Ce protocole décrit une méthode pour l’isolement simultané de cellules fibro-adipogènes, progénitrices et souches musculaires à l’aide d’activateurs de fluorescence de tri. Les populations pures de ces cellules sont une condition préalable à la compréhension de leur rôle biologique dans des conditions physiologiques et pathologiques. En utilisant cette technique, Forbes et les cellules souches musculaires ont été identifiées et isolées de l’aisselle ou du muscle blessé.
L’impunité élevée de Forbes et des cellules souches musculaires nous a permis d’utiliser ces cellules pour différentes techniques en aval telles que la greffe de saccharine et l’analyse du mélange mudial. Pour commencer, placez la souris euthanasiée sur le dos sur un tampon de dissection et vaporisez-la avec de l’éthanol à 70% Pour éviter la contamination, utilisez des pinces pour pincer le centre de la peau du ventre de la souris et couper environ un centimètre d’ouverture horizontalement. Saisissez les bords de la plaie et le disque dans la souris en tirant l’ouverture dans les directions opposées pour découvrir les muscles en dessous, exposer un côté du membre postérieur à la fois.
Avant de collecter des muscles, enlever la graisse intermusculaire entre les ischio-jambiers à l’extrémité proximale des quadriceps pour améliorer l’isolement des cellules progénitrices fibro adipogènes et des cellules souches musculaires. Ensuite, sans endommager le tissu, utilisez des pinces tranchantes pour casser et décoller le fascia afin d’exposer le tibial antérieur ou TA et extenseur digitorum longus ou EDL muscles. Passez l’extrémité pointue de la pince sous les muscles TA EDL pour détacher les muscles du tibia.
Coupez les tendons, attachez le TA EDL à la cheville et, tout en le tenant avec une pince, coupez les muscles avec des ciseaux le long de la ligne longitudinale du TA EDL. Coupez les tendons autour du genou pour détacher tous les muscles TA EDL. Placez les muscles dans un plat de six centimètres maintenu sur de la glace.
Pour isoler les muscles gastrocnémiens, coupez tous les tendons de la cheville et détachez les muscles du tibia et du péroné. Couper autour du genou et transférer les muscles dans le plat. Décollez le fascia autour du quadriceps et séparez-le du fémur en passant l’extrémité pointue de la pince entre le muscle et l’os.
Coupez les tendons autour du genou et coupez le reste du muscle en coupant le long du fémur tout en tenant les quadriceps avec une pince à l’extrémité distale. Placez les muscles dans le plat de six centimètres. Détachez les ischio-jambiers et les muscles restants autour du fémur et transférez-les dans le plat.
Rassemblez les muscles des membres postérieurs dans un plat conservé sur de la glace. Aspirer le produit de lavage du plat et ajouter un à deux millilitres de tampon de dissociation musculaire pour garder les muscles humides. Ensuite, émincez soigneusement les muscles Utilisez un scalpel pour déchirer et trancher le muscle, puis utilisez des ciseaux pour continuer à couper le muscle en petits morceaux pendant une à deux minutes jusqu’à obtenir une pâte de boue de tissu bien haché.
Transférez ensuite les muscles émincés dans le tube conique contenant le tampon de dissociation musculaire. Scellez les tubes avec un film de laboratoire et incuber dans un bain-marie de 37 degrés Celsius en agitant pendant une heure. Après une heure, retirez le tube du shaker et remplissez-le à 50 millilitres Avec un produit de lavage, retournez doucement le tube deux fois pour assurer le mélange.
Centrifuger les cellules dans un rotor à godet oscillant à 250 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférez 42 millilitres de surnageant dans deux nouveaux tubes et laissez huit millilitres dans le tube d’origine. Remplissez les nouveaux tubes contenant 21 millilitres du surnageant jusqu’à 50 millilitres avec un produit de lavage.
Ensuite, centrifugez les cellules à 350 fois G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez le surnageant et gardez les granulés sur la glace. Ensuite, ajoutez un millilitre de collagénases, deux bouillons et un millilitre de stock à base de dis dans le tube d’origine contenant huit millilitres de tampon de dissociation musculaire.
À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, remettez la pastille en suspension 10 fois sans colmatage. Éjectez la solution vers la paroi du tube, en évitant la formation de bulles. Scellez les tubes avec un film de laboratoire et incuber dans un bain-marie de 37 degrés Celsius en agitant pendant 30 minutes.
Après 30 minutes, retirez le tube de l’aspiration de l’agitateur et éjectez la suspension musculaire 10 fois à travers une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 20, remplissez chaque tube jusqu’à 50 millilitres avec du produit de lavage et inversez le tube. Ensuite, centrifuger à 250 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Laissant huit millilitres dans le tube d’origine.
