This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).

NOTE: Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec la loi allemande et ont été approuvés par les bureaux du gouvernement à Tübingen. 1. Préparation de Micropipettes, Solutions et Membranes <ol><li> Préparation de Micropipettes <ol><li> Tirez micropipettes de verre à l&#39;aide d&#39;un extracteur micropipette avec le programme suivant: chaleur: 540, Pull: 125, vitesse: 20 et Delay: 140. Les montants de longueur d&#39;aiguille à 5,5 cm. </li><li> Aiguilles coniques en utilisant un micromoteur pour obtenir une taille de la pointe appropriée de 4 mm. Conserver les aiguilles dans une boîte ou 15 cm boîte de Petri à éviter d&#39;endommager des conseils. </li></ol></li><li> Préparation des solutions <ol><li> L&#39;ADN plasmidique Solution <ol><li> Préparer l&#39;ADN plasmidique contenant la construction d&#39;ADNc souhaité en utilisant un kit Maxi-prep exempt d&#39;endotoxine selon le protocole du fabricant. </li><li> Ajuster la solution de plasmide d&#39;ADN à une concentration finale de 3 ug / ul (sans vecteur de pointe de la GFP) ou de 4 ug /pi (avec 1 ug de vecteur de pic de la GFP) dans endotoxine tampon Tris-EDTA contenant vert rapide (concentration finale de 0,05%). </li></ol></li><li> Laminine Stock solution <ol><li> Dissoudre 1 mg de laminine dans de l&#39;eau stérile jusqu&#39;à un volume final de 1 ml. Préparer des aliquotes de 100 pi et conserver à -80 ° C. </li></ol></li><li> Poly-L-lysine Stock Solution <ol><li> Dissoudre 50 mg de poly-L-lysine dans 50 ml d&#39;eau stérile à une concentration finale de 1 mg / ml. Préparer aliquotes de 1 ml et en magasin -20 ° C. </li></ol></li><li> Remplissez solution saline équilibrée de Hank (HBSS complet) <ol><li> Préparer HBSS complètes en combinant 100 ml de HBSS 10x, 2,5 ml de tampon HEPES 1 M (pH 7,4), 30 ml de 1 M de D-glucose, 10 ml de 100 mM de CaCl2, 10 ml de 100 mM de MgSO 4, et 4 ml de 1 M de NaHCO 3. Ajouter de l&#39;eau stérile jusqu&#39;à 1 L et conserver à 4 ° C. REMARQUE: Autoclave toutes les solutions attendre tampon HEPES 1 M et 1 M D-glucose, qui sont filter stérilisée. </li></ol></li><li> Slice milieu de culture <ol><li> Préparer un milieu de culture de tranche en ajoutant 35 ml de milieu de base de Eagle, 12,9 ml de HBSS complet (1.2.4), 1,35 ml de 1 M de D-glucose, 250 ul de 200 mM de L-glutamine et 500 ul de pénicilline-streptomycine à obtenir un volume final de 50 ml. Ajouter du sérum de cheval à une concentration finale de 5% et stocker à 4 ° C. </li></ol></li><li> Bas point de fusion (LMP) Agarose <ol><li> Préparer une solution à 4% d&#39;agarose LMP par addition de 2 g d&#39;agarose LMP à 50 ml de HBSS complet (1.2.4), suivi par un chauffage dans un micro-ondes pendant 1 à 2 min à puissance élevée. Conserver cette solution dans un bain d&#39;eau à 37-39 ° C. Conserver la solution à 4 ° C et la réutilisation. </li></ol></li><li> Solution Paraformaldéhyde <ol><li> Dans une hotte préparer une 4% de paraformaldehyde (PFA) solution par addition de 4 g de paraformaldehyde dans 100 ml de 1 x PBS. Chauffer la solution à 60 ° C et ajouter quelques gouttes de NaOH 1 N jusqu&#39;à ce que la solution devienne cLear. </li></ol></li><li> Perméabilisation Solution <ol><li> Dissoudre 9 g de BSA dans 300 ml de PBS 1x contenant 0,3% Triton X-100 et conserver à 4 ° C. Ajouter de l&#39;azide de sodium à 10% pour stockage à long terme. </li></ol></li></ol></li><li> Revêtement de la membrane Inserts <ol><li> Diluer une aliquote de solution laminine de stock (1.2.2) et une aliquote de solution stock poly-L-lysine (1.2.3) dans de l&#39;eau stérile pour un volume final de 12 ml. </li><li> Placez des pièces de membrane en plaques de 6 puits par puits contenant 2 ml d&#39;eau stérile. Ajouter 1 ml de solution de revêtement sur ​​le dessus de la membrane et laisser incuber O / N à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Après incubation laver la membrane insère trois fois avec 1 ml d&#39;eau stérile et sec. Utiliser des inserts de membrane revêtue le même jour ou conserver à 4 ° C pendant jusqu&#39;à quatre semaines dans une plaque à 6 sec. </li></ol></li></ol> 2. ADN injection et l&#39;électroporation d&#39;embryons E15.5 et a 18,5 <ol><li&gt; Anesthetize une fois accouplés souris femelle en le plaçant dans une chambre d&#39;anesthésiant saturé avec 5% d&#39;isoflurane et relié à un évaporateur. Faire circuler l&#39;isoflurane et de l&#39;oxygène à un taux de 1 L / min. Gardez l&#39;animal dans la boîte pour 2-4 min ou jusqu&#39;à ce que l&#39;inconscient qui est testé par pincement entre les pattes de la souris. </li><li> Euthanasier la souris inconsciente par dislocation cervicale au jour embryonnaire (E) 15,5 18,5. Disséquer l&#39;utérus contenant les embryons 13 et le placer dans une boîte de Pétri contenant de 15 à 20 ml de froid HBSS complet. NOTE: A partir de là, de garder les embryons et les tissus sur la glace. </li><li> Utilisez une paire de ciseaux pour séparer chaque embryon de la corne de l&#39;utérus et le lieu dans une seconde boîte de Pétri contenant froide HBSS complet. </li><li> Sous un microscope de dissection, rompre le mur du muscle utérin et le placenta en utilisant une paire de pinces fines (N ° 55) et des ciseaux. Relâcher doucement l&#39;embryon de la vésicule ombilicale. </li><li> Utilisez une paire de ciseaux à Bonn decapitate les embryons juste au-dessus des pattes avant à un angle de 60 °. Si l&#39;expérience nécessite le génotypage des embryons, recueillir un échantillon de tissu pour l&#39;isolement d&#39;ADN génomique (un petit morceau de la queue). </li><li> Transférer la tête pour une boîte de Petri propre et sec. Parce que la tête avait été décapité dans un angle de 60 °, la tête doit se incliner d&#39;un côté lorsqu&#39;il est placé dorsale vers le haut. </li><li> Placer une aiguille avec précaution dans le milieu de l&#39;hémisphère à proximité du bregma (figure 1A, B). Injecter environ 3/2 pl (à 3 ou 4 ug / ul) de solution d&#39;ADN en appuyant sur la pédale de l&#39;Picospritzer III en utilisant 30 livres de pression pour la durée de 10 à 15 ms par impulsion, en appliquant des impulsions 5-8. La durée et le nombre des impulsions est fonction du diamètre de l&#39;ouverture de l&#39;aiguille avec des ouvertures plus petites qui nécessitent plus de temps. L&#39;intervalle entre chaque impulsion se élève à une seconde. </li><li> Avant de placer les électrodes, appliquer quelques gouttes de HBSS complet sur la tête de la Bryo. Placer les électrodes de manière à ce que la borne &quot;négative&quot; est sur ​​le même côté que le ventricule injecté et l&#39;électrode «positive» sur la face opposée du ventricule injecté au-dessous de l&#39;oreille de la tête de l&#39;embryon (figure 1C, D). Appliquer cinq impulsions de 50 V. <ol><li> Utilisez trois électrodes mm pour E 15,5 et 5 électrodes mm E 18,5. </li></ol></li></ol> 3. Dissection du cerveau <ol><li> Après l&#39;électroporation, décoller la peau de la tête à l&#39;aide d&#39;une paire de pinces fines. En utilisant une paire de ciseaux à ressort effectuer une petite incision dans le milieu du cervelet sur la ligne médiane du crâne. </li><li> Insérer les ciseaux à ressort dans l&#39;incision et couper longitudinalement le long de la suture sagittale. Décoller le crâne et le cerveau se détacher du crâne à l&#39;aide de pinces fines. Transférer l&#39;ensemble du cerveau dans 15-20 ml solution froide HBSS complet. </li><li> Pendant ce temps, versez 4% agarose LMP,maintenue à 37-39 ° C dans un bain d&#39;eau, dans un moule de pelage. </li><li> Prenez le cerveau de la HBSS complète par une petite spatule de scoops et drainer l&#39;excès de HBSS en utilisant du papier de soie amende ou Kimwipes. </li><li> Placez l&#39;ensemble du cerveau doucement dans l&#39;agarose et ajuster sa position avec une aiguille fine. Conserver sur de la glace du moule jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est solidifiée et le bloc est sectionné (pour les coupes coronales bulbes