Soutenu par des subventions du NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​la Fondation Hartwell, et la Doris Duke Charitable Foundation. Dr Paczesny est un enquêteur du fonds Eric Hartwell et le Programme de recherche Amy Strelzer Manasevit.

1. 0 Jour Expérience: Préparation des échantillons et revêtement de plaque d&#39;essai ELISA avec anticorps de capture pour l&#39;IL-2Rα, REG3α et le HGF <ol><li> Échantillons aliquotes de plasma à analyser seront tirés, décongelé et centrifugé à 12000 rpm pendant 10 min pour séparer les caillots dans le bas et de lipides au-dessus du plasma. 150 ul de plasma non dilué sera plaquée de chaque échantillon sur un 96-V et plaque à fond (plaque de source) par pipetage manuel selon les cartes prédéfinies. Les aliquotes sera enveloppé dans du parafilm et conservée dans une chambre humide à 4 ° C pendant tout le processus, non plus que de 72 heures. </li><li> IL-2Rα et anticorps de capture HGF sera reconstitué et dilué par les spécifications du fabricant et 50 pi seront étalées dans chaque puits d&#39;respectives de 96 puits à haute reliure demi-puits qui sont ensuite scellées et incubées une nuit à 4 ° C. Sinon, de nombreuses plaques peuvent être séchés à 37 ° C et conservé à 4 ° C pour une utilisation ultérieure, dépendenttion sur la stabilité de la protéine. </li><li> Anticorps de capture REG3α seront dilués selon le protocole du fabricant à l&#39;aide du tampon de revêtement fabricant et 25 ul seront déposées dans chaque puits d&#39;une de 384 puits Nunc Maxi-Sorp plaque qui est ensuite scellé et incubé pendant une nuit à 4 ° C. </li></ol> 2. 1 Jour Expérience: IL-2Rα ELISA (Figure 1) <ol><li> La plaque d&#39;essai IL-2Rα est lavé, bloqué avec BLOTTO dans du TBS, et la norme est reconstitué et une courbe standard de 8 points est préparé par le protocole du fabricant. </li><li> Après lavage de la plaque après l&#39;étape de blocage, 50 ul de plasma non dilué est plaqué en double exemplaire de la plaque de source à la plaque ELISA, et 50 pi de chaque norme est plaqué en double exemplaire. La plaque est scellée et incubée pendant 2 heures à température ambiante sur un agitateur de microplaques à 300 rpm. </li><li> Le plasma est récupéré à partir de la plaque d&#39;IL-2Rα test ELISA et remis à l&#39;ONUdilué plaque de source de plasma. Le test ELISA est complété par le protocole du fabricant (avec des volumes corrigés des demi-puits) et la densité optique de chaque puits est lue en utilisant un lecteur de plaque ensemble à 450-570 nm, et les données enregistrées et analysées. </li></ol> 3. 1 Jour Expérience: REG3α ELISA (Figure 1) <ol><li> 10 ul de plasma non dilué sera transféré à une plaque de source v-fond séparé. 90 ul du fabricant fourni par le tampon de dilution est ajouté à chaque puits pour créer une plaque dilution 1:10 source. </li><li> Le test ELISA REG3α est effectuée par le protocole du fabricant (avec des volumes ajustés pour plaques de 384 puits) et la densité optique de chaque puits est lue en utilisant un lecteur de plaque réglé à 450-620 nm, et les données seront enregistrées et analysées. </li></ol> 4. 1 Jour Expérience: élafine et revêtement de TNFR1 plaque d&#39;essai avec anticorps de capture <ol><li> Élafine et anticorps de capture TNFR1 sera reconstitué et diluétribué aux spécifications du fabricant et 50 pi seront étalées dans chaque puits d&#39;respectives de 96 puits à haute reliure demi-puits qui sont ensuite scellées et incubées pendant une nuit à température ambiante pendant élafine, et à 4 ° C pour TNFR1. </li></ol> 5. Journée Expérience 1-2: HGF ELISA (Figure 1) <ol><li> Après avoir terminé le test ELISA d&#39;IL-2Rα et en assurant le test n&#39;a pas besoin d&#39;être répété, 60 ul de plasma non dilué transféré sur une plaque nouvelle source, puis 60 pl de BSA à 1% dans 1 x PBS est ajouté dans chaque puits pour faire une 01h02 plaque de source de plasma dilué. </li><li> La plaque d&#39;essai HGF est lavé, bloqué avec BLOTTO dans du TBS, et la norme est reconstitué et une courbe standard de 8 points est préparé par le protocole du fabricant. </li><li> Après lavage de la plaque après l&#39;étape de blocage, 50 pi de 1:2 plasma dilué est plaqué en double sur la plaque de test ELISA, et 50 pi de chaque norme est plaqué en double exemplaire. La plaque etincubée pendant une nuit à température ambiante sur un agitateur de microplaques à 300 RPM. </li><li> Le plasma dilué 01h02 est récupéré à partir de la plaque de HGF test ELISA et replacé dans le 1:2 plaque de source de plasma dilué. Le test ELISA est complété par le protocole du fabricant (avec des volumes corrigés des demi-puits) et la densité optique de chaque puits est lue en utilisant un lecteur de plaque ensemble à 450-570 nm, et les données enregistrées et analysées. </li></ol> 6. Jour 2 Expérience: élafine ELISA <ol><li> 10 ul de plasma non dilué sera transféré à une plaque nouvelle source, puis 190 ul de BSA à 1% dans 1 x PBS sera ajouté à chaque puits pour faire 200 ul de plasma 1:20 dluted. </li><li> L&#39;ELISA élafine interprété selon le protocole du fabricant (avec des volumes ajustés pour demi-puits), et la densité optique de chaque puits est lue en utilisant un lecteur de plaque fixé à 450-570 nm, et les données enregistrées et analysées. </li></ol> 7. Expérience Day 2: TNFR1 ELISA <ol><li> 25 pl de BSA à 1% dans du PBS sera ajouté à la plaque de source 1:20 (désormais contenant 100 pl de 1:20 plasma) pour obtenir 125 ul de 1:25 plasma dilué. </li><li> L&#39;ELISA TNFR1 est complété par le protocole du fabricant (avec des volumes corrigés des demi-puits) et la densité optique de chaque puits est lue en utilisant un lecteur de plaque fixé à 450-570 nm, et les données enregistrées et analysées. </li></ol> 8. Jour 2 Expérience: IL-8 ELISA <ol><li> 60 pl de 1:2 plasma dilué sera transféré sur une plaque nouvelle source, puis 180 ul d&#39;IL-8 diluant est ajouté à chaque puits pour faire une plaque de 01h06 dilué source de plasma. </li><li> L&#39;IL-8 ELISA est complété par le protocole du fabricant (avec des volumes corrigés des demi-puits) et la densité optique de chaque puits est lue en utilisant un lecteur de plaque fixé à 450-570 nm, et les données enregistrées et analysées. </li></ol> Une fois que tous les tests ELISA ont été réalisés, unused actions plasma sera remplacé dans les aliquotes décongelées et congelés pour une utilisation future.

<ol>
	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

<html> La méthode ELISA séquentielle présentée ici permet de mesurer des protéines plasmatiques multiples sur de petits volumes de plasma qui peuvent être difficiles à obtenir et / ou irremplaçables tels que des échantillons provenant de sujets humains atteints de maladies rares ou des échantillons de plasma provenant de souris 9,10. Les tests ELISA séquentiels sont généralement effectuées dans l&#39;ordre d&#39;un facteur de dilution de plasma augmente, avec les tests ELISA nécessitent plasma dilué ≥ 1:10 généralement pas besoin d&#39;être remis en état, même si cela peut être fait si désiré. La possibilité d&#39;effectuer séquentielle ELISA est limitée par des kits ELISA / protocoles dans lequel le plasma est mélangé avec d&#39;autres réactifs ou pour lesquels tampons de dilution différentes sont nécessaires pour le plasma, ce qui exclut la ablility de réutiliser un échantillon en raison de préoccupations qu&#39;un incompatibles tampon / réactif va interférer avec la performance d&#39;un test particulier. Avec une planification soigneuse, plus de 10 tests ELISA peuvent être effectuées sur le même échantillon de plasma. rents &quot;&gt; Les laboratoires peuvent avoir besoin d&#39;ajuster dilutions de plasma afin d&#39;avoir des résultats interprétables basés sur les concentrations plasmatiques attendues de la protéine d&#39;intérêt dans les échantillons provenant de sujets testés. différences dans l&#39;équipement de laboratoire peut entraîner la nécessité d&#39;optimiser l&#39;incubation et le développement colorimétrique fois, le nombre de lavages et / ou laver temps d&#39;immersion afin d&#39;optimiser toute donnée ELISA. Pour augmenter la capacité de haut débit et de précision et d&#39;effectuer des analyses d&#39;une manière rentable, l&#39;utilisation d&#39;une plate-forme de manipulation des liquides robotique capable d&#39;analyse sur plaques de 384 puits et un laveur de plaque automatique avec unité d&#39;empilage sont recommandés. Cet équipement peut augmenter l&#39;exactitude et la précision des analyses effectuées par plusieurs utilisateurs, et aider à assurer la cohérence de l&#39;analyse de réduire inter-et intra-laboratoires. Nous avons utilisé séquentielle ELISA sur des plateformes multiplex disponibles pour deux raisons: 1) La plupart despaires d&#39;anticorps pour de nouvelles protéines ne peuvent pas facilement être conjugués sur des billes ou tout autre matériel ainsi que le temps et coûteuse; 2) individuels tests ELISA sont plus précis que les puces à ADN multiplex ou perles, secondaire à une absence de réactivité croisée 11. Si une méthode fiable est établie pour effectuer multiplexés, perles à base de puces à ADN, il peut être en mesure de remplacer le processus séquentiel ELISA, mais peut être limité par la capacité de conjuguer les anticorps à des billes et / ou par le nombre de protéines, désireux de se analysés.

