Research to Prevent Blindness, l&#39;assistance expérimentale de Takayuki Nagasaki; Cette recherche est conforme à la Déclaration ARVO pour l&#39;utilisation des animaux en ophtalmologie et de la recherche visuelle. KJW est financée par des subventions du NIH 5T32EY013933 et 5T32DK007647-20. VBM est soutenu par NIH K08EY020530.

1. Dispositifs pour assembler l&#39;injection sous-rétinienne <ol><li> Acheter ou fabriquer une aiguille 100 um de diamètre à partir d&#39;un tube capillaire en verre. Cela peut être fait manuellement à l&#39;aide d&#39;un extracteur de Sutter P-97 pipette ou tout autre équipement similaire. L&#39;extrémité du tube capillaire est chauffé et tiré jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne le diamètre souhaité (100 um). Une aiguille de diamètre plus petit peut être utilisé pour les vecteurs de thérapie génique, mais c&#39;est le diamètre recommandé pour l&#39;injection des cellules, sans endommager les cellules ou les yeux. Par rapport à aiguilles en acier, l&#39;aiguille capillaire en verre a une pointe très fine, mais émoussé, afin de permettre la visualisation de l&#39;injection de fluide et l&#39;accès à l&#39;espace sous-rétinien sans causer de bris de la rétine. Nettoyez ces aiguilles tiré si nécessaire à l&#39;aide d&#39;éthanol à 70%, et les entreposer dans un contenant stérile. Un plat de 15 cm stérile culture de tissu avec du ruban adhésif pour tenir les aiguilles en place est un moyen par lequel de garder les aiguilles d&#39;injection couvert et dans un environnement stérile. À ce stade, complEté la mise en place au sein de la salle d&#39;opération où la procédure aura lieu. Il est plus facile de garder tous les équipements de la salle de chirurgie en tout temps pour lui permettre de rester stérile, surtout si cette procédure est faite dans un établissement de barrière. </li><li> Aspirer de silicone dans l&#39;aiguille d&#39;injection et éjecter la silicone pour laisser un revêtement sur les parois internes de l&#39;aiguille. Le revêtement de silicone maximise le passage des cellules et des virus à travers l&#39;alésage d&#39;aiguille, qui, autrement, se coller aux parois de verre capillaire interne. </li><li> Obtenir une longueur d&#39;environ 8 cm de tube en plastique stérile en coupant une collection de sang 25 ¾ calibre réglé avec luer-lock au point directement après que l&#39;aiguille (retirer l&#39;aiguille de la tubulure). </li><li> Remplissez un 1 ml Sous-Q 26 5/8-gauge glissement embout de la seringue avec une solution saline stérile et retirer l&#39;aiguille de la seringue. </li><li> Fixer l&#39;aiguille d&#39;injection à l&#39;extrémité coupée du tube en plastique et fixer la seringue au Luer-Lok à l&#39;autrefin. </li><li> Aspirer une solution saline stérile pour remplir l&#39;espace vide dans la tubulure et aiguille capillaire, éjectant une solution saline à travers l&#39;aiguille afin de s&#39;assurer qu&#39;il est correctement fixé sans aucune fuite. Ensuite, aspirer une petite quantité d&#39;environ 1 microlitre d&#39;air, dans la pointe de l&#39;aiguille d&#39;injection. Cela séparer le sérum du fluide d&#39;injection et fournir un signal visuel indiquant la fin de l&#39;injection du fluide au cours de l&#39;intervention chirurgicale. Le dispositif d&#39;injection doit être maintenu sur une surface propre essuyés avec de l&#39;éthanol à 70% pendant l&#39;intervention chirurgicale. De plus, tout le matériel utilisé au cours de l&#39;intervention chirurgicale doit être nettoyé avant et après avec de l&#39;éthanol 70%, pour l&#39;exception des aiguilles d&#39;injection qui doit être conservé déjà stérilisé et prêt à l&#39;emploi. Ces aiguilles doivent être éliminés après la chirurgie, et non réutilisé. </li><li> Enfin, aspirer solution injectable contenant le vecteur désiré emballé thérapie génique virale ou les cellules souches. Cela peut être fait parprise de la solution d&#39;injection dans une pointe de pipette stérile, puis la solution de pipetage sur la surface d&#39;une boîte de culture cellulaire stérile. La solution peut maintenant être facilement aspiré dans l&#39;aiguille d&#39;injection à l&#39;aide de la seringue. Le montant nécessaire varie en fonction de l&#39;âge de la souris. Pour nos besoins, nous utilisons post-natales jour 5 souris, qui peuvent être injectés avec de 0,5 à 0,8 l de liquide d&#39;injection. De plus petites quantités, 0,5 pi ou moins, peuvent être utilisés pour souris plus jeunes et de plus grandes