Les auteurs tiennent à remercier Catherine Alford pour des suggestions sur les méthodes de dissociation cellulaire et Kevin Weller, David Flaherty et la Bretagne Matlock pour le soutien à la ressource partagée cytométrie en flux à la Vanderbilt University Medical Center et Melissa A. Musser d&#39;assistance artistique avec des illustrations. Nous remercions les Drs. Jack Mosher et Sean Morrison pour obtenir des conseils sur la mise en œuvre d&#39;isolement des progéniteurs neuronaux. Le flux de ressource partagée MVC cytométrie est pris en charge par le Centre du cancer Vanderbilt Ingram (P30 CA68485) et la Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Ce travail a été soutenu par un financement à partir de US National Institutes of Health des subventions DK064251, DK086594, et DK070219.

1. Préparation des médias (Toutes les étapes de fait dans la hotte de culture tissulaire) <ol><li> Mélanger le suivant: 44 L-15 ml de milieu, 0,5 ml 100X pénicilline / streptomycine (P / S), 0,5 ml à 100 mg / ml de sérumalbumine bovine (BSA), 0,5 ml de HEPES 1M, 5 ml de tissus de qualité de l&#39;eau de la culture. Assurez-vous de mélanger BSA et P / S avant d&#39;ajouter. Ce volume devrait être suffisant pour la dissociation d&#39;un maximum de cinq différents types de tissus. Ce support sera utilisé à l&#39;étape de 3,4 à préparer des solutions de trempe à l&#39;emploi après la dissociation enzymatique du tissu. </li><li> Médias filtrants quoique 0,22 um polyéthersulfone (PES) de filtrage. </li><li> Préparer la solution 1X saline équilibrée de Hank (HBSS) et Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) à partir de stocks 10X en utilisant l&#39;eau de qualité culture tissulaire. Filtrer à travers filtre de 0,22 um PSE. De grandes quantités de ces réactifs peuvent être préparés à l&#39;avance et stocké à 4 ° C, aliquotage petits volumes dans une hotte de culture de tissus en fonction des besoins. </li><li> Remplissez multiples de 15 ml tubes coniques avec 1X, (HBSSnombre de tubes à égaler le nombre de tissus que vous prévoyez sur le sous-dissection) de la tenue des tubes sur la glace. </li></ol> 2. Dissection <ol><li> Euthanasier chronométré souris enceinte en conformité avec des soins aux animaux et les protocoles d&#39;utilisation du comité approuvés et de l&#39;utérus dans un transfert 60 ou 100 mm boîte de Pétri contenant de la glace froide PBS 1X. </li><li> Retirer de l&#39;utérus d&#39;embryons et l&#39;euthanasie par décapitation dans la glace-froid du PBS 1X. Ecran individuellement sous illumination par fluorescence, se divisant en positifs transgéniques et de type sauvage (WT) piscines non transgéniques. Gardez embryons dans la glace-froid tout au long de la dissection du PBS 1X. </li><li> Sous un microscope à dissection, sous-disséquer le tractus urogénital. Maintenez l&#39;embryon en place au niveau des membres antérieurs avec des pinces fines. Retirer les viscères de la foie vers le bas pour le tubercule génital par l&#39;insertion pince au niveau de la membrane puis brusquement tirant les organes internes vers le bas et à l&#39;écart de la paroi dorsale du corps. </li><li> En outre la sous-disséquer le tissu deintérêt loin du tissu environnant (figure 1). Placez chacun individuellement sous-type de tissu disséquée dans un tube de 15 ml conique contenant glacées HBSS 1X. La cagnotte de chaque type de tissu ensemble en fonction de phénotype embryon (c.-à-tout GFP + échantillons de l&#39;intestin du fœtus sont regroupées dans un seul tube de 15 ml conique). </li><li> En parallèle, disséquer les tissus comparables de type sauvage embryons à utiliser pour les contrôles de la rémunération à la cytométrie en flux. </li></ol> 3. La dissociation des tissus Subdissected <ol><li> Pellet sous-disséqué les tissus par centrifugation à 210 de la force centrifuge relative (fcr), 4 ° C pendant 5 min. Après centrifugation, aspirer hors de HBSS autant que possible. </li><li> Reprendre le culot de tissus dans Accumax (Cell Technologies innovantes, Inc), en étant sûr de changer les embouts de pipette entre chaque échantillon afin d&#39;éviter la contamination croisée des types de tissus. Le montant de Accumax ajoutée peut être adapté pour des montants plus ou moins de tissu. Typiquement, pour une-5 Échantillons intestin du fœtus, 1 ml de Accumax serait utilisé, mais les piscines tissus plus, il faudra un plus grand volume pour atteindre la dissociation. </li><li> Placer les tubes dans 37 ° C bain-marie pour 20-45 min en fonction du stade du tissu étant isolé (par exemple 13,5 intestin dpc 20 min, 15,5 intestin dpc 35 min). A mi-chemin si le temps de dissociation, manuellement briser le tissu en frappant le tube contre le côté du bain d&#39;eau (ou toute surface solide) et par &quot;feuilletant&quot; le tube (comme on pouvait secouer un thermomètre à l&#39;ancienne au mercure). A la fin du temps de dissociation répéter le shake down procédure plusieurs fois pour mieux dissocier l&#39;échantillon. Pour les échantillons les plus fragiles, de réduire la vigueur de la secousse vers le bas et au lieu d&#39;utiliser la pipette pendant l&#39;étape de trituration de 3,5 à atteindre un niveau approprié de la dissociation. Typiques fois de dissociation pour 14,5 et 15,5 jpc jpc LUT sont de 35 et 45 min, respectivement. </li><li> Alors que le tissu est en incubation dans Accumax, maquillage trempe de sortelutions, appelé trempe et trempe 1:5. Trempe est effectuée en ajoutant 45 pl 5 mg / ml à la DNase I 6 ml de L-15 médias. Quench 1:5 est fait en ajoutant 45 pl 5 mg / ml DNase I à 30 ml L-15 avec les médias. </li><li> À la fin de la dissociation, déplacez tubes de 15 ml sur de la glace et ajouter immédiatement une Quench ml dans chaque tube. Triturer chaque échantillon de haut en bas jusqu&#39;à ce tissu est presque complètement dissocié (figure 2). Il y aura toujours quelques petits morceaux de tissu présent dans la solution. La réalisation d&#39;un échantillon complètement homogène n&#39;est ni facilement réalisable, ni souhaitable car elle peut entraîner de la viabilité cellulaire pauvres. </li><li> Gardez l&#39;échantillon sur la glace autant que possible pour le reste du protocole. Veillez à utiliser un embout de pipette frais quand la pipette ou Quench Quench 1:5 à éviter la contamination croisée des échantillons. </li></ol> 4. Filtrage de suspension cellulaire <ol><li> En utilisant des pinces qui ont été trempés dans de l&#39;éthanol 70%, placer un 3 cm carrés de 38 mailles membrane en nylon (um Sefar Amérique) au cours de labouche d&#39;une nouvelle 15 ml tube conique. Filtrer à travers les cellules de maille par pipetage dans le centre de la membrane en utilisant étroites conseils de forage. Si la membrane est saturée en filtrant, l&#39;enlever, sécher l&#39;embouchure du tube avec un Kimwipe, et utiliser une nouvelle pièce de maille en nylon pour filtrer le reste de la suspension cellulaire. Une fois que toutes les cellules ont été filtrées, utilisez 1 ml Quench 1:5 à rincer le tube et de filtrer toutes les cellules restantes. </li><li> Lorsque le filtrage est terminée, ou lors du remplacement d&#39;une membrane est bouché, utilisez une pince à retrousser les côtés de la maille et essuyer la membrane sur le dessus du tube pour éliminer les gouttelettes suspendues de cellules. </li><li> Suspension de cellules par centrifugation à 210rcf, 4 ° C pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml Quench 1:5. </li><li> Suspension cellulaire Filtrer à travers maille de nylon en 5 tubes de polystyrène ml. Laver tube de 15 ml avec 1 ml Quench 1:5 et filtre pour capturer toutes les cellules restantes. </li></ol> 5. Préparation d&#39;échantillons pour FACS <ol&gt; <li> Si vous utilisez le même tissu pour le tri et pour les contrôles de compensation, de transférer 1/10 e à 1/20 ème du volume d&#39;échantillon à un nouveau 5 ml tube en polystyrène à utiliser pour les contrôles de compensation. Divisez l&#39;échantillon de tissu de type sauvage en deux parties. Une partie sera souillé de type sauvage (WT uniquement) tandis que le second semestre aura 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, un agent intercalant fluorescent exclus à partir de cellules vivantes utilisées en tant que &quot;la viabilité tache&quot;) ajoutée à l&#39;(7-AAD seulement ). Ces contrôles individuels sont nécessaires pour permettre la compensation de tout chevauchement spectral entre l&#39;émission de fluorophores discrets au trieur de flux. Par exemple, pour un seul journaliste fluorescent comme la EGFP, les contrôles nécessaires seraient les suivantes: EGFP seule, non colorées cellules WT, et un tube coloré avec 7-AAD seulement (Figure 3). </li><li> Remplissez tous les tubes de 5 ml contenant la suspension cellulaire avec Quench 1:5 et centrifuger à 210rcf, 4 ° C pendant 5 min. Aspirer le surnageant, en laissant environ 200 pi de liquidedans le tube. </li><li> Diluer 7-AAD 1:1000 dans Quench 1:5. Ajouter dilution coloration 7-AAD à 7-AAD commande de compensation et ne échantillons à trier. Ne pas ajouter de 7-AAD à l&#39;EGFP seul ou WT contrôle de la rémunération seulement. Volume de la 7-AAD doit être ajoutée varie en fonction de la quantité de matériau de départ et la taille de culot cellulaire obtenu. Une fois 7-DAA ont été ajoutées dans des tubes appropriés, des échantillons sont prêts à être triés. <table border="1"><tbody><tr><td> Tissu </td><td> Taille de la piscine échantillon </td><td> Volume 7-AAD doit être ajouté à * tube de </td></tr><tr><td> 15,5 Intestin dpc </td><td> 1-5 </td><td> 200 pi </td></tr><tr><td> 15,5 dpc LUT </td><td> 1-5 </td><td> 150 pi </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Montant de 7-DAA ajouté à dissocie tissus différents * la quantité totale finale dans chaque tube varie par une quantité allant de 50 à 100 pl depuis l&#39;aspiration de support est unn processus approximatif et réalisé pour éviter la boulette. Derniers volumes ne sont pas mesurées de manière à minimiser la manipulation de cellules dans la solution. </li><li> Préparer les tubes de prélèvement à capturer les cellules pour l&#39;isolement d&#39;ARN en ajoutant 0,75 ml TRIzol-LS à 1,5 ml microtubes. </li><li> Si la collecte de cellules pour la culture in vitro, plutôt que d&#39;isolement d&#39;ARN, les cellules de tri directement dans l&#39;auto-renouvellement des médias dans 6 des plaques de culture de tissus, enduits avec de la fibronectine et rempli avec les médias, comme décrit précédemment. 2,6,7 </li></ol> 6. Cytométrie en flux <ol><li> Au cytomètre de flux, d&#39;évaluer la rémunération premiers contrôles, en étant sûr de revenir rincer entre chaque échantillon afin d&#39;éviter la contamination. Utilisez les profils des échantillons de compensation pour régler les tensions et portails pour le tri. Notez que si des cellules positives dans le tissu désiré sont présents en nombre limitant, un tissu distinct peut être utilisé pour établir les paramètres de compensation aussi longtemps que l&#39;intensité de fluorescence et de la taille des cellulesentre des échantillons sont comparables. </li><li> Définissez les paramètres d&#39;indemnisation et les portes pour éviter les cellules mortes qui prennent 7-AAD colorant et de recueillir des cellules présentant à haute intensité de fluorescence de la GFP par rapport aux témoins non colorées (Figure 4). </li><li> Trier maximum 25 000 cellules dans chaque microtube. Le tri doit être effectué à la plus basse pression possible avec une buse large alésage et le taux de faible débit (par exemple, 17psi, 100 buses um, 3000 événements par seconde) afin de préserver la viabilité progéniteur neuronal. Pour sortes d&#39;isoler des cellules EGFP + de nous effectuons nos isolements sur un FACSAriaII BD Biosciences en utilisant un laser 488nm 20mW pour exciter le rapporteur de l&#39;EGFP. </li><li> Si les échantillons contiennent des concentrations cellulaires élevées, il est conseillé de diluer la suspension cellulaire en outre l&#39;utilisation 1:1000 7-AAD tache de réaliser des économies de capture plus élevés lors du tri. </li><li> Vortex chaque tube de cellules capturées dans TRIzol-LS immédiatement après le tri. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Tissus de dissociation pour produire un suspensions cellulaires pour le tri de flux est un équilibre délicat entre la digestion enzymatique adéquat et éviter la sur-digestion qui peut entraîner des viabilités cellulaires faibles. Un exemple de niveau souhaité de tissus de dissociation est représenté sur la figure 2. Dans le tissu de façon appropriée avant digéré pièces de trituration manuelle des organes sous-disséqués sont encore clairement (Figure 2b, 2f). Dans les tissus qui sont enzymatiquement traités pendant une trop longue période de temps ou à une concentration trop élevée de l&#39;enzyme, la suspension résultante manque tous les morceaux résiduels grandes de tissus (figure 2d, 2h). Appropriée dissociation et filtrage manuel de produire des profils de tri à la cytométrie en flux qui présentent généralement supérieure à 90% de cellules viables et présentent des niveaux élevés d&#39;expression de l&#39;EGFP (Figure 4). Les populations cellulaires obtenues par cette méthode illustrent bienla viabilité et peuvent être capturés pour la culture subséquente ou d&#39;analyse de l&#39;expression génique par déclenchement pour la capture de l&#39;EGFP + progéniteurs neuronaux. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig1.jpg" /> Figure 1. Répartition des TH-EGFP + neuronales progéniteurs dans LUT fœtus de souris. Tout le montage du tractus urogénital à 15,5 dpc vu ventralement sous un éclairage sur fond clair (a) par rapport à la distribution de cellules marquées par + EGFP TH-EGFP l&#39;expression du transgène identifié sous un éclairage par fluorescence (b). TH-EGFP expression est présent dans les glandes surrénales (a) et les ganglions coeliaque dedans situé (cg). Latérale (c) vue de 15,5 DPC TH-EGFP sous-disséqués expositions de la vessie à partir de l&#39;expression du transgène de fluorescence dans les ganglions pelviens (pg), la paroi de la vessie (bla) et de l&#39;urètre (u). En vue dorsale (d) EGFP + cellules sont évidents dans l&#39;urètre antérieur dorsal. D&#39;autres labels: reins (k), les testicules (t), de la vessie (bla) et des organes génitaux tubercule (GT). <imgalt = &quot;Figure 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4188/4188fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. Images en fond clair de 15 dpc LUT foetal (a) et de l&#39;intestin (e), respectivement, imagée moitié de la période d&#39;incubation de dissociation, à la fin de l&#39;incubation de dissociation avant rupture (b, f), après rupture manuelle (c, g), et dans un échantillon qui a été excessivement dissocié (d, h). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig3.jpg" /> Figure 3. Schéma illustre la rémunération contrôle nécessaires pour établir les paramètres FACS rigoureuses de déclenchement. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;image représentant des profils de tri de flux à 14,5 dpc (a) et 15,5 jpc (b). Population noir est constitué de cellules uniques sur la base de diffusion vers l&#39;avant et le côté qui sont morts et étiqueté par7-DAA fluorescence. Population de gris est constitué de cellules sur la base de singulets diffusion vers l&#39;avant et le côté qui ont exclus 7-DAA et sont donc viables. Population vert fermée est indiquée par boîte &quot;GFP +&quot; zone et est constitué de cellules uniques que sont exclus 7-DAA (viables) et présentent de fluorescence EGFP.

