois capillaires, pour l&#39;antigène des cellules présentatrices de balayage (APC) à l&#39;intérieur des ganglions lymphatiques, et pour la formation de synapses immunologiques (IS) avec des cellules cibles 2. Ces exigences sont fonctionnellement distincte et cinétique. Le processus de lymphocytes extravasation se compose de la chimio-attraction, roulement, adhérence ferme et la transmigration. La transition de roulement pour raffermir l&#39;adhérence des lymphocytes T nécessite de répondre à un signal de récepteur couplé à la protéine G rapidement. Cette réponse donne une interaction ligand des intégrines qui ralentit et arrête la cellule de roulement 3. Un changement immédiat dans avidité intégrine médiatise ce processus. Migration nécessite interactions betweenTcells dynamiques et les cellules endothéliales avec la formation d&#39;adhérences à l&#39;extrémité avant »et la rupture des adhérences à l&#39;extrémité arrière &#39;avec un intervalle d&#39;environ une minute entre la formation et la rupture 4. L&#39;IS forme inminutes, mais doit rester intact pendant des heures 6. Fait intéressant, une molécule d&#39;adhérence, la fonction des lymphocytes membre de la famille des intégrines antigène associé (LFA) - 1, est essentiel pour tous ces processus 5. LFA-1 médie l&#39;adhésion grâce à des interactions avec plusieurs membres de la superfamille des immunoglobulines. Le ligand le plus largement étudié avec la plus forte affinité pour le LFA-1 est la molécule d&#39;adhésion intercellulaire (ICAM) -1. Lymphocytes circulants non activés expriment une faible affinité de LFA-1 sur la surface cellulaire, et par conséquent ne peuvent pas adhérer à des surfaces ICAM-1-enduit. LFA-1, l&#39;affinité est variable et régulée par plusieurs événements de signalisation telles que la protéine G couplée activation du récepteur, la stimulation de cytokines, et des signaux médiés par des récepteurs de cellules T (TCR). L&#39;forme de haute affinité résultant de LFA-1 transmet activation intracellulaire vers l&#39;espace extracellulaire trâce interactions avec ICAM-1. Cette voie est appelée inside-out signalisation 7. De même, la signalisation par LFA-1 de l&#39;espace extracellulaire est appelé en dehors dans la signalisation. Le intracellulaire cascades impliqués dans l&#39;envers et à l&#39;extérieur dans la signalisation de signalisation sont un axe majeur de la recherche actuelle. La petite GTPase Rap1 a récemment émergé comme l&#39;élément clé de l&#39;intérieur-out signalisation qui est commun aux deux ligature TCR et de signalisation 8 cytokine. Le rôle essentiel des Rap1 dans l&#39;activation des intégrines est mis en évidence par la découverte que la surexpression de Rap1 stimule l&#39;adhérence de l&#39;intégrine-dépendant des cellules T, tandis que l&#39;adhésion des cellules T est bloqué par l&#39;expression d&#39;Rap1 dominant négatif 9. Ces avancées dans notre compréhension de la régulation de l&#39;intégrine par Rap1 ont été réalisées en utilisant des outils in vitro. Parmi eux se trouve l&#39;analyse de l&#39;adhérence statique décrit ici. L&#39;objectif global de cette méthode est d&#39;étudier Tcellule adhérence à ICAM-1 des surfaces revêtues. Plus précisément, il est utilisé pour mesurer objectivement et quantifier l&#39;affinité de LFA-1 vers ses homologues de ligands dans les cellules vivantes au temps réel, dans différentes conditions. Cette technique utilise des puits de polystyrène revêtus d&#39;ICAM-1 pour imiter les surfaces cellulaires que les cellules T interagissent avec. De nombreux tests d&#39;adhésion sur les cellules T ont été décrites précédemment statique expérimentalement complexe. Ces dosages souvent requis pour les cellules T à être marquées de façon radioactive, utilisés cellules cornéennes bovines en culture pour créer une matrice extracellulaire comme substrat pour T adhésion cellulaire, ou appelé à la stimulation des cellules T non-physiologique pendant une durée prolongée, de promouvoir T adhésion cellulaire 10. L&#39;utilisation de la mesure fluorométrique pour quantifier les lymphocytes T suite à l&#39;incubation de l&#39;adhérence est une méthode plus sensible et précise de la quantification par rapport à la cytométrie en flux et la microscopie, qui sont utilisés dans de nombreux autres systèmes de dosage 11. En outre, par microscopie de cellule uniqueic analyse de l&#39;intégrine localisation ne permet pas de la large population sur la base de l&#39;analyse de la même manière que la mesure fluorométrique. Alors que l&#39;activation de LFA-1 anticorps spécifiques de l&#39;Etat sont disponibles dans le commerce, ces anticorps offrent une faible sensibilité par rapport à la méthode décrite ici. Le principal avantage par rapport aux techniques alternatives est sa simplicité et la possibilité d&#39;examiner de multiples conditions expérimentales simultanément. Lors de l&#39;examen de cette méthode pour une application spécifique, il faut prendre en compte que les cellules T doivent être sélectionnés négativement, fraîchement isolées, et marqué avec un marqueur fluorescent.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Plate reader</td>
			<td style="width:160px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Synergy H1 Hybrid</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:160px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">21-377-829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">96-well microplate with optical bottom</td>
			<td style="width:160px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:136px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Recombinant ICAM-1</td>
			<td style="width:160px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">ADP4-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Anti-CD3 antibodies</td>
			<td style="width:160px;">Ancell</td>
			<td style="width:136px;">144-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">PMA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">BSA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:136px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">RPMI</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">DPBS containing calcium and magnesium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Peripheral lymphocytes</td>
			<td style="width:160px;">e.g. mouse or human</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Open Gen 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Version 2.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>352099, 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 culture flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-754-1366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RosetteSep T cell enricment kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>15061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes

L&#39;adhérence des lymphocytes T sont nécessaires pour de multiples fonctions de cellules T, y compris la migration vers les sites d&#39;inflammation et la formation de synapses immunologiques avec des cellules présentatrices d&#39;antigène. Les cellules T accomplir adhérence régulée en contrôlant les propriétés adhésives des intégrines, une classe de molécules d&#39;adhésion cellulaire hétérodimères constitués de paires de protéines transmembranaires qui interagissent avec les molécules cibles sur des cellules ou des partenaires de la matrice extracellulaire. L&#39;intégrine la plus importante des cellules T est la fonction lymphocytaire antigène associé (LFA) -1, composé de sous-unités β2 et aL, dont la cible est la molécule d&#39;adhésion intracellulaire (ICAM) -1. La capacité d&#39;une cellule T pour contrôler l&#39;adhérence provient de la capacité à réguler les états d&#39;affinité des intégrines individuelles. Signalisation inside-out décrit le processus par lequel des signaux à l&#39;intérieur d&#39;une cellule provoquent les domaines externes de intégrines à assumer un état activé. Une grande partie de notre connaissance de ces phénomènes complexes est basée sur mécanisteDes études effectuées dans simplifiée dans des systèmes de modèles in vitro. Le test d&#39;adhésion des lymphocytes T décrit ici est un excellent outil qui permet aux cellules T à adhérer à des molécules cibles, dans des conditions statiques, puis utilise un lecteur de plaque fluorescente de quantifier l&#39;adhérence. Ce dosage a été utile dans la définition de l&#39;adhérence des substances stimulant ou inhibiteur qui agissent sur les lymphocytes, ainsi que la caractérisation des événements de signalisation impliquées. Bien que décrit ici pour LFA-1 - ICAM-1 médiée adhérence; ce dosage peut être facilement adapté pour permettre l&#39;étude d&#39;autres interactions adhésives (par exemple, VLA-4 - fibronectine).

Ci-dessous est un exemple d&#39;analyse de l&#39;adhérence en utilisant des cellules T primaires stimulées avec diverses concentrations d&#39;anticorps anti-CD3. Il est utile de connaître la fluorescence des cellules sales (c&#39;est à dire de la charge totale). Cellules non stimulées servent de témoin négatif et les cellules traitées sont des PMA le contrôle positif pour les anticorps anti-CD3. Cellules étalées dans des puits non revêtus servent de contrôle pour ICAM-1. Dans une expérience typiqu...

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Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Analyse de l&#39;adhérence statique est un outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser les interactions entre les lymphocytes T et d&#39;autres types cellulaires. Les interactions sont générées par l&#39;injection de cellules T marquées dans des puits revêtus de molécules d&#39;adhérence, tandis que un lecteur de plaque est utilisée pour quantifier le nombre de cellules adhérentes suivant lavages en série.

Statique Essai d&#39;adhésion pour l&#39;étude de l&#39;intégrine activation dans les lymphocytes T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

static-adhesion-assay-for-study-integrin-activation-t

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Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

15.9K vues.  New York University School of Medicine.  Analyse de l'adhérence statique est un outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser les interactions entre les lymphocytes T et d'autres types cellulaires. Les interactions sont générées par l'injection de cellules T marquées dans des puits revêtus de molécules d'adhérence, tandis que un lecteur de plaque est utilisée pour quantifier le nombre de cellules adhérentes suivant lavages en série. 

Vidéo: Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Méthodes d&#39;évaluation bêta Mediated la mort cellulaire par les lymphocytes T cytotoxiques

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Recherche

Immunologie et infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Test in vitro de l&#39;adhésion bactérienne sur des mammifères cellules épithéliales

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes induites à l&#39;égard des lymphocytes T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

L&#39;isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Human neutrophiles Chambre flux Essai d&#39;adhésion

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Protocole d&#39;isolation efficace pour B et les lymphocytes T à partir des amygdales palatines humaines

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...