Nous sommes reconnaissants à S. Taylor pour assurer la pLPCX-Histone H2-GFP plasmide. Nous remercions R. Mertelsmann pour leur soutien continu. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Ensemencement des cellules à base de cycline U2OS Reporter B-SNAP (clone 11 Cellules 6) sur diapositives chambre du microscope <ol><li> Trypsiniser subconfluentes cellules reporters SNAP qui ont été autorisés à se développer de manière asynchrone en phase logarithmique pendant au moins 48 heures. </li><li> Travailler avec 8 chambres microscope puits (distribution constante des cellules). </li></ol> Pour l&#39;ensemencement de cellules sur 8 chambres microscope ainsi à une distribution constante sur toute la surface de la chambre de microscope, centrifugeuse 10.000 cellules et remettre en suspension dans 350 ul de rouge de phénol libre milieu de croissance normale (supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal, de pénicilline / streptomycine et le pyruvate de sodium). Transférer la suspension cellulaire à la chambre de microscope (Figure 2). Travailler avec 8 chambres microscope ainsi (densité cellulaire maximale au centre). Pour l&#39;ensemencement de cellules à une densité plus élevée au centre de la chamb microscopeer, charger la chambre avec 300 ul de phénol rouge sans milieu de croissance normal. Ajouter 5.000 cellules soigneusement au centre de la chambre de microscope (Figure 2). Travailler avec des plaques de 96 puits optiques spéciales (distribution constante des cellules). Pour l&#39;ensemencement de cellules sur des plaques de 96 puits à une répartition constante sur toute la surface du puits, centrifuger 5.000 cellules et remettre en suspension dans 300 ul de rouge de phénol libre milieu de croissance normale. Transférer la suspension cellulaire sur une plaque de 96 puits. En fonction du nombre total de cellules contenant du puits nécessaire, ajuster le nombre de cellules et le volume total du milieu de suspension (figure 2). Travailler avec des plaques de 96 puits optiques spéciales (densité cellulaire maximale au centre). Pour les semis de cellules sur des plaques 96 puits, ajouter prudemment 1500 cellules dans 15 ul de phénol milieu dépourvu de rouge croissance normale dans un smalL goutte au centre de chaque puits pour atteindre restriction de la croissance des cellules par rapport au centre du puits (figure 2). <ol start="3"><li> Laisser les cellules ensemencées à croître pendant au moins 18 heures dans des conditions standard de culture cellulaire (37 ° C, humidité de l&#39;air 100%, 5% de CO 2). </li></ol> 2. La coloration des cellules avec Substrat Reporter SNAP <ol><li> 30 min avant le début de la procédure de coloration permettent aliquotes de rouge de phénol libre milieu de croissance normal de se réchauffer à 37 ° C. </li><li> Pour une manipulation aisée du substrat SNAP (dans notre cas TMR Star) dissoudre étoiles TMR dans le DMSO pour obtenir une concentration dans la solution mère de 400 uM, ce qui peut être conservé à -20 ° C. </li><li> Avant la coloration, diluer 0,5 pi de solution TMR actions étoile dans 200 ul de phénol milieu dépourvu de rouge croissance normale (37 ° C) pour obtenir une concentration d&#39;étiquetage finale de 1 uM. </li><li> Retirer milieu de croissance normal des cellules de culture et incuber de manière asynchrone dans lAbeling moyen pendant 25 min dans des conditions de culture standard. </li><li> Retirez le marquage de cellules moyennes et lavage quatre fois avec du phénol milieu dépourvu de rouge croissance normale (37 ° C). Incuber les cellules dans 300 ul de phénol milieu dépourvu de rouge croissance normale (37 ° C) pendant 30 min. Avant le transport du microscope remplacer le milieu frais avec rouge de phénol libre milieu de croissance normale (37 ° C) pour éliminer les résidus non lié substrat SNAP. </li><li> Transport cellules au microscope dans une boîte en polystyrène sur un pré-chauffée (37 ° C) bloc de chauffage pour minimiser les variations de température. </li></ol> 3. Mesure de l&#39;intensité de fluorescence <ol><li> Deux heures avant l&#39;analyse de régler la température de l&#39;air de la chambre climatique à 37 ° C en mode sec afin d&#39;amener le microscope complet avec tous ses composants à la température voulue. Préchauffage avant de