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	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Lignes journaliste de souris exprimant journalistes fluorescentes sont de plus en largement disponibles grâce à des efforts multiples dans le milieu de la génétique murine 1,8,9. En conséquence, la méthode de la dissociation illustré ici peut être largement appliquée pour l&#39;isolement de sous-types neuronaux distincts basés sur les profils d&#39;expression des neurotransmetteurs ou des récepteurs de tissus fœtaux soit ou adulte. Alors que nous avons optimisé cette méthode basée sur l&#39;exp...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom réactif </td><td> Vendeur </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (fab: Technologies des piles innovantes) </td><td> A7089-100ML </td><td> Conserver congelé en aliquots de 1 ml </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D-4527 </td><td> Congelés à -20 ° C à 5 mg / ml dans 1xHBSS, (Utilisé dans Quench, Quench 1:5) </td></tr><tr><td> 10X PBS pH 7,4 </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> Compléter à 1x avec de l&#39;eau de qualité culture tissulaire, puis filtre stérile </td></tr><tr><td> 10X HBSS w / o Ca ou Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> Compléter à 1x avec de l&#39;eau de qualité culture tissulaire, puis filtre stérile </td></tr><tr><td> Leibovitz milieu L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine 100X </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> Magasin aliquotés à -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-100G </td><td> Stockez aliquotés à -20 ° C, 100 mg / ml dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M HEPES à 0,85% de NaCl </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 um NITEX Membrane Nylon Mesh </td><td> Sefar Amérique </td><td> 3-38/22 </td><td> Coupez-les en carrés ~ 3 cm. UV traiter toute la nuit pour stériliser dans la hotte de culture tissulaire. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 tubes en polystyrène ml </td><td> Faucon </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubes coniques </td><td> Corning </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> Beaux-Pince à dissection </td><td> Instruments belle science </td><td> 11251-30 </td><td> Dumont # 5 forcep, Dumoxel, la norme pointe 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Dissection Spoon </td><td> Instruments belle science </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