olfactifs pointent vers le haut). </li></ol> 4. Vibratome coupe et tranche Culture <ol><li> Couper les blocs d&#39;agarose LMP et les coller sur la platine à l&#39;aide &#39;super glue. Après la colle est sèche transfert la platine sur le plateau de tampon du vibratome et remplir avec de la glace froid HBSS complet jusqu&#39;à ce que le bloc est immergé dans la solution. NOTE: Stériliser toutes les surfaces de l&#39;instrument et l&#39;équipement avec 70% d&#39;éthanol avant la coupe. </li><li> Préparer 250 um sections vibratome épais en utilisant une nouvelle lame comme suit. <ol><li> Coupez le bloc wie les paramètres suivants; fréquence - 60 Hz, amplitude - 0,7 um, la vitesse de 16 à 18 mm / sec. Couper les sections contenant le tissu désiré avec les paramètres ci-dessus à vitesse lente (9 mm / sec). Démarrage du sectionnement du cerveau postérieur, recueillir 5-7 sections de cerveau. </li><li> Transférez les sections à une boîte de culture à 6 puits propre contenant 5 ml de glace froid compléter HBSS avec l&#39;aide d&#39;une spatule coudée et garder sur la glace jusqu&#39;à ce que toutes les sections sont collectées (figure 1E). </li></ol></li><li> Humidifier la membrane d&#39;une manière croisée avec 100 pi de HBSS complet avant de placer les articles sur la membrane, afin de faciliter l&#39;orientation des sections. </li><li> Transférez les sections à l&#39;aide d&#39;une spatule coudée sur la membrane (ramasser un coin de la section avec une pince et tirez sur la spatule et ensuite utiliser la pince pour pousser la section sur la membrane). Placez jusqu&#39;à cinq sections sur une membrane et d&#39;organiser en utilisant une pince (figure 1F). Ne chevauchent pas les uns avec les autres sections. <ol><li> Prenez l&#39;excès de HBSS au large de la membrane à l&#39;aide d&#39;une pipette. Les membranes spécifiques utilisées ici sont fixés à un cadre et insérés dans la plaque de culture de tissu, ce qui permet au tissu d&#39;être en contact mais ne sont pas couverts par le milieu. </li></ol></li><li> Placer les inserts de membrane dans une plaque de 6 puits contenant 1,8 ml de milieu de culture de tranche (1.2.5) (figure 1G, H). Incuber la boîte de culture à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 11 ou 14 DIV DIV. Changer la moitié du milieu (0,9 ml) tous les deux jours. NOTE: A ce stade, ajouter des réactifs comme Bromodeoxyuridine (BrdU; 10 uM concentration finale) pour l&#39;étiquetage des cellules proliférantes aux médias pour les 20 premières heures de la durée de la culture. </li></ol> 5. Fixation des sections Suivi par immunofluorescence <ol><li> Utilisez une lame de scalpel propre et tranchant pour couper et tailler les membranes en fonction de l&#39;orientation deles sections. </li><li> Transférer les sections le long de la membrane à une plaque de 24 puits contenant 1 ml de 4% PFA (1.2.7). Incuber les sections pendant 1 heure à la température ambiante suivie par trois lavages avec 1 x PBS pendant 15 min chacun. Incuber les sections O / N avec une solution de perméabilisation à 4 ° C avec agitation douce. </li><li> Le jour suivant, incuber les sections avec des anticorps primaires appropriées, dilués dans une solution de perméabilisation, O / N ou pendant 48 heures à 4 ° C avec agitation douce. </li><li> Laver les sections 3 fois pendant 15 min avec 1x PBS et incuber O / N à 4 ° C avec les anticorps secondaires appropriées dilué dans une solution de perméabilisation. </li><li> Après l&#39;incubation avec des anticorps secondaires, laver une fois avec les sections 1x PBS pendant 15 min suivi par coloration DAPI pendant 10 min. </li><li> Laver les sections 3 fois avec 1x PBS pendant 15 min chacun et transfert à lames de microscope. Ajouter ImmunoMount et placer délicatement une lamelle sur le dessus des sections. Sécher les lames O / N à 4 ° C et soial vernis à ongles. NOTE: Gardez les diapositives toujours à 4 ° C. <ol><li> Analyser les cultures tranche par microscopie confocale (figure 1I). </li></ol></li></ol>