l&#39;humidité est important de ne pas endommager la condensation et à la suite de la loupe. </li><li> Réglez t humidité de l&#39;airo 60% et CO 2 à 5%, avant le début de l&#39;analyse. </li><li> Démarrez le logiciel de numérisation ^ R acquisition et de définir des réglages standard (voir le tableau 1). </li><li> Définir les positions des puits à analyser. </li><li> Définir l&#39;At (temps de cycle d&#39;acquisition) et le nombre absolu de cycles d&#39;acquisition. </li><li> Si l&#39;analyse d&#39;un plus grand nombre de puits est souhaitée, sélectionnez l&#39;autofocus matériel, sinon il suffit d&#39;utiliser l&#39;autofocus logiciel seul. </li><li> Lancement de l&#39;acquisition et de superviser les deux premiers cycles d&#39;acquisition. Le microscope se concentrera sur la histone H2-GFP signal, à la suite de l&#39;acquisition d&#39;une première image en ce que le canal en amont du filtre est modifiée et l&#39;image étoile correspondant est acquis TMR (figure 3). Cet article est alors répété pour toutes les positions à l&#39;intérieur d&#39;un puits et pour chacun des puits à examiner, avant de répéter à nouveau au cycle suivant. </li></ol> 4. L&#39;analyse des profils u protéolytiquechanter scan ^ R <ol><li> Démarrer le logiciel d&#39;analyse de numérisation ^ R et analyser les images avec les noyaux des cellules, comme visualisé par l&#39;histone H2-GFP, défini comme l&#39;objet principal, à l&#39;aide d&#39;un seuil basé sur l&#39;intensité du signal et d&#39;un algorithme de bassins versants afin d&#39;aider à séparer les cellules voisines. Un sous-objet constitué d&#39;un noyau avec un cytoplasme doit être créé pour l&#39;analyse TMRstar. (Les propriétés importantes de l&#39;objet principal est positions X et Y, l&#39;heure et maximale et moyenne intensités de GFP pour l&#39;objet principal et l&#39;intensité totale divisée par la surface de la sous-objet TMRstar.) Ce processus d&#39;analyse peut prendre plusieurs heures en raison de données volumineuses quantités. </li><li> Changer de retracer le mode de visualiser la moyenne sous-objet TMR étoiles intensité de la fluorescence au cours du temps (traces de cellules), affectée aux objets analysés principales (figure 4). Le nombre de cellules à examiner peut être réduite par le déclenchement de ces mesures d&#39;une durée d&#39;au moins 140 cycles et à une forte intensité maximale de H2-GFP. Je suis làau plus grand nombre de cellules permet une vue représentant première et d&#39;objectif (figure 4). </li><li> Sélectionnez une trace de cellule d&#39;intérêt pour visualiser histone H2-GFP et TMR étoiles fluorescence simultanément au niveau de la cellule unique (figure 5A). </li><li> En utilisant le clic droit de la souris sur une cellule d&#39;intérêt et de générer une galerie de photos exportable à titre d&#39;illustration de l&#39;histone H2-GFP et de la cycline B-SNAP étoiles TMR pour chaque point de temps unique. </li><li> Changer le mode de la population du logiciel de numérisation ^ Analyse R et la porte de la région où la cellule d&#39;intérêt est représenté sur la parcelle X vs Y point (figure 5B). </li><li> Appliquer une fenêtre nouveau point complot pour la région fermée et visualiser dire TMR étoiles fluorescence d&#39;intensité au fil du temps (figure 5C). </li><li> Exporter des données (durée et l&#39;intensité de fluorescence) vers Microsoft Excel pour le calcul ultérieur. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Figueure 5D et 5E représentent cycline B cinétique, représenté par une courbe d&#39;intensité de fluorescence TMR étoile, d&#39;une cellule qui produit au moyen d&#39;une mitose ordinaire sans signe de désalignement chromosomique (figure 5E). Après compactage du cytoplasme suite de la rupture de l&#39;enveloppe nucléaire (NEBD, comme indiqué par le triangle rouge), TMR étoiles fluorescence d&#39;intensité montre une augmentation brutale jusqu&#39;à ce que la fenêtre isomorphe (zone plus claire sur le schéma) est atteint lorsque la cellule entre prométaphase 6. L&#39;intensité de fluorescence reste à un niveau stable tant que le produit des cellules à travers la prophase et la métaphase, puis commence à chuter rapidement une fois que tous les chromosomes ont établi une plaque métaphasique stable (figure 5D et 5E). Cette baisse précède la séparation des chromosomes lors de l&#39;anaphase (point bleu sur la courbe). Dans la mitose fin de la chromatine commence à decondense (barres bleues) et la cellule adopte la morphologie interphase tandis que la courbe d&#39;intensité de fluorescence se rapproche d&#39;uneplateau qui est plus faible que le plateau avant la mitose (figure 5D et 5E). <table border="1"><tbody><tr><td> Réglages autofocus </td><td> Histone H2-GFP (principaux paramètres d&#39;acquisition d&#39;objets) </td><td> Cycline B-SNAP étiquetés avec TMR étoiles (Paramètres d&#39;acquisition) </td><td> Répétitions d&#39;acquisition temps de cycle </td></tr><tr><td> Grossiers autofocus + / -39 um 24 couches Fine mise au point automatique + / -5,4 Um 14 couches </td><td> GFP jeu de filtres: Temps de pose: 100 ms Intensité lumineuse: 25% </td><td> TRITC jeu de filtres: Temps de pose: 150 ms Intensité lumineuse: 33,3% </td><td> 2 à 5 min. </td></tr><tr><td> GFP jeu de filtres: Temps de pose: 12 ms Intensité lumineuse: 12,5% </td><td></td><td></td><td> Jusqu&#39;à 48 h d&#39;analyse continue (limitée par l&#39;humidité de l&#39;air réduit de 60%) </td></tr></tbody&gt; </table> Tableau 1. Les paramètres standard tels qu&#39;ils sont utilisés pour l&#39;analyse de la cycline B protéolyse. Histones H2-GFP a été utilisé comme une structure de référence pour définir le plan focal pour la mesure de l&#39;intensité de fluorescence cycline B-SNAP. Les intensités lumineuses au cours de la procédure de mise au point sont bas par rapport aux paramètres d&#39;acquisition d&#39;images pour éviter de phototoxicité cumulatif. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> Figure 1. Schématique de la mesure de la cycline B protéolyse par l&#39;expression de la cycline B d&#39;un dérivé chimérique ayant des caractéristiques semblables à la dégradation de la protéine endogène. La baisse de l&#39;intensité de fluorescence après pulse-chase étiquetage est une mesure de l&#39;APC / C-activité. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;analyse des cellules sur 8 toboggans ainsi ou plaques de 96 puits. La distribution régulière de l&#39;cellules sur la surface du puits est réalisé par remise en suspension dans un volume final de 300 ul et il est recommandé, si seulement un seul ou quelques positions sont définies manuellement pour analyse. L&#39;enrichissement des cellules dans la zone centrale est réalisée par addition de cellules au centre de puits préremplies ou vide. Cette technique est recommandée en cas d&#39;acquisition automatique d&#39;images dans différents puits. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> Figure 3. Séquence d&#39;acquisition de données. A) Détection de l&#39;histone H2-GFP est utilisée pour la définition de son plan focal et le suivi de l&#39;alignement chromosomique lors de la mitose. B) L&#39;intensité de fluorescence de l&#39;intensité de fluorescence TMR étoile est une mesure de la quantité absolue de pulse-chase étiquetés cycline B-SNAP. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> Figure 4. Représentant de numérisation représentation ^ R Analyse basée sur les logiciels de la moyenne TMR étoilesintensités de fluorescence (intensité TMRstar totale divisée par la superficie) au fil du temps. Sélection d&#39;une trace de cellules représentant (bleu). Les images correspondantes (illustré à droite) permet la visualisation simultanée de l&#39;histone H2-GFP (vert) et de la cycline B-SNAP (rouge). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> Figure 5. A + B) Exemple de déclenchement de points représentant une cellule d&#39;intérêt sur ​​le graphique XY-point. C) La visualisation de l&#39;intensité moyenne de fluorescence TMRstar (intensité TMRstar totale divisée par la superficie) dans le temps en utilisant le tracé de points. D + E) représentant la courbe d&#39;intensité de fluorescence de la cycline B-SNAP avec fenêtre isomorphe (champ brigher sur le schéma) entre NEBD (répartition de l&#39;enveloppe nucléaire) et de la chromatine décondensation (barre bleue) tel que généré dans Microsoft Excel. Anaphase est indiqué par til point bleu sur la courbe. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Film 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film supplémentaire</a> .

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	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous présentons ici une approche imagerie des cellules vivantes basée faciliter la surveillance simultanée de la cycline B protéolyse et l&#39;alignement des chromosomes. Cette approche permet l&#39;étude du contrôle mitotique dans imperturbable populations de cellules au niveau de la cellule unique. Courbes de dégradation des cyclines B faciliter aperçu direct sur ​​l&#39;activité de l&#39;APC / C et donc indirectement refléter l&#39;état de la SAC 6. Cette approch...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Lignée cellulaire Reporter </td><td> généré en interne tel que décrit 6 </td><td> cloner 11 cellules reporters (U2OS à base de cycline B-SNAP cellules exprimant) </td><td></td></tr><tr><td> Rétroviral vecteur d&#39;expression de cycline B-SNAP </td><td> généré en interne tel que décrit 6 </td><td> pLNCX2-cycline B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> PHENOLRED DMEM sans </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> La supplémentation avec du FCS, le pyruvate de sodium, pénicilline / streptomycine nécessaire </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> Solution mère 400 uM dans du DMSO </td></tr><tr><td> Plaque spéciale Opstics, 96 puits </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 puits, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Unité de microscopie </td><td> Olympe </td><td> IX-81 microscope inverse avec la chambre climatique </td><td></td></tr><tr><td> Objectif </td><td> Olympe </td><td> UPLSAPO objectif 20x (NA 0,75) </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel d&#39;acquisition </td><td> Olympe </td><td> Scan ^ R acquisition de logiciels (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel d&#39;analyse </td><td> Olympe </td><td> Scan ^ Analyse logiciel R (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Répartition égale des chromosomes entre les cellules filles deux au cours de la division cellulaire est une condition sine qua non pour garantir la stabilité génétique 1. Inexactitudes lors de la séparation des chromosomes sont une caractéristique de malignité et associée à une maladie progressive 2-4. Le point de contrôle de groupe de broches (CSC) est un mécanisme de surveillance mitotique qui retient les cellules de métaphase jusqu&#39;à ce que chaque chromosome unique a établi une fixation bipolaire stable à la broche 1 mitotique. Le CSC exerce sa fonction par interférence avec l&#39;activation APC / C Cdc20 sous-unité pour bloquer la protéolyse de Securin et la cycline B et donc la séparation des chromosomes mitotiques et de sortie. Une mauvaise fixation des chromosomes empêche de faire taire SAC signalisation et provoque une inhibition continue de l&#39;APC / C Cdc20 jusqu&#39;à ce que le problème soit résolu pour éviter missegregation chromosomes, aneuploïdie et tumeurs malignes 1. La plupart des études portant sur les influence de l&#39;attachement chromosomique indue sur APC / C en fonction de la protéolyse a profité de perturbation broche à l&#39;aide dépolymérisation des microtubules ou de stabilisation des médicaments pour interférer avec l&#39;attachement aux microtubules chromosomique. Depuis interférence avec la cinétique des microtubules peut affecter le transport et la localisation des régulateurs critiques, ces procédures comportent un risque d&#39;induire des effets artificiels 5. Pour étudier comment le SAC interfère avec APC / C-protéolyse dépendante de la cycline B lors de la mitose dans imperturbable populations de cellules, nous avons établi un système d&#39;histone H2-GFP-base qui a permis le contrôle simultané de l&#39;alignement des chromosomes mitotiques en métaphase et la protéolyse de la cycline B 6 . Pour décrire les profils protéolytiques, nous avons généré une molécule chimérique cycline B journaliste avec un fragment C-terminal SNAP 6 (figure 1). Dans une réaction d&#39;auto-étiquetage, le SNAP-fragment est capable de former des liaisons covalentes avecalkylguanine-supports (substrat SNAP) 7,8 (figure 1). Molécules de substrat SNAP sont facilement disponibles et effectuer un large éventail de différents fluorochromes. Chimères cycline B-SNAP molécules marquées devenir lors de l&#39;addition du substrat de SNAP-membrane perméable au milieu de croissance 7 (figure 1). À la suite de la réaction de marquage, l&#39;intensité cycline B-SNAP fluorescence diminue dans une réaction de type pulse-chase manière intensités de fluorescence et de tenir compte des niveaux de dégradation de la cycline B 6 (figure 1). Notre système facilite le suivi des mitotique APC / C en fonction de la protéolyse dans un grand nombre de cellules (ou plusieurs populations cellulaires) en parallèle. Ainsi, le système peut être un outil précieux pour identifier des agents / petites molécules qui sont capables d&#39;interférer avec l&#39;activité protéolytique à la métaphase anaphase de transition. En outre, comme la synthèse de cycline B lors de la mitose a été récemment suggéré comme un mechanis importantsm dans la promotion d&#39;un bloc mitotique chez la souris et chez l&#39;homme en maintenant les niveaux d&#39;expression de cycline B 9,10 stables, ce système nous a permis d&#39;analyser la protéolyse B cycline comme un élément d&#39;un équilibre harmonieux 6.

