Les auteurs tiennent à remercier les Instituts canadiens de recherche en santé (IRSC) et la Société canadienne du cancer pour financer la recherche du cycle cellulaire dans leur laboratoire. MJC est récipiendaire d&#39;une bourse MD / PhD des IRSC. MJC et MA sont membres du programme de formation CaRTT.

1. L&#39;étiquetage et la fixation des cellules <ol><li> Ajouter 1 ul de réactif de marquage prolifération cellulaire (BrdU) par ml de milieu de culture cellulaire (1 à 1000 de dilution) 1 heure avant la récolte. La période d&#39;étiquetage peut être nécessaire de rallongée pour plus lent des cellules en croissance. </li><li> Pour les cellules de la récolte, un milieu de culture, aspirer et laver soigneusement avec du tampon phosphate salin (PBS). Répéter pour bien enlever les traces de milieu. </li><li> Lavez rapidement les cultures une troisième fois avec du PBS contenant 3 mM EDTA et aspirer à fond. </li><li> Ajouter un petit volume de PBS contenant 3 mM EDTA à chaque plat, 0,5 ml pour un plat de 6 cm est idéale. Incuber à 22 ° C pendant environ 5 minutes pour détacher les cellules. Transférer dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 minutes pour obtenir un culot, enlever le surnageant et remettre soigneusement dans 100 ul de PBS. </li><li> Fixer les cellules en ajoutant 5 ml d&#39;EtOH à 95%, goutte à goutte, tout en vortex. À cette étape, les cellules peuvent être conservés à 4 ° C pendant au moins unemois. </li></ol> 2. La dénaturation et la coloration de BrdU et l&#39;ADN <ol><li> Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules et enlever EtOH 95%. Remettre en suspension dans 1 ml de HCl 2N et 0,5% Tx-100 par l&#39;ajout d&#39;une manière goutte à goutte tout en vortex. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. </li><li> Centrifuger comme avant dans la section 2.1 et aspirer délicatement le surnageant puisque les cellules forment un très lâche granules à cette étape. Doucement remettre en suspension dans 1 mL de 0,1 M NaB 4 O 7 (pH 8,5) et incubées pendant au moins 30 minutes à température ambiante. </li><li> Pellet cellules comme ci-dessus dans la section 2.1 et remettre en suspension dans 0,5 ml de solution d&#39;anticorps (PBS contenant 1% et BSA 0,2% de Tween-20) avec des anticorps de souris anti-BrdU dilué de 1 à 50. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. </li><li> Cellules Pellet à nouveau et remettre en suspension dans 50 ml de solution contenant des anticorps de lapin anti-souris des anticorps secondaire conjugué au FITC dilué 1 à 25. Incuber pendant 30 minutes surpaillasse et de protéger de la lumière. </li><li> Centrifuger les cellules une dernière fois et remettre en suspension dans 0,5 ml d&#39;iodure de propidium et RNase solution (PI-RNAse solution PBS avec 1% de BSA, 10 mg / mL d&#39;iodure de propidium, 0,25 mg / mL de RNase A) et incuber à l&#39;obscurité à 37 ° C pendant 30 minutes. Alternativement ARN peut être digéré une nuit à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Passe solution à travers une passoire pour enlever les agrégats de cellules et de recueillir des cellules individuelles dans un tube approprié pour l&#39;absorption de l&#39;échantillon sur votre cytomètre en flux. Encore une fois, les échantillons doivent être protégés de toute exposition directe à la lumière. </li></ol> 3. Analyse par cytométrie en flux <ol><li> Les cellules doivent être analysés par un cytomètre en flux standard qui est capable de discriminer des doublets (deux cellules qui passent à travers la cellule de flux comme l&#39;une) avec une capacité de détection approprié pour l&#39;iodure de propidium et FITC. Les cellules individuelles peuvent être détectés dans cette demande de la cytométrie de flux par gating pour des événements basés sur dispersent vers l&#39;avant et côté pop de dispersionulations, et en utilisant les propriétés de coloration de l&#39;ADN par l&#39;iodure de propidium. L&#39;apparition d&#39;un nuage de points discriminant doublet varie entre cytomètres de flux et s&#39;appuie sur les propriétés de propidium coloration iodure, voir votre installation locale de cytométrie en flux pour des conseils sur la mise en place d&#39;un discriminateur doublet dans votre analyse. En général, dans une population asynchrone prolifération des cellules, des cellules simples sont habituellement les deux sommets les plus abondants (2N et 4N ADN) dans le complot doublet discriminant et une porte devrait être établi autour d&#39;eux. Cela permet de sélectionner des événements cellule unique qui sont utilisés pour toutes les analyses ultérieures ci-dessous. </li><li> Le premier échantillon à analyser doit être une culture asynchrone proliférant qui sert de contrôle positif pour la coloration et cytomètre en flux set-up. Réglez la sensibilité de tubes photomultiplicateurs pour la coloration de l&#39;iodure de propidium tels que les pics 2N et 4N partir de cellules de singulet sont centrées à 200 et 400 (unités arbitraires) sur l&#39;axe X. Nous avons souvent une tache s abondanteupply de ces cellules pour s&#39;assurer que tous les paramètres du cytomètre en flux ont été ajustés de manière appropriée sans utiliser cet échantillon. Ce contrôle positif est également utile pour les nouveaux utilisateurs de se familiariser avec le fonctionnement du cytomètre de flux. </li><li> Réglez la sensibilité du tube photomultiplicateur pour la détection de FITC tels que les populations G1 et G2 / M sont au-dessus de fond. Cellules BrdU positives devraient être environ 10 fois plus lumineux et l&#39;axe Y doit être affichée comme une échelle logarithmique. Il est parfois utile d&#39;inclure un contrôle négatif pour la coloration BrdU (en remplaçant les anticorps anti-BrdU avec des non-IgG spécifiques à l&#39;étape 2.3 ci-dessus) afin de distinguer clairement les cellules colorées positivement. </li><li> Ajuster la compensation entre l&#39;iodure de propidium et FITC tels que des événements simples capturé par la forme cytomètre en flux d&#39;un arc en forme de fer à cheval à partir de G1 en bas à gauche jusqu&#39;à la phase S et vers le bas dans le coin inférieur droit pour G2 / M. S&#39;il vous plaît voir la référence suivante pour un plus en profondeur DISdiscussion sur les principes et l&#39;utilisation de la cytométrie de flux et de références là dans des applications spécifiques 2. </li></ol> 4. L&#39;analyse des données <ol><li> 5 000 à 10 000 événements cellule unique avec la gamme souhaitée du contenu en ADN devraient être recueillies pour chaque échantillon afin d&#39;avoir confiance que la population de cellules dans la culture ont été soigneusement échantillonnés. </li><li> Une fois que les cellules ont été mesurés pour l&#39;iodure de propidium et le contenu de BrdU ils ont besoin pour être affecté à des phases G1, S ou G2 / M. Pour ce faire, le dessin des barrières autour des populations BrdU deux négatifs centré à 200 et 400 (G1 et G2 / M, respectivement). Tout au dessus de ces boîtes doivent être inclus dans une seule porte que les mesures de la phase S (fig. 1A). Le pourcentage de cellules dans chaque porte représente le nombre relatif de cellules en G1, S et G2 / M (Fig. 1B). </li></ol> 5. Protocole alternatif pour l&#39;analyse du cycle cellulaire dans une population mixte de cellules <ol><li> Ce protocole alternatif estplus utile quand la transfection de vecteurs d&#39;expression couramment traduit par un faible pourcentage de cellules exprimant le produit du gène d&#39;intérêt, ou lorsque le traitement médicamenteux de sélectionner une population pure de cellules est impraticable. Il en résulte une proportion relativement faible de cellules d&#39;intérêt étant contaminé par une grande population de cellules untransduced. Dans ce cas, la co-transfection de plasmides exprimant votre gène ou de shRNA d&#39;intérêt avec un plasmide qui exprime un marqueur pour la détection de cellules transfectées par cytométrie en flux, comme une membrane ancrée GFP 3, ou un marqueur de cellule étrangère de surface tels que CD19 4 ou CD20 5. </li><li> Aux fins du présent protocole, nous allons utiliser CD20 coloration comme un exemple, cependant, la coloration pour CD19 est essentiellement identique. Dans le cas de transfection avec le CD20, il n&#39;est pas nécessaire d&#39;étiqueter BrdU, les cellules de récolte simplement comme décrit dans les étapes 1.2 à 1.5 ci-dessus et les taches en ajoutant 20 uL FITC conjugué anticorps anti-CD20 sur les cellules sur les iCE pendant 20 minutes dans l&#39;obscurité. Fixer les cellules comme décrit en 1.6 étape. Les cellules peuvent à nouveau être stocké pendant au moins un mois à 4 ° C dans l&#39;obscurité. Pour la détection de la GFP, omettre la coloration des anticorps de cette étape et de fixer et de stocker les cellules comme décrit. </li><li> Réhydrater les cellules par granulation dans la centrifugeuse à 500 xg pendant 5 minutes et remettre en suspension dans 5 ml de PBS contenant 1% de BSA. </li><li> Re-granulés les cellules à 500 xg pendant 5 minutes et remettre les cellules dans 0,5 ml d&#39;iodure de propidium et la solution de RNase comme décrit plus haut dans la section 2.5. </li><li> Continuez à suivre les instructions de préparation de cellules dans 2,6 et l&#39;analyse des instructions en 3.1 et 3.2. </li><li> Réglez la sensibilité du tube photomultiplicateur pour la détection de FITC telles que cellules non colorées sont au-dessus de fond. Idéalement, CD20-FITC des cellules positives seront 10X à 100X plus intensément colorés que les antécédents et l&#39;axe des Y de cette parcelle doit être affichée comme une échelle logarithmique (figure 2A). CD20 des cellules positives qui sont plus brillantes que les 10X backgrond (et avec coloration iodure de propidium entre 200 et 400) devraient être sélectionnés pour affichage dans un iodure de propidium par rapport numérations cellulaires histogramme, comme indiqué dans la Fig. 2C. Pour les lignées cellulaires qui expriment des marqueurs qui sont facilement tachés vives (c.-à-10X à 100X dessus du fond), le CD20 positif de coupure doit être réglé à fond 10X. L&#39;inclusion des cellules présentant une coloration plus faible augmente la variabilité de ces expériences, sans doute parce que le gène d&#39;intérêt est également faiblement exprimés dans ces cellules. Pour les lignées cellulaires qui ne donnent que faiblement teinté CD20 positifs (c.-à moins de fond 10X), la détermination d&#39;une large coupe doit être faite en utilisant un témoin négatif constitué de CD20 tachés, les cellules non transfectées. </li><li> Au moins 1000 CD20 événements positifs devraient être recueillies pour chaque échantillon. Les expériences avec moins que 1000 va produire des événements forte variabilité. Les logiciels tels que ModFit LT (Verity Software), cycle AV Multi (Phoenix Flow Systems), et les flux de Jo (Arbre Étoile) utilisent les estimations des mathématiquesles populations G1, S et G2 / M qui contribuent à la forme de la courbe des histogrammes tels que ceux montrés dans la Fig. 2B et C. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Nous fournissons trois exemples d&#39;analyses expérimentales du cycle cellulaire en utilisant nos approches. La première utilise l&#39;expression de la cycline rétroviraux inhibiteurs de kinases dépendantes dans p27KIP1 fibroblastes embryonnaires de souris. Vingt quatre heures après la sélection des médicaments pour une infection virale a été complète, les cellules ont été étiquetés avec impulsion de BrdU pendant une heure. Dans cette expérience, l&#39;expression ectopique de l&#39;inhibiteur est utilisé pour arrêter la prolifération des cellules (Fig. 3A et B). Comme indiqué dans la Fig. 3B petits événements de BrdU positives sont évidentes dans la porte de la phase S en réponse à p27. De même, le pourcentage de cellules en phase S de cellules exprimant p27 est assez faible comme schématisé dans la Fig. 3C. Ce type d&#39;analyse a été très efficace dans la caractérisation des défauts dans le contrôle du cycle cellulaire des cellules dérivées de diverses souches de gène-souris ciblées 6, 7, 8. Dans la deuxième expérience, les cellules épithéliales mammaires non transformées (MCF10A) ont été traités avec la cytokine la croissance inhibitrices, transforming growth factor beta un (TGF-β1) pendant 24 heures. Les cellules ont été marquées avec BrdU pendant quatre heures immédiatement avant la récolte. Comme indiqué dans la Fig. 4 marquage BrdU dans les cellules en phase S est fortement diminuée par le TGF-β1 de signalisation, la spécificité de notre coloration est également validé par un contrôle négatif IgG (figure 4C). Quantification des différentes phases du cycle cellulaire confirme que le TGF-β1 inhibe la prolifération surtout dans la phase G1 du cycle cellulaire, conduisant à une accumulation dans cette phase. Dans notre dernier exemple, PRB déficient cellules Saos-2 sont transfectées par un vecteur CMV-CD20 expression et soit CMV-RB ou CMV-β-Gal comme un contrôle. Trois jours après transfection, les cellules ont été récoltées, taché, et fixe. L&#39;analyse par cytométrie de flux de ces celluless est montré dans la Fig. 5. Cela démontre la distribution du cycle cellulaire des cellules transfectées de contrôle négatif (Fig. 5A) en comparaison avec la répartition suivante 72 heures d&#39;expression pRB (Fig. 5B). Après ajustement de courbe par un logiciel de cycle pluriannuel, une comparaison directe de la proportion des phases du cycle cellulaire est montré dans la Fig. 5C. Cela révèle l&#39;accumulation de cellules en G1 pRB expression suivante et l&#39;épuisement relatif de cellules à partir des phases S et G2 / M. Nous avons utilisé des variations sur ce test pour sonder les mécanismes d&#39;arrêt G1 abondamment 9, 10, 11, 12, 13. Ces exemples montrent comment le contrôle du cycle cellulaire peut être mesurée en réponse à une variété de stimuli ou de manipulations cellulaires. Cette approche peut donc être adapté à de nombreuses applications qui nécessitent la mesure de la position du cycle cellulaire dans des expériences de type de culture. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg" /> Figure 1. Quantittion des phases du cycle cellulaire par l&#39;iodure de propidium combinés et coloration BrdU (PI-BrdU). (A) Ce panneau affiche trois dimensions de la cytométrie de flux et de l&#39;iodure de propidium cellules colorées BrdU. Notez que les cellules avec du contenu en ADN 2N et 4N sont centrées sur les 200 et 400 marques sur l&#39;échelle de l&#39;axe X pour l&#39;intensité de coloration de propidium iodure. Intensité de coloration BrdU est mesurée sur une échelle logarithmique sur l&#39;axe Y. Notez la position des portes utilisées pour quantifier les cellules dans les phases G1, S et G2 / M du cycle cellulaire. (B) la proportion relative de cellules dans chacune des portes G1, S et G2 / M de A sont représentées sur ce graphique. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg" /> Figure 2. Quantification des phases du cycle cellulaire dans les cellules sélectionnées en utilisant l&#39;iodure de propidium et le marqueur CD20 à la surface cellulaire. (A) Ce panneau indique l&#39;iodure de propidium et CD20 coloration pour un mélange de cellules, dont certaines expriment le CD20 ectopique et pRB. Notez que les cellules avec2N et de l&#39;ADN 4N (les populations les plus abondantes) sont centrées sur les 200 et 400 marques sur l&#39;axe X. La position de la porte de CD20 + sélectionne les cellules qui sont colorées d&#39;au moins 10X plus brillamment que de fond. (B) Un graphique de la numération cellulaire par rapport coloration iodure de propidium est indiqué pour le CD20 des cellules négatives dans le panneau A qui sont en mode asynchrone prolifèrent. (C) Un graphique similaire est indiqué pour le CD20 des cellules positives à partir du panneau A qui ont été induits à l&#39;arrestation à l&#39;expression de pRB et contiennent des cellules avec du contenu en ADN principalement 2N. Cela démontre que l&#39;arrêté sous-population peuvent être distinguées des autres cellules de cette culture en utilisant cette technique de coloration. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg" /> Figure 3. Inhibition de la prolifération cellulaire par p27KIP1. (A) PI-BrdU analyse est utilisée pour mesurer les phases du cycle cellulaire dans une population asynchrone prolifération de cellules qui ont été transduites avec une vecto vides rétroviraux pBABER. (B) Une analyse similaire des cellules transduites avec pBABE-p27. Notez l&#39;absence de cellules dans la phase S et une plus grande intensité des événements dans G1 et G2 / M portes. (C) La quantification des cellules dans les phases respectives du cycle cellulaire en mode asynchrone prolifèrent de contrôle et des cellules exprimant p27. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg" /> Figure 4. Inhibition de la prolifération cellulaire par le TGF-β1 (A) PI-BrdU analyse de manière asynchrone cellules proliférantes MCF10A. (B) Analyse des cellules traitées avec 100 pM de TGF-β1 pendant 24 heures. Notez l&#39;accumulation de cellules principalement dans la phase G1 du cycle cellulaire. (C) Validation de la coloration BrdU en remplaçant l&#39;anticorps anti-BrdU primaire avec un contrôle non-IgG spécifiques dans les cellules prolifèrent de manière asynchrone. (D) quantification graphique des phases respectives du cycle cellulaire de A et B. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg" /><br/&gt; Figure 5. Inhibition de la prolifération cellulaire par pRB. (A) par rapport comptages cellulaires coloration iodure de propidium de CD20 et de ß-gal cellules transfectées est montré. Ceci est un contrôle important que la transfection peut partiellement synchroniser les cellules, ce qui rend la population non transfectées (CD20 - cellules) comme un contrôle inapproprié pour le transfectées sous-population. Les cellules transfectées ont besoin d&#39;être comparé à d&#39;autres cellules transfectées de façon analogue. (B) comptages cellulaires par rapport graphe d&#39;iodure de propidium CD20 et pRB cellules transfectées. A noter la présence quasi exclusive d&#39;un pic de 2N. (C) Représentation graphique des proportions du cycle cellulaire de phase déterminée à partir de A et B en utilisant des méthodes d&#39;ajustement des courbes dans le logiciel cycle pluriannuel.

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans notre expérience, le succès de ces techniques dépend de quelques contrôles clés et des conditions expérimentales. L&#39;un est l&#39;établissement d&#39;un contrôle de la prolifération de manière asynchrone pour une utilisation dans ces expériences. Ce contrôle sert trois objectifs importants. D&#39;abord, il s&#39;assure que les conditions de culture utilisé pour tous les échantillons expérimentaux sont adéquates pour soutenir la prolifération continue en l&#39;absence de traitement. Cet échantillon sert également l&#39;objectif d&#39;un contrôle positif pour la méthodologie de coloration pour s&#39;assurer que BrdU ou CD20 des cellules positives peuvent être détectés quand ils sont présents. Enfin, cet échantillon est utilisé pour étalonner le cytomètre en flux. Cet échantillon de contrôle peuvent être utilisés pour ajuster l&#39;intensité de propidium coloration iodure pour détecter les cellules 2N et 4N à 200 et 400 respectivement. Par ailleurs, la sensibilité de détection de BrdU ou CD20 peut être ajustée de sorte que les signaux négatifs et positifs sont centrés, comme indiqué dans les figures 1A et 2A. Lorsque tous les échantillons ont une concentration similaire de cellules dans PI-RSolution de Nase, puis quelques ajustements à l&#39;cytomètre sont nécessaires que les échantillons ultérieurs sont exécutés. Ceci est important pour des raisons indiquées dans la Fig. 4B et 5B où l&#39;accumulation G1 forte crée essentiellement un pic G1 unique qui pourrait être interprétée comme G2 / M. Les expériences représentatives aussi faire d&#39;autres points importants. Tout d&#39;abord, ils montrent que l&#39;absorption de BrdU et l&#39;étiquetage peut varier entre les types cellulaires. Pour cette raison il est important de déterminer empiriquement la longueur des impulsions et des conditions de coloration nécessaire pour détecter adéquatement les cellules en phase S. En général, les types de cellules qui doublent dans la culture en 24 heures ou moins peuvent être étiquetés avec BrdU dans une heure. Ralentissement des types de cellules peuvent exiger plus de croissance des légumineuses et des altérations des conditions de coloration des anticorps et la durée. Cellules MCF10A sont un excellent exemple à cet égard comme ils ont été marqués avec BrdU pendant quatre heures et colorées avec le double de la concentration de l&#39;étalon d&#39;anticorps pour quatre fois plus longtemps. Les enquêteurs ontdevraient faire attention à ne pas dépasser 6 heures de marquage au BrdU, même avec des cellules croissance très lente, car cela peut conduire à tort inclusion de G2 / M cellules dans la population en phase S. Deuxièmement, en comparant les effets de l&#39;expression p27KIP1 avec ceux du TGF-β1, il est clair que p27 peut induire une accumulation dans les deux G1 ou G2 / M phases de TGF-β1 tout de signalisation induit un arrêt en G1. Les moyens traditionnels de détection de la prolifération tels que 3 H-thymidine et de comptage à scintillation sont incapables de distinguer ces possibilités. Dans notre protocole alternatif, nous démontrons la détection d&#39;une sous-population de cellules dans une population plus large non transfectées. Il est important de déterminer empiriquement le journaliste le plus approprié pour la détection de cellules transfectées. Dans notre expérience certains types de cellules, soit la surface des cellules expriment des marqueurs mal, ou ne peut pas correctement leur trafic vers la membrane plasmique, résultant en une incapacité à détecter les cellules transfectées. Likewise, toutes les cellules ne tolèrent la forme membranaire liée de la GFP. Sélection de la journaliste la plus appropriée devrait être fait en évaluant l&#39;efficacité de transfection du journaliste ainsi que l&#39;intensité relative de l&#39;expression par rapport aux contrôles non transfectées. Idéalement, l&#39;expression hétérologue de ces molécules sera bien toléré et ceci est suggestive que les marqueurs ont peu ou pas d&#39;effet sur la distribution du cycle cellulaire. Une limitation de ces types d&#39;approches de cytométrie en flux est qu&#39;ils ne sont capables d&#39;établir des abondances relatives des phases du cycle cellulaire par rapport à l&#39;autre. Pour cette raison, il est ambigu si l&#39;expression de p27 dans la Figure 3 induit un véritable arrêt en phase G1 et G2 / M, ou si elle ralentit la progression juste à travers ces phases relatives à la phase S. Ces possibilités peuvent être étudiées plus loin en traitant un échantillon parallèle de cellules avec un inhibiteur mitotique, comme le nocodazole, ou G1 / S, comme inhibiteur de aphidicoline. Étant donné que ces médicaments créent une dominant dans l&#39;arrestation de M-phase ou au début de la phase S, respectivement, les cellules prolifèrent lentement vont s&#39;accumuler au point d&#39;arrêt d&#39;origine médicamenteuse. Pour les cellules en G1 par exemple été arrêtés en raison de l&#39;expression pRB restera en G1, malgré le traitement tandis que les cellules de contrôle nocodazole va s&#39;accumuler dans la phase M-13. Pris ensemble, ces approches expérimentales offrent une méthodologie flexible qui peut être appliquée à un large éventail de questions de recherche de cellules de mammifères cycle. Ils peuvent facilement détecter les altérations de la progression du cycle cellulaire et de quantifier les différences par rapport aux témoins.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif / équipements </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Réactif de marquage prolifération cellulaire </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps anti-BrdU </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps anti-souris conjugué FITC </td><td> Vector Labs </td><td> FI-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Filtres souche cellulaire </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps anti-CD20 </td><td> BD Biosciences </td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td> Cycle Software multi </td><td> Phoenix Flow Systems </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of cell cycle position in mammalian cells

La régulation de la prolifération cellulaire est au cœur de la morphogenèse des tissus durant le développement des organismes multicellulaires. Par ailleurs, la perte de contrôle de la prolifération cellulaire sous-tend la pathologie des maladies comme le cancer. En tant que tel il ya grand besoin d&#39;être en mesure d&#39;enquêter sur la prolifération cellulaire et à quantifier la proportion de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire. Il est également d&#39;importance vitale pour indistinctement identifier les cellules qui se répliquent leur ADN au sein d&#39;une population plus large. Depuis la décision d&#39;une cellule à proliférer est faite dans la phase G1 immédiatement avant d&#39;initier la synthèse d&#39;ADN et de progresser dans le reste du cycle cellulaire, la détection de synthèse d&#39;ADN à ce stade permet une détermination sans ambiguïté du statut de régulation de la croissance en culture cellulaire expériences. Le contenu en ADN dans les cellules peuvent être facilement quantifié par cytométrie en flux des cellules colorées avec de l&#39;iodure de propidium, un colorant fluorescent intercalant l&#39;ADN.De même, synthèse de l&#39;ADN active peut être quantifiée par la culture de cellules en présence de thymidine radioactive, la récolte des cellules, et en mesurant l&#39;incorporation de la radioactivité en une fraction insolubles dans l&#39;acide. Nous avons une expertise considérable en analyse du cycle cellulaire et de recommander une approche différente. Nous enquêtons sur la prolifération cellulaire à l&#39;aide bromodésoxyuridine / fluorodésoxyuridine (abrégée simplement comme BrdU) coloration qui détecte l&#39;incorporation de ces analogues thymine dans l&#39;ADN récemment synthétisée. Étiquetage et marquage des cellules avec BrdU, combiné avec coloration de l&#39;ADN total par l&#39;iodure de propidium et l&#39;analyse par une cytométrie en flux offre la mesure la plus précise des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire. Il est notre méthode préférée parce qu&#39;elle combine la détection de la synthèse de l&#39;ADN actif, grâce à une coloration à base d&#39;anticorps de BrdU, avec du contenu en ADN total de l&#39;iodure de propidium. Cela permet la séparation claire des cellules en G1 de phase précoce, S ou S fin de phase de G2 / M.Par ailleurs, cette approche peut être utilisée pour étudier les effets de plusieurs stimuli cellulaires différents et des agents pharmacologiques sur la régulation de la progression à travers ces différentes phases du cycle cellulaire. Dans ce rapport, nous décrivons des méthodes de marquage et de coloration des cellules en culture, ainsi que leur analyse par cytométrie en flux. Nous incluons également des exemples d&#39;expérimentation de la façon dont cette méthode peut être utilisée pour mesurer les effets des signaux d&#39;inhibition de la croissance des cytokines comme le TGF-β1, et les inhibiteurs de prolifération tels que l&#39;inhibiteur de kinase cycline-dépendantes, p27KIP1. Nous incluons également un autre protocole qui permet l&#39;analyse de la position du cycle cellulaire dans une sous-population de cellules au sein d&#39;une culture plus large 5. Dans ce cas, nous montrons comment détecter un arrêt du cycle cellulaire dans les cellules transfectées avec le gène rétinoblastome, même si beaucoup plus nombreux que par les cellules non transfectées dans la même culture. Ces exemples illustrent les nombreuses façons coloration de l&#39;ADN et que lescytométrie en flux peut être utilisé et adapté pour étudier des questions fondamentales de contrôle du cycle cellulaire des mammifères.

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Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Déterminer la position du cycle cellulaire d&#39;une population de cellules, ou de comprendre comment les signaux affectent la prolifération, peut être facilement mesurée par cytométrie en flux en utilisant ce protocole. Nous rapportons une approche expérimentale simple pour coloration des cellules et de quantifier leur position dans le cycle cellulaire.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

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59.8K vues.  University of Western Ontario. Déterminer la position du cycle cellulaire d'une population de cellules, ou de comprendre comment les signaux affectent la prolifération, peut être facilement mesurée par cytométrie en flux en utilisant ce protocole. Nous rapportons une approche expérimentale simple pour coloration des cellules et de quantifier leur position dans le cycle cellulaire.

Vidéo: Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

Cellules d&#39;imagerie à long terme des mammifères en utilisant la microscopie à champ large

Recherche

Biologie

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-chase Analyse des chaînes de sucre N-glycoprotéines liées à des cellules de mammifères

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

L&#39;analyse de l&#39;ADN double-brin Break (ORD) de réparation dans les cellules de mammifères

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

Analyse de l&#39;expression de mammifères Linker-histones sous-types

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...