Aiguë du greffon contre l&#39;hôte (GVHD), une des principales causes de la non-récidive de mortalité (NRM) après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (HSCT), est mesurée par un dysfonctionnement dans trois systèmes d&#39;organes: la peau, le foie et gastro-intestinal (GI) voies 4. GVHD aiguë survient généralement entre deux et huit semaines après la greffe, mais peut survenir plus tard, et il est souvent impossible à distinguer cliniquement d&#39;autres complications post-HSCT tels que la toxicité du conditionnement, une infection ou des effets secondaires des médicaments. Grâce à l&#39;utilisation de stratégies protéomiques à haut débit et de validation en utilisant séquentielle ELISA, nous avons identifié 6 protéines dont les concentrations sont élevées au début des manifestations cliniques de GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF et de l&#39;IL-8, lorsqu&#39;il est combiné à un panneau de 4-biomarqueur peut diagnostiquer GVHD à l&#39;apparition des symptômes cliniques et peut prédire la survie post-greffe de CSH indépendamment de la gravité de la GVHD 1. Élafine, un biomarqueur de GVHD de la sken, peut faire la différence entre une éruption GVHD et une éruption cutanée à d&#39;autres causes telles que les éruptions de drogue et peut prédire la survie de greffe 2. Nous avons récemment identifié REG3α en tant que biomarqueur de la GVHD du tractus gastro-intestinal, l&#39;organe cible le plus associé à la GRN. Plasma REG3α concentration peut identifier de manière fiable GVHD comme la cause de la diarrhée post-greffe de CSH et en corrélation avec la sévérité de la GVHD histologique sur biopsies intestinales de diagnostic. Concentrations REG3α à GI GVH apparition peut également prédire la réponse au traitement et gestion des ressources naturelles GVHD 3. L&#39;incorporation de ces biomarqueurs validés GVHD dans les soins cliniques est actuellement à l&#39;étude dans des essais cliniques. Ces expériences ont été réalisées sur des aliquotes de plasma petites recueillies auprès des patients recevant HSCT entre 2000 et 2010 au moment de l&#39;apparition de GVHD qui sont irremplaçables et de quantité limitée. En raison de la nature précieuse de ces échantillons, nous avons développé un a rencontréhod de mesurer les concentrations de plusieurs protéines plasmatiques dans une manière efficace et reproductible pour éliminer l&#39;excès de gel-dégel, le temps de décongélation et l&#39;utilisation de plasma. Cette technique peut être appliquée pour effectuer les tests ELISA pour de multiples protéines / cytokines d&#39;intérêt sur le même échantillon (s) à condition que les échantillons n&#39;ont pas besoin d&#39;être mélangé avec d&#39;autres réactifs. Si kits ELISA ne viennent pas avec des plaques pré-enduites, de 96 puits demi-puits des plaques ou des plaques de 384 puits peuvent être utilisés pour réduire davantage l&#39;utilisation d&#39;échantillons / réactifs. Ce manuscrit se concentre sur les aspects technologiques de la mesure de biomarqueurs GVHD.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> L&#39;IL-2 R alpha Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> HGF humain Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> IL-8 humaine OptEIA KIT II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match MONTAGE humaines PAP1 (REG3α) Kit </td><td> MBL International </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match UNIVERSEL Kit </td><td> MBL International </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> Human Trappin-2/Elafin Duoset </td><td> R &amp; D Sydécoule </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> À 96 puits en polystyrène à fond conique </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249570 </td><td> Utilisé pour les plaques de source de plasma </td></tr><tr><td> Costar demi-haute et de liaison des plaques 96 puits </td><td> Corning </td><td> 3690 </td><td> Pour l&#39;IL-2Rα, HGF, TNFR1 et élafine ELISA </td></tr><tr><td> Nunc plaques de 384 puits MaxiSorp </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> Pour REG3α Elisa </td></tr><tr><td> HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum-albumine bovine Fraction V, choc subi un traitement thermique </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker BLOTTO dans du TBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37530 </td><td> Agent de blocage de l&#39;IL-2Rα HGF et TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td> DulbeccoTampon phosphate salin </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> Le tampon de lavage pour l&#39;IL-2Rα, HGF, élafine et TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td> Susbtrate peroxyde TMB </td><td> Kirkegaard et Perry Laboratories </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros Organics </td><td> 233362500 </td><td> Le tampon de lavage pour l&#39;IL-2Rα, HGF, élafine et TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td> Acide sulfurique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84720 </td><td> (Dilué à 2N) pour la solution d&#39;arrêt </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

Impartiales protéomique de découverte stratégies ont le potentiel d&#39;identifier un grand nombre de nouveaux biomarqueurs qui peuvent améliorer les tests de diagnostic et de pronostic dans un contexte clinique et peut aider à guider les interventions thérapeutiques. Lorsqu&#39;un grand nombre de protéines candidates sont identifiées, il peut être difficile de valider des biomarqueurs candidats en temps opportun et efficace des échantillons plasmatiques de patients qui sont event-driven, de volume fini et irremplaçable, comme au début de la réaction aiguë du greffon contre l&#39; greffon contre l&#39;hôte (GVHD), une complication potentiellement mortelle de l&#39;allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (HSCT). Ici, nous décrivons le processus d&#39;exécution ELISA disponibles dans le commerce pour six protéines validées GVHD: IL-2Rα 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, élafine 2 et REG3α 3 (également connu sous le nom PAP1) de manière séquentielle afin de minimiser cycles gel-dégel, Décongelés temps de plasma et de l&#39;utilisation du plasma. Pour cette procédure nous effectuons les tests ELISA dans un ordre séquentiel tel que déterminé par le facteur de dilution de l&#39;échantillon comme établi dans notre laboratoire en utilisant fabricant kits ELISA et protocoles avec des ajustements mineurs pour faciliter une performance optimale séquentielle ELISA. Les concentrations plasmatiques des marqueurs biologiques résultant peut ensuite être compilé et analysé des résultats significatifs au sein d&#39;une cohorte de patients. Bien que ces biomarqueurs sont actuellement à des fins de recherche uniquement, leur intégration dans les soins cliniques est actuellement à l&#39;étude dans des essais cliniques. Cette technique peut être appliquée pour effectuer les tests ELISA pour de multiples protéines / cytokines d&#39;intérêt sur le même échantillon (s) à condition que les échantillons n&#39;ont pas besoin d&#39;être mélangé avec d&#39;autres réactifs. Si kits ELISA ne viennent pas avec des plaques pré-enduites, de 96 puits demi-puits des plaques ou des plaques de 384 puits peuvent être utilisés pour réduire davantage l&#39;utilisation d&#39;échantillons / réactifs.

<html> Le workflow des biomarqueurs et le calendrier sont détaillées dans le tableau 1 et le tableau 2, respectivement. Une fois terminé, les concentrations de 6 protéines différentes ont été quantifiées sur le même échantillon de plasma en utilisant un total de 150 ul de plasma. L&#39;étalement des échantillons en double par test permet d&#39;assurance qualité interne, avec CV inférieur à 10% est optimal. Si vous effectuez la séquence ELISA sur des plaques multiples, conformément densités optiques de la norme élevée sont préférés et permettre une meilleure inter-plaques fiabilité des mesures; courbe standard DO peuvent être comparés entre les plaques de regarder pour évaluer la performance des incohérences dans ELISA (Figure 2). Les temps de développement en utilisant tétraméthylbenzidine substrat colorimétrique et une forte concentration DO observée pour chaque biomarqueur dans notre laboratoire sont énumérés dans le tableau 3. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figure 1 &quot;/&gt; Figure 1. Workflow pour l&#39;IL-2Rα, REG3α et le HGF ELISA. Après les échantillons de plasma ont été étalées sur des plaques de IL-2Rα test ELISA qu&#39;il ne soit récupéré pour fabriquer des plaques de source de dilution pour les tests ELISA autres. Pour le test ELISA HGF, le plasma est récupéré pour préparer la plaque de dilution 1:06 de l&#39;IL-8. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Densités optiques pour la courbe standard de 7 plaques ELISA différentes concentrations de mesure correspondant à REG3α les 1084 patients testés pour le rapport initial REG3α GI GVH biomarqueur 3. Conformément DO entre les plaques d&#39;assurer cohérence des mesures de concentration de protéines entre les plaques. Les concentrations de protéinesdans des échantillons de plasma sont calculés en comparant les densités optiques d&#39;échantillon pour les densités optiques courbe standard. <table border="1"><tbody><tr><td> 0 Jour expérience </td><td> 1. Préparer les échantillons </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Rα, HGF et REG3α capture Ab </td></tr><tr><td> 1 Jour expérience </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (par plaquage de l&#39;échantillon) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Élafine et TNFR capture Ab </td></tr><tr><td> Jour 2 Expérience </td><td> 1. HGF ELISA achèvement </td></tr><tr><td></td><td> 2. Élafine ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Recongeler utiliséplasma </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Aperçu GVHD workflow des biomarqueurs <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Jour 0 </td><td colspan="3"> La préparation des échantillons et nuit d&#39;incubation corps capture </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Élafine </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> Temps (h) </td><td> 0,0 </td><td> Blocage </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td> Les échantillons argentés, dorés </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td> Reclaim échantillons de plasma; Détection Ab </td><td> Blocage des échantillons; préparer (dilution 1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td> Les échantillons plaqués (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td> Streptavidine-HRP </td><td> Détection Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidine-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td> Plaque de lecture </td><td> TMB </td><td> Blocage des échantillons; Préparer la dilution (1:2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,5 </td><td></td><td> Plaque de lecture </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td> Les échantillons plaqués (1:2) </td><td> Capturez Ab (une nuit d&#39;incubation) </td><td> Capturez Ab (une nuit d&#39;incubation) </td><td></td></tr><tr><td> Jour 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Temps (h) </td><td> 0,0 </td><td></td><td></td><td> Reclaim plasma, Détection Ab </td><td> Blocage des échantillons; Préparer (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Placage échantillon (1:2) </td><td> Blocage; dilution supplémentaire des échantillons à une dilution 1:20 1:25 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> Placage échantillon (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td></td><td></td><td> Plaque de lecture </td><td> Détection Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Préparer les échantillons de dilution (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Détection Ab </td><td> Placage échantillon (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Plaque de lecture </td&gt; <td> HRP </td><td> Détection Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Plaque de lecture </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Lecture de plaque </td></tr><tr><td colspan="2"> Après l&#39;achèvement </td><td colspan="6"> Remplacer source de plasma en aliquotes et congeler pour une utilisation ultérieure </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Chronologie pour effectuer les tests ELISA. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Facteur de dilution du plasma </td><td> Haute Concentration du standard </td><td> Temps de développement substrat (min) </td><td> Haute OD </td><td> Courbe </td></tr><tr><td> IL-2Rα </td><td> 01:01 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> Linéaire </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01:02 </td><td> 4000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2,1 </td><td> 4-paramètre </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01:06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2,7 </td><td> 4-paramètre </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 01:10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1,7 </td><td> 4-paramètre </td></tr><tr><td> Élafine </td><td> 01:20 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1,9 </td><td> 4-paramètre </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 01:25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2,7 </td><td> Linéaire </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Détails ELISA pour 6 biomarqueurs GVHD.

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High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Validation à haut débit de biomarqueurs multiples peut être effectuée par ELISA séquentielle afin de minimiser les cycles gel / dégel et à utiliser des échantillons de plasma précieux. Ici, nous montrons comment réaliser de manière séquentielle ELISA pour six différents biomarqueurs plasmatiques validées<sup&gt; 03.01</sup&gt; La réaction du greffon contre l&#39;hôte (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; Sur le même échantillon de plasma.

Haut débit séquentiel ELISA pour la validation des biomarqueurs de réaction aiguë du greffon contre l&#39;hôte

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.7K vues.  University of Michigan. Validation à haut débit de biomarqueurs multiples peut être effectuée par ELISA séquentielle afin de minimiser les cycles gel / dégel et à utiliser des échantillons de plasma précieux. Ici, nous montrons comment réaliser de manière séquentielle ELISA pour six différents biomarqueurs plasmatiques validées 03.01 La réaction du greffon contre l'hôte (GVHD) 4 Sur le même échantillon de plasma.

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Une plate-forme à haut débit automatisé pour le développement de lignées cellulaires de fabrication des protéines thérapeutiques

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Recherche

Médecine

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

L&#39;énucléation des yeux de souris à distance pour le phénotypage à haut débit

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Séquentiel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des cellules souches / progénitrices ostéogéniques lors de la réparation de la fracture

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimal intervention chirurgicale invasive d&#39;induire un infarctus du myocarde chez des souris

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput Caractérisation des cellules souches adultes d&#39;ingénierie pour la livraison des facteurs thérapeutiques pour les stratégies neuroprotectrices

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

Détection de α-synucléine maladie associée par ELISA renforcée dans le cerveau de souris transgéniques surexprimant A53T humaine mutée α-synucléine

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Un système organotypiques à haut débit pour la caractérisation de la sensibilité des médicaments cellules du myélome multiple primaire

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

A High Throughput, multiplexée et ciblée protéomique CSF Assay à Quantifier neurodégénératifs Biomarqueurs et apolipoprotéine E isoformes Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

Étude In Vivo du métabolisme du Glucose à haute teneur en graisses régime chez les souris nourries avec épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) et Test de tolérance à l’insuline (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

PCR numérique pour quantifier les microARN dans l’infarctus aigu du myocarde et les maladies cardiovasculaires en circulation

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...