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Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Métaphase anaphase de transition est déclenchée par l&#39;anaphase de promotion de complexe (APC / C) en fonction de l&#39;ubiquitination et la destruction subséquente de la cycline B. Ici, nous avons mis en place un système qui, à la suite pulse-chase étiquetage, permet de suivre la cycline B protéolyse dans des populations de cellules entières et facilite la détection des interférences par le checkpoint mitotique.

L&#39;étude de la protéolyse de la cycline B au niveau de la cellule unique dans les populations de cellules entières

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.4K vues.  University Medical Center Freiburg. Métaphase anaphase de transition est déclenchée par l'anaphase de promotion de complexe (APC / C) en fonction de l'ubiquitination et la destruction subséquente de la cycline B. Ici, nous avons mis en place un système qui, à la suite pulse-chase étiquetage, permet de suivre la cycline B protéolyse dans des populations de cellules entières et facilite la détection des interférences par le checkpoint mitotique.

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Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

Cellules entières Recordings of Light évoqués courants synaptiques excitateurs dans la tranche la rétine

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Recherche

Biologie

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

Obtention d&#39;ARN de haute qualité provenant des populations cellule unique de tissus post-mortem du cerveau de l&#39;homme

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Méthode pour la mesure de la cinétique de fusion virale au niveau particule unique

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Génération d&#39;dispersée présomitique mésoderme cultures cellulaires pour l&#39;imagerie de la segmentation Horloge poisson zèbre dans des cellules individuelles

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Analyse de LINE-1 Rétrotransposition au Nucleus Simple Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.