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	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell+and+fiber+layers+in+the+dentate+gyrus.">Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).</li><li>Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatally+born+granule+cells+numerically+dominate+adult+mice+dentate+gyrus.">Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus.</a> Neuroscience. 148, 593-598 (2007).</li><li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+dentate+gyrus:+what+we+are+learning+from+mouse+mutants.">Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants.</a> Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).</li><li>Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+transcriptional+control+of+adult+neurogenesis.">Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis.</a> Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).</li><li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+dentate+gyrus+morphogenesis.">Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis.</a> Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).</li><li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation.">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li><li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+of+Bcl11b/Ctip2+in+hippocampal+neurogenesis.">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> Embo J. 31, 2922-2936 (2012).</li><li>Pilaz, L. J., Silver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+mitosis+in+the+developing+mouse+embryonic+cortex.">Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation.">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Hand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-62 (2005).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), 19 (2002).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J Vis Exp. (2), (2007).</li><li>Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germinal+matrices+in+the+developing+dentate+gyrus+are+composed+of+neuronal+progenitors+at+distinct+differentiation+stages.">The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages.</a> Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).</li><li>Lechler, T., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmoplakin:+an+unexpected+regulator+of+microtubule+organization+in+the+epidermis.">Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis.</a> J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).</li><li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants:+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development.">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

L&#39;hippocampe joue un rôle important dans l&#39;apprentissage et la mémoire. Le gyrus denté est aussi l&#39;une des deux régions du cerveau où se produit la neurogenèse non seulement au cours du développement, mais aussi à l&#39;âge adulte. Postnatale et adultes produit neurogenèse hippocampique d&#39;une manière similaire impliquant de nombreux facteurs communs. Définir les mécanismes de régulation de ces facteurs sera très utile dans la compréhension des maladies neurodégénératives qui à son tou...

L&#39;hippocampe joue un rôle important dans la mémoire et l&#39;apprentissage ainsi que le comportement émotionnel. Une fonction principale consiste en la consolidation de la mémoire à court terme en mémoire à long terme, qui exige une forte plasticité du système nerveux. Le gyrus denté de l&#39;hippocampe joue le rôle de passerelle principale pour obtenir des informations d&#39;entrée et est également l&#39;une des deux régions du cerveau avec la neurogenèse continue à l&#39;âge adulte 1,2. Le développement de la structure de l&#39;hippocampe se produit à la fin de l&#39;embryogenèse et en particulier pendant la première 3 à 4 semaines après la naissance 3. Au début du développement de la gyrus denté un pool de cellules souches est établi nécessaire pour postnatale ainsi que la neurogenèse adulte 4. Les neurones en développement passent par différentes étapes, à partir de la cellule souche à travers plusieurs stades de cellules progénitrices immatures au neurone et enfin la maturité pendant postnatal ainsi que la neurogenèse adulte. À différentes étapes de la neurogenèse l&#39;expression degènes spécifiques est nécessaire pour permettre la maturation et l&#39;intégration de nouveaux neurones dans les circuits de l&#39;hippocampe 5,6. En utilisant la génétique de souris et analyse phénotypique par immunohistochimie ainsi que des méthodes moléculaires a permis de définir le profil d&#39;expression et la fonction d&#39;un grand nombre de ces gènes. Dans l&#39;analyse des microréseaux d&#39;addition ainsi que immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) fourni des informations sur les gènes cibles potentiels directs et indirects 7,8. Cependant, il ya encore beaucoup de questions ouvertes concernant les mécanismes de régulation de développement de l&#39;hippocampe, en particulier le développement du gyrus denté. Pour mieux comprendre comment les gènes spécifiques sont réglementés un système est nécessaire permettant la manipulation d&#39;un petit nombre de cellules par le bas ou vers le haut-régulation du gène d&#39;intérêt et / ou de ses gènes cibles et suivre leur sort au cours du développement. In utero électroporation des shRNA, ADNc de gènes d&#39;intérêt ou Cre recombinaSE fournit un tel outil. Pour garantir la présence de l&#39;ADN désiré ou petits ARN des plasmides d&#39;expression doit être utilisée pour l&#39;électroporation. Cette approche est mise en œuvre avec succès dans l&#39;étude du développement cortical 9,10, mais est une approche plus difficile l&#39;examen de l&#39;évolution de la gyrus denté en raison de la position des structures de l&#39;hippocampe dans les couches plus profondes du cerveau. Électroporation in utero Ex suivie par la culture organotypique est une approche pour contourner ce problème 11,12. Contrairement à électroporation in utero pas l&#39;embryon entier, mais seule la tête est utilisée permet donc de placer les électrodes d&#39;une manière plus favorable pour diriger le shRNA / ADN vers l&#39;hippocampe et le gyrus denté. Notre groupe a utilisé avec succès l&#39;électroporation ex utero pour étudier le rôle de facteur de transcription Bcl11b cours du développement du gyrus denté 8. Bcl11b a un double rôle dans le développement de gyrus denté par regulating prolifération de cellules souches ainsi que la différenciation comme cela a été démontré par immunohistochimie. Pour définir plus précisément un mécanisme d&#39;engagement Bcl11b dans ces procédés, les protocoles du groupe Polleux 11,12 ont été ajustés pour étudier le gyrus denté comme décrit ci-dessous dans la section de protocole. Dans une première approche de la question a été posée de savoir si Bcl11b réglemente neuronale cellule de la différenciation cellulaire autonome. Une deuxième approche a examiné si Desmoplakine, un gène cible directe de Bcl11b, est suffisante pour sauver le phénotype Bcl11b.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="271">
	<tbody>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:73px;">Company</td>
			<td style="width:63px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Flaming/ Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:73px;">Sutter Instruments Company (USA)</td>
			<td style="width:63px;">P-97</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Fine Glass Pipettes</td>
			<td style="width:73px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:63px;">G100F-4</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Microgrinder</td>
			<td style="width:73px;">Narishige, Japan</td>
			<td style="width:63px;">EG-44</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Anesthetic Bracket unit</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0412</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Halovet Vaporizer</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0398</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Fluovac System</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0387</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">IMS Fluosorber</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0415</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Anesthetizing Chamber</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0460</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Electroporator</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">CUY21 EDIT</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Tweezers with disk electrodes</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">LF650P3</td>
			<td style="width:64px;">3 mm electrodes for E15.5</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Tweezers with disk electrodes</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">LF650P5</td>
			<td style="width:64px;">5 mm electrodes for E18.5</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Picospritzer III</td>
			<td style="width:73px;">Parker Hannifin Corporation</td>
			<td style="width:63px;">P/N 052-0500-900</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:71px;">HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:63px;">920120</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Dissection Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td>
			<td style="width:63px;">Stemi SV8</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Leica</td>
			<td style="width:63px;">Leica DM IL LED</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Leica</td>
			<td style="width:63px;">Sp5II</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:71px;">6 well dish</td>
			<td rowspan="2" style="width:73px;">BD Falcon</td>
			<td rowspan="2" style="width:63px;">#353502</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">6 well dish</td>
			<td style="width:73px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:63px;">#657160</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:73px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:63px;">#353090</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Fast Green</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">F7252</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:71px;">Laminin</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">#L2020</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">#P5899</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:63px;">15003-08</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:63px;">14084-08</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Forceps</td>
			<td style="width:73px;">Dumont #55</td>
			<td style="width:63px;">11255-20 Inox</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">HBSS 10X</td>
			<td style="width:73px;">Life Technology</td>
			<td style="width:63px;">14180-046</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">BME</td>
			<td style="width:73px;">Life Technology</td>
			<td style="width:63px;">41010-26</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

