Cette recherche est financée par l&#39;AACR Henry Shepard vessie Cancer Research Grant (09-60-30-LI).

Procédures portant sur des sujets animaux ont été approuvés par le soin des animaux et le Comité institutionnel d&#39;utilisation (IACUC) à l&#39;Université de Californie, San Francisco. 1. Préparation des cellules <ol><li> La ligne de cellules humaines de cancer de la vessie KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) est cultivé dans un milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% sérum de veau foetal et 50 pg / ml de gentamicine. </li><li> Les cultures sont maintenues à 37 ° C, 5% de CO 2 avec les médias change tous les deux à trois jours. </li><li> Les cellules ont été récoltées par digestion à la trypsine et comptées à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. Une suspension cellulaire unique de 2 x 10 6 cellules dans 50 l a été préparé dans une solution saline tamponnée au phosphate et maintenu sur la glace. </li></ol> 2. Orthotopique Modèle tumeur de la vessie <ol><li> Femme nue (nu / nu) chez la souris âgées de 8-10 semaines (Simonsen Laboratoire, Gilory, CA) ont été utilisés. </li><li> Placez un champ stérile sur un coussin chauffant pour servir unsa plate-forme chirurgicale. Lubrifiante stérile gelée, 24-linguistiques cathéters avec des aiguilles stylet, la solution de nitrate d&#39;argent et de l&#39;eau stérile sont préparées. </li><li> L&#39;anesthésie générale est induite chez les souris avec de l&#39;isoflurane en inhalation (3% pour l&#39;induction, 1-2% pour la maintenance) et maintenu par l&#39;intermédiaire d&#39;ogive. Pommade ophtalmique stérile est appliquée pour les yeux de l&#39;animal, et un tampon de chaleur est utilisé pour maintenir la chaleur du corps. </li><li> Placez la souris en position couchée. </li><li> Saisissez délicatement la vulve de l&#39;animal avec des pinces pour la stabilisation. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un cathéter 24-gue par voie intraveineuse avec le stylet aiguille enlevée, l&#39;urètre de la souris est un cathéter. Ample lubrification doit être utilisé. Avec le dos de la souris, l&#39;urètre est situé immédiatement postérieure aux plis de la vulve et du vagin antérieures. Un angle de 45 degrés est d&#39;abord prises pour cathétériser l&#39;urètre et de passer sous l&#39;os pubien. Un angle plus faible profondeur est ensuite prise de passer à travers l&#39;urètre dans la vessie. Doux pression pelvienneAssurez-vous de redresser l&#39;urètre peut souvent aider. Des précautions doivent être prises pour éviter de pousser trop fort contre la résistance, car cela peut conduire à la perforation urétrale ou de la vessie. Urine vu l&#39;intérieur du cathéter confirme sa position dans la lumière de la vessie. </li><li> Aspirer l&#39;urine de la lumière du cathéter et de la vessie à l&#39;aide de l&#39;aiguille de stylet. L&#39;aiguille stylet est utilisé pour toutes les aspirations et les injections suivantes, en laissant le cathéter en place. Ceci permet l&#39;injection de volumes précis en éliminant l&#39;espace mort dans le cathéter-, et il est cathétérismes répétées inutiles. </li><li> Pour nuire à la couche de glycosaminoglycane de l&#39;urothélium de la vessie, 10 uL de 0,5 M de nitrate d&#39;argent est injecté et a permis d&#39;habiter pendant 10 secondes. Cela peut former un précipité blanc avec de l&#39;urine restant. </li><li> Aspirer et jeter le contenu précipiter et de la vessie à l&#39;aide d&#39;une aiguille stylet. </li><li> Laver la vessie par injection de 100 pi d&#39;eau stérile. Aspirer et jeter l&#39;eau. Repeà laver à l&#39;eau stérile 3 fois pour un total de 4 lavages. </li><li> Placez une cravate de soie 4-0 autour du méat urétral pour occlure l&#39;urètre en préparation pour le retrait du cathéter. </li><li> Injecter préalablement préparée 2 x 10 6 KU-7-luc2-GFP cellules dans 50 pL à l&#39;aide de l&#39;aiguille de stylet. </li><li> Enlever simultanément le cathéter et l&#39;aiguille de stylet, laissant l&#39;urètre occlus par la cravate en soie. </li><li> La souris sera maintenu sous anesthésie générale pendant 2 heures avant la cravate en soie est retiré et l&#39;animal est éveillé. </li></ol> 3. Ultrason <ol><li> L&#39;anesthésie générale est induite par l&#39;isoflurane vaporisé et maintenus par cône de nez. </li><li> Un VisualSonics Vevo 770 In Vivo à haute résolution de micro-système d&#39;imagerie (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Canada) avec la sonde RMV-704 40 MHz a été utilisé. </li><li> Placez la souris en position couchée sur la plate-forme ultra-sons. </li><li> Fixez pattes postérieures de l&#39;animalavec du ruban adhésif afin d&#39;éviter un mouvement excessif lors de la manipulation de la sonde d&#39;échographie. </li><li> Appliquer le gel des ultrasons pour le bassin de la souris. </li><li> Abaisser une sonde à ultrasons RMV-704 (40 MHz) sur le bassin de la souris pour obtenir des images transversales ou longitudinales. </li><li> Si la tumeur est trouvée, les images peuvent être sauvegardées pour la mesure des dimensions tumorales. </li></ol> 4. Bioluminescent Imaging <ol><li> Effectuer une injection intrapéritonéale de 200 pi (150 mg / kg) substrat luciférine. </li><li> Provoquer une anesthésie générale à l&#39;isoflurane vaporisé et de maintenir par cône de nez. </li><li> Placez la souris en position couchée dans l&#39;imageur bioluminescence. </li><li> Cinq minutes après l&#39;injection de luciférine, de mesurer la bioluminescence de l&#39;animal en photons par seconde. </li></ol> 5. Préparation SARNA <ol><li> Synthétiser l&#39;ARN oligonucléotides à une échelle de 50-100 umol. </li><li> Recuit complémentaires oligonucléotides simple brin into saRNAs duplex. </li><li> Lipid-nanoparticule (TNL)-SARNA sont préparés avec le lipide ionisable 1,2-dilinoleyl-4-(2 - diméthylaminoéthyl) - [1,3]-dioxolane (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl choline, de cholestérol, et le PEG-DMG en utilisant une procédure vésicule spontanée formation formulation comme décrit précédemment. 1 </li></ol> 6. L&#39;administration intravésicale de Sarna Formulé <ol><li> Après avoir établi le modèle de la vessie orthotopique de tumeur, les souris sont traitées avec intravésicale d&#39;activation petit ARN (SARNA) formulé dans des nanoparticules lipidiques (LNPs) (Tableau 1). </li><li> L&#39;anesthésie générale est établie et maintenue avec l&#39;isoflurane vaporisé, et le lubrifiant ophtalmique stérile est appliqué. </li><li> Placez l&#39;animal en position couchée. </li><li> Effectuer un cathétérisme urétral tel que décrit précédemment. </li><li> Placez une cravate de soie 4-0 autour de l&#39;urètre et le cathéter. </li><li> Aspirer toute l&#39;urine à partir du cathéter etvessie à l&#39;aide d&#39;une seringue et une aiguille vide stylet. </li><li> Injecter TNL-SARNA intravésicale pour une dose totale de 50 ul (3 mg / kg). Enlever simultanément le cathéter et l&#39;aiguille de stylet, laissant l&#39;urètre occlus par la cravate en soie. </li><li> La souris restera anesthésiés avec de l&#39;urètre sous pansement occlusif pendant 2 heures. </li><li> Le traitement par voie intravésicale TNL-SARNA a commencé le jour 4 après implantation de la tumeur. Les souris ont été traitées en série, tous les 3 jours, pour un total de 14 traitements. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Les tumeurs de vessie découlant de la KU-7-luc2-cellules GFP peut être contrôlé par la luciférase bioluminescente imagerie (figure 1A et C) et l&#39;échographie de la vessie (figure 1B et D). Les tumeurs sont souvent détectable dans les 3-5 jours après l&#39;inoculation des cellules. Nous avons trouvé avec succès l&#39;implantation tumeur de la vessie dans plus de 90% des souris. Comme le traitement par voie intravésicale ARNdb s&#39;ensuit, la progression de la tumeur peut être surveillé wie ces modalités. Après l&#39;animal est sacrifié, la croissance tumorale peut également être confirmée par fluorescence de la GFP. En général, signifie bioluminescence en corrélation avec les dimensions moyennes à ultrasons pour les tumeurs de la vessie, comme on le voit visuellement dans figures 1C et 1D. Cependant, après que les animaux ont été sacrifiés et la tumeur a été confirmée par la GFP, nous avons constaté que la bioluminescence corrélation plus étroite avec la présence de tumeur viable que fait mesures échographiques. Cela était particulièrement évident chez les souris traitées avec Sarna (par opposition aux contrôles) parce que les tissus cicatrice résiduelle chez les souris traitées était souvent visualisée par échographie, mais n&#39;a pas pu être différenciées de la tumeur en direct. <img src="/files/ftp_upload/4207/4207fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. La cinétique de croissance tumorale de tumeurs de la vessie. (A) l&#39;imagerie par bioluminescence mesure l&#39;activité luciférase dans les tumeurs de la vessie afin de confirmer leur emplacement et de la croissance. (B) Dans la vessie ultrasoun vivod en utilisant une sonde 40MHz produit des images tumorales dont les dimensions peuvent être mesurées avec précision. (C) Graphiques illustrant l&#39;augmentation progressive de la tumeur dans les dimensions de bioluminescence et l&#39;échographie. Les valeurs représentent la moyenne (+ / - écart-type) des mesures à partir de 6 animaux. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4207/4207fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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	<li>Semple, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+cationic+lipids+for+siRNA+delivery.">Rational design of cationic lipids for siRNA delivery.</a> Nature. 28, 172-176 (2010).</li><li>Li, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+dsRNAs+induce+transcriptional+activation+in+human+cells.">Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).</li><li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+effect+of+dsRNA-induced+p21(WAF1/CIP1)+gene+activation+in+human+bladder+cancer+cells.">Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells.</a> Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).</li><li>Chancellor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+results+of+myoblast+injection+into+the+urethra+and+bladder+wall:+a+possible+method+for+the+treatment+of+stress+urinary+incontinence+and+impaired+detrusor+contractility.">Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility.</a> Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).</li><li>Hadaschik, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumour+inoculation+and+bioluminescence+imaging.">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU international. 100, 1377-1384 (2007).</li><li>Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Bladder+Wall+Injection.">Mouse Bladder Wall Injection.</a> J. Vis. Exp. (53), e2523 (2011).</li><li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Orthotopic+Model+of+Murine+Bladder.">An Orthotopic Model of Murine Bladder.</a> Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535 (2011).</li><li>Dinney, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice.">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).</li></ol>