Au cours du développement de la crête neurale (NC) dérivés de progéniteurs neuronaux migrer loin du tube neural pour former ganglions autonomes dans les organes viscéraux comme l&#39;intestin et du tractus urinaire inférieur. Les deux cours du développement et dans les tissus matures ces cellules sont souvent très dispersés à travers les tissus de telle sorte que l&#39;isolement des populations discrètes en utilisant des méthodes comme la capture laser micro-dissection est difficile. Ils peuvent cependant être directement visualisée par l&#39;expression de journalistes fluorescentes chassés de régions régulatrices de gènes spécifiques des neurones comme la tyrosine hydroxylase (TH). Nous décrivons une méthode optimisée pour des rendements élevés de TH viable + de progéniteurs neuronaux à partir de tissus fœtaux de souris viscérales, y compris l&#39;intestin et inférieure du tractus urogénital (LUT), fondée sur la dissociation et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Le gène codant pour la Th enzyme limitante pour la production de catécholamines. Entériques progéniteurs neuronaux commencent à exprimer TH durIng leur migration dans l&#39;intestin du fœtus 1 et TH est également présent dans un sous-ensemble de neurones des ganglions pelviens adultes 2-4. La première apparition de cette lignée et la distribution de ces neurones dans d&#39;autres aspects de la LUT, et leur isolement n&#39;a pas été décrite. Progéniteurs neuronaux exprimant TH peut être facilement visualisées par l&#39;expression de l&#39;EGFP dans des souris porteuses du transgène construction Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Nous imagée expression de ce transgène dans des souris fœtales afin de documenter la distribution de TH + cellules dans la LUT développer à 15,5 coït jours après (DPC), désignant le matin de la détection prise de 0,5 jpc, et a observé que un sous-ensemble des progéniteurs neuronaux dans la coalescence pelvienne ganglions expresse EGFP. Pour isoler TH + LUT progéniteurs neuronaux, nous avons optimisé les méthodes qui ont été initialement utilisés pour purifier les cellules souches neurales de crête de l&#39;intestin de souris fœtale 2-6. Efforts antérieurs visant à isoler NC dérivés populations invoquésdigestion avec un cocktail de collagénase et de la trypsine pour obtenir des suspensions cellulaires pour la cytométrie en flux. Dans nos mains ces méthodes ont produit des suspensions cellulaires de la LUT avec la viabilité relativement faible. Compte tenu de l&#39;incidence déjà faible de progéniteurs neuronaux dans les tissus fœtaux LUT, nous avons décidé d&#39;optimiser les méthodes de dissociation de telle sorte que la survie des cellules dans les dissocie finales serait augmenté. Nous avons déterminé que douce dissociation dans Accumax (Cell Technologies innovantes, Inc), filtrage manuel, et le débit de tri à de faibles pressions nous ont permis d&#39;atteindre la survie constamment supérieur (&gt; 70% des cellules totales) avec des rendements ultérieurs de progéniteurs neuronaux suffisants pour l&#39;analyse en aval. La méthode que nous décrivons peut être largement appliquée à isoler une variété de populations neuronales foetales à partir soit ou adulte tissus murins.

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An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Une procédure optimisée pour purifier la crête neurale-dérivés progéniteurs neuronaux à partir de tissus fœtaux de souris est décrite. Cette méthode tire parti d&#39;expression parmi les allèles rapporteurs fluorescents d&#39;isoler des populations distinctes par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). La technique peut être appliquée pour isoler les sous-populations neuronales au cours du développement ou de tissus adultes.

Une procédure optimisée pour Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) Isolement du système nerveux autonome progéniteurs neuronaux de viscères de souris sur le fœtus

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

an-optimized-procedure-for-fluorescence-activated-cell-sorting-facs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

13.6K vues.  Vanderbilt University School of Medicine. Une procédure optimisée pour purifier la crête neurale-dérivés progéniteurs neuronaux à partir de tissus fœtaux de souris est décrite. Cette méthode tire parti d'expression parmi les allèles rapporteurs fluorescents d'isoler des populations distinctes par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). La technique peut être appliquée pour isoler les sous-populations neuronales au cours du développement ou de tissus adultes.

Vidéo: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Génération de cellules souches neurales à partir de tissus humains mis au rebut corticale fœtale

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

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Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Un test migration cellulaire quantitative pour murins de neurones entériques progéniteurs

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Une souris, deux cultures: Isolement et culture des cellules souches adultes de neurones à partir des deux Neurogenic Zones de souris individuelle

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Tri cellulaire des neurones cellules souches et progénitrices de la souris adulte-ventriculaire Zone et Live-imagerie de la dynamique de leur cycle cellulaire

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) et Gene Expression Analyse de Fos exprimant Neurones de frais et de tissus congelés cerveau de rat

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Culture de cellules primaires de neurones GABAergiques ou glutamatergiques purifiés établis par tri cellulaire activé par fluorescence

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats

The bilateral major pelvic ganglia (MPG; synonym, pelvic ganglia) are the primary source of postganglionic sympathetic and parasympathetic neurons innervating pelvic organs of rodents; the functionally equivalent structure in humans is the inferior hypogastric plexus. The major pelvic ganglia also provide the route by which lumbar and sacral sensory axons reach the pelvic organs. These complex, mixed ganglia can prove challenging to identify and dissect for further experimental study of normal autonomic mechanisms or to establish preclinical models of disease, injury or visceral pain. Here we describe a protocol to access and visualize these ganglia and their associated nerve tracts. We provide this protocol with schematics for both male and female rats, as the ganglion size and landmarks for identification differ between sexes. The protocol describes removal of the ganglion for in vitro studies, but this method can be integrated into a surgical recovery protocol for experimental interventions (e.g., nerve crush, nerve resection) or for mapping neuronal circuits (e.g., by microinjection of neural tracers). We also demonstrate the primary structures of the ganglion and its associated nerves immediately following dissection and following immunohistochemical staining.

The major pelvic ganglia contain parasympathetic and sympathetic neurons that innervate pelvic organs. Here we describe a dissection method and provide schematics for identification of these ganglia and their associated nerves. These methods can be applied to experimental manipulation of these ganglia in vivo or removal post-mortem for further study.