L&#39;ablation du facteur de transcription Bcl11b provoque l&#39;altération de la prolifération de cellules progénitrices et de la différenciation neuronale résultant en une taille de corps godronné et réduit le nombre de cellules. En outre neurones mutants ne parviennent pas à se intégrer dans les circuits de l&#39;hippocampe provoquant apprentissage et troubles de la mémoire 8. Pour répondre aux questions concernant le mécanisme (s) de réglementation des Bcl11b dans ces processus ex utero</...

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Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero L&#39;électroporation et organotypiques Slice culture de souris hippocampe Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

9.4K vues.  University of Ulm. Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

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Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific Cre models, deletion of a protein throughout a tissue or cell population often leads to complex phenotypes resulting from multiple interacting mechanisms. Determining whether a phenotype results from disruption of a cell autonomous mechanism, which is intrinsic to the cell in question, or from a non-cell autonomous mechanism, which would result from impairment of that cell&#8217;s environment, can be difficult to discern. To gain insight into protein function in an in vivo context, in utero electroporation (IUE) enables gene deletion in a small subset of cells within the developing cortex or some other selected brain region. IUE can be used to target specific brain areas, including the dorsal telencephalon, medial telencephalon, hippocampus, or ganglionic eminence. This facilitates observation of the consequences of cell autonomous gene deletion in the context of a healthy environment. The goal of this protocol is to show how IUE can be used to analyze a defect in radial migration in a floxed transgenic mouse line, with an emphasis on distinguishing between the cell autonomous and non-cell autonomous effects of protein deletion. By comparing the phenotype resulting from gene deletion within the entire cortex versus IUE-mediated gene deletion in a limited cell population, greater insight into protein function in brain development can be obtained than by using either technique in isolation.

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

L&#39;induction de la protéine de suppression Grâce<em&gt; In Utero</em&gt; Électroporation à Définir déficits migration neuronale dans des modèles transgéniques

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Recherche

Biologie du développement

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Efficient Gene Transfer dans Chick rétines pour cellulaires primaires études sur la culture: Un<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Approche d&#39;électroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Culture de souris embryonnaires cochléaires explants et Gene Transfer par électroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

Trancher les cultures organotypiques d&#39;études de neurogenèse postnatale

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Culture et co-culture de souris ovaires et follicules ovariens

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

Dissection et préparation de tranches coronales de développer la glande pituitaire souris

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR induite par la perte de fonction dans cervelet granules des cellules utilisant In Utero électroporation basée sur un transfert de gènes

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Méthode de Culture organotypique pour étudier le développement des tissus embryonnaires de poulet

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.