LCL est un inventeur nommé dans l&#39;attente des demandes de brevet liées à SARNA qui ont été déposés par l&#39;Université de Californie à San Francisco et autorisé à Alnylam Pharmaceuticals.

Nous présentons un protocole pour la mise en place d&#39;une souris modèle de xénogreffes tumorales de la vessie orthotopique suivie d&#39;un traitement par voie intravésicale des tumeurs avec SARNA TNL formulé qui cible le promoteur de p21 CIP1/WAF1 (p21) pour l&#39;activation transcriptionnelle. 2, 3 Les tumeurs qui en résultent peuvent être confirmée et surveillée par imagerie bioluminescente et l&#39;échographie de la vessie. Modèles orthotopiques peut être supérieure à intrapéri...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> KU-7-luc-cellules GFP </td><td> Caliper </td><td> 128091 </td><td></td></tr><tr><td> thymiques chez la souris nude (nu / nu) </td><td> Laboratoires Simonsen </td><td> 6-7 semaines </td><td> Sim: (RCN) nu / nu Fisol </td></tr><tr><td> Appareil à ultrasons </td><td> Visualsonics </td><td> Vevo 770 </td><td> RMV-704 de sonde </td></tr><tr><td> Unité de bioluminescence </td><td> Caliper </td><td> IVIS spectre </td><td></td></tr><tr><td> Exel safelet cathéter </td><td> Pêcheur </td><td> 14-841-21 </td><td> 24G X ¾ &quot; </td></tr><tr><td> Le nitrate d&#39;argent </td><td> Sigma </td><td> S8157 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton seringue </td><td> Hamilton company </td><td> 80301 </td><td></td></tr><tr><td> TNL-SARNA </td><td> Pharmaceuticals Alnylam </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réactifs et équipements spécifiques.

an orthotopic bladder tumor model and the evaluation of intravesical sarna treatment

Nous présentons une nouvelle méthode pour traiter le cancer de la vessie avec intravésicale livré activation petit ARN (SARNA) dans un modèle de xénogreffe de souris tumeur orthotopique de la vessie. Le modèle de la souris est mis en place par cathétérisme urétral sous anesthésie générale par inhalation. Brûlure chimique est ensuite introduit à la muqueuse de la vessie à l&#39;aide intravésicale solution de nitrate d&#39;argent pour perturber la couche glycosaminoglycane de la vessie et permet aux cellules d&#39;attacher. Après plusieurs lavages à l&#39;eau stérile, cancer de la vessie humaine KU-7-luc2-GFP cellules sont inculquées à travers le cathéter dans la vessie pour habiter pendant 2 heures. La croissance ultérieure de tumeurs de la vessie est confirmée et surveillée par échographie de la vessie dans l&#39;imagerie in vivo et bioluminescente. Les tumeurs sont alors traitées par voie intravésicale avec SARNA formulée dans des nanoparticules lipidiques (LNPs). La croissance tumorale est contrôlée par échographie et la bioluminescence. Toutes les étapes de cette procédure sont mises en évidence dans la vidéo qui l&#39;accompagne.

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An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

L&#39;établissement d&#39;un modèle de la vessie orthotopique tumeur à évaluer les effets antitumoraux de Sarna par voie intravésicale livré et suivi de la croissance tumorale par échographie et l&#39;imagerie bioluminescente.

Un modèle de la vessie orthotopique tumorale et l&#39;évaluation de Sarna traitement intravésicale

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

an-orthotopic-bladder-tumor-model-evaluation-intravesical-sarna

Research

JoVE Journal

Medicine

14.6K vues.  University of California, San Francisco. L'établissement d'un modèle de la vessie orthotopique tumeur à évaluer les effets antitumoraux de Sarna par voie intravésicale livré et suivi de la croissance tumorale par échographie et l'imagerie bioluminescente.