Remplissez le nouveau tube jusqu’à 50 millilitres avec du produit de lavage, centrifugez à nouveau les cellules à 350 fois G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et gardez le granulé sur de la glace. Placez une crépine à cellules en nylon de 40 microns dans le tube conique original de 50 millilitres contenant huit millilitres de produit de lavage et prémouillez la crépine avec un à deux millilitres de produit de lavage.
Tout en tenant la passoire, utilisez une pipette de 10 millilitres pour remettre délicatement la pastille en suspension. Filtrez la suspension à travers la crépine cellulaire dans le même tube pour minimiser la perte de cellule. Filtrer les autres granulés du tube dans le tube d’origine en ajoutant quatre à cinq millilitres de produit de lavage à chaque tube pour remettre les granulés en suspension et transférer la solution dans la crépine automatique positionnée dans le tube d’origine.
Après avoir recueilli toutes les granulés dans le tube de 50 millilitres d’origine, rincez la crépine avec quatre à cinq millilitres de liquide de lavage. Utilisez une pipette de 1000 microlitres pour recueillir tout le liquide de la face inférieure de la crépine automatique. Remplissez chaque tube avec un produit de lavage jusqu’à 50 millilitres et inversez le tube.
Centrifuger le tube à 250 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez immédiatement le surnageant sans déranger le granulé et remettez le granulé en suspension dans 600 microlitres de produit de lavage. Transférer la suspension dans un tube microcentrifuge de deux millilitres.
Ajouter des anticorps CD 31 APC CD 45 APC SCA un VCAM bleu Pacifique une biotine et alpha sept intégrine PE dans un tube de deux millimètres contenant une suspension cellulaire. Mélangez délicatement et incuber les cellules dans un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes en les protégeant de la lumière. Après l’incubation, remplir tous les tubes jusqu’à deux millilitres avec du produit de lavage et centrifuger à 250 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 300 microlitres de produit de lavage. Ensuite, ajoutez des anticorps contre la streptavidine dans des tubes et incuber les cellules dans un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Après incubation, remplir les tubes contenant des anticorps anti-streptavidine à deux millilitres avec un produit de lavage.
Ensuite, centrifuger les tubes et aspirer complètement le surnageant. Après le deuxième lavage, remettez les cellules en suspension dans le tube expérimental dans 500 microlitres de produit de lavage. Pré-mouiller un capuchon de crépine cellulaire d’un tube à fond rond en polystyrène de cinq millilitres avec 200 microlitres de produit de lavage.
Transférez la suspension cellulaire du tube expérimental dans le tube inférieur rond en polystyrène de cinq millilitres et laissez-la filtrer par gravité. Imprimez le tube de deux millilitres contenant la suspension expérimentale de l’échantillon avec 300 microlitres de produit de lavage et passez-le à travers le même bouchon de crépine. Utilisez une pipette de 200 microlitres pour recueillir tout le liquide de la face inférieure de la crépine cellulaire.
Scellez avec un bouchon, laissez les tubes sur la glace et protégez-les de la lumière. La stratégie de gating adoptée pour l’isolement des cellules souches fibro-adipogéniques et musculaires est présentée ici. Le knock GFR alpha E G F P chez les souris rapporteures exprime le gène de fusion H deux B E G F P du locus alpha endogène G FFR, permettant un marquage efficace et spécifique de la lignée G GFR alpha.
La pureté des populations cellulaires isolées a été confirmée par immuno-coloration de cellules fibro-adipogéniques GFP positives en co-culture et de cellules souches musculaires avec des anticorps PAC-sept. Le progéniteur fibro adipogène GFP positif n’a pas exprimé le marqueur PAC-sept, tandis que les cellules souches musculaires ont réagi avec cet anticorps. Toutes les cellules exprimant la GFP étaient positives pour le SCA un et négatives pour la CD 31, la CD 45 VCAM un et l’alpha sept intégrine.
Le progéniteur fibro adipogénique et les cellules souches musculaires isolées de souris blessées par des injections intramusculaires sans toxine sept jours après la blessure sont montrés. Comme les cellules souches musculaires sont activées une augmentation de la taille cellulaire. Il est important d’ajuster les paramètres F SCA et SS CA et d’élargir la porte pour inclure ces cellules au centre.
La quantification des cellules souches progénitrices fibro-adipogéniques et musculaires dans les muscles TA non blessés et sept jours après la blessure est présentée ici. Bien que le pic et la prolifération aient été observés entre les deuxième et troisième jours, un faible taux de prolifération des cellules était encore appréciable sept jours après la blessure. Effectuer un hachage musculaire approprié est d’une importance cruciale pour libérer une seule cellule.
De plus, l’isolement des cellules mononucléotidiques est obtenu en faisant passer la suspension sur une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 20. Cette technique aidera les scientifiques à étudier le profil transcriptionnel et épigénomique biologique de Forbes et des cellules souches musculaires en condition normale et pendant les stades plus profonds de la régénération musculaire.