quantités, tels que 1 pl, peut être utilisé pour les souris adultes. Le titre viral ou le nombre de cellules doit être déterminée sur la base des virus / cellules étant injectés et leur tissu cible désiré, comme un trop grand nombre de particules virales ou de cellules dans un petit volume peut conduire à une toxicité pour les cellules de la rétine. Dans la vidéo, à des fins de visualisation, nous avons utilisé 1,5 pl, une plus grande quantité de colorant que nécessaire d&#39;injecter dans l&#39;œil. </li></ol> 2. Accès à l&#39;espace sous-rétinien <ol><li> Dans la salle chirurgicale stérile,stabiliser ou anesthésier la souris selon le protocole de manipulation des animaux approuvés localement, qui varient selon l&#39;âge de la souris. Anesthésie commun pour les souris adultes inclut l&#39;utilisation du gaz isoflurane ou une injection intra-péritonéale de 0,1 poids corporel ml/10g de kétamine (100 mg / ml) et de xylazine (20 mg / ml) dans une solution saline stérile. Pour les souris périnatales, les techniques d&#39;anesthésie communs incluent l&#39;utilisation du gaz isoflurane ou cryoanesthesia (hypothermie). Toutes les techniques d&#39;anesthésie doit être approuvé par le comité IACUC locale avant utilisation. Nous utilisons généralement post-natal jour (P) 5 souris, bien que des techniques similaires peuvent être appliquées à des souris dès l&#39;âge de P0 ou à des souris adultes. L&#39;intervention chirurgicale ne peut pas commencer tant que la souris a cessé bouger les membres et ne répond plus aux pieds pincées. Pour les souris périnatales, ils deviendront nettement plus légers en couleur depuis le flux sanguin va ralentir, une autre clé pour savoir qui ils sont entièrement sous anesthésie. </li><li> Chez les souris périnatales, utilisez des ciseaux Vannas droites à mefforcer d&#39;environ 1,5 mm incision le long de la fissure couvercle fermé. Veillez à couper à la mise en retrait, où l&#39;œil va naturellement ouvrir à l&#39;avenir. Cela garantit que les couvercles va guérir et ouvrir correctement lors de l&#39;élaboration de la souris. Une lame chirurgicale peut être utilisé à cette fin, même si nous préférons ciseaux Vannas car ils réduisent le risque de perforation de l&#39;œil au cours de cette procédure. Dans la vidéo, les ciseaux ont été utilisés pour percer et couper directement le long de la marge de la paupière. Lors de l&#39;apprentissage de cette technique, pince doit être utilisé pour soulever la paupière avant de couper et de réduire le risque d&#39;endommager l&#39;œil. </li><li> Séparez les paupières avec pinces à pansement courbes pour proptose l&#39;œil et pincer les paupières légèrement en dessous de l&#39;oeil pour le maintenir proptosed pour injection. Si l&#39;incision couvercle faite en deux étapes est trop grande, l&#39;œil de retomber sous les paupières et éviter une exposition adéquate au cours de la procédure d&#39;injection. Pour les souris adultes, en appliquant une légère pression autour de l&#39;œil avec le dresser pince peut tenir l&#39;œil proptosed pour injection. </li><li> Faire une petite incision sclérale postérieure à ou à l&#39;équateur du globe en grattant la surface avec une lame de microchirurgie de 15 degrés. Cette incision doit être juste assez grande pour passer la pointe de l&#39;aiguille d&#39;injection, mais pas plus que cela. Si l&#39;on préfère, une petite aiguille pointue comme une aiguille d&#39;acupuncture peut être utilisée pour faire cette incision dans l&#39;espace sous-rétinien au lieu de la lame de microchirurgie. Chez les animaux pigmentation foncée, d&#39;un brun foncé à pigmentation des tissus (la choroïde-rétine épithélium pigmentaire) deviendra visible au point d&#39;incision. En plus légers souris albinos ou pigmentées, un stylo de marquage chirurgical peut être appliqué à la pointe de la lame de microchirurgie à laisser une tache d&#39;encre indiquant le site d&#39;incision. Si claires reflux de liquide (vitré) du site d&#39;incision, la lame a été placée trop profondément et entra dans la cavité vitréenne et le virus thérapeutique ou cellules peuvent entrer dans l&#39;espace lors de l&#39;injection intravitréenne. Pour visualizatisur les fins, nous avons fait l&#39;incision sur ce point dans la vidéo. Il est encore possible de remplir une injection sous-rétinienne dans ce cas, toutefois, le décollement de la rétine causée par la présence du fluide d&#39;injection ne peut pas guérir complètement de cette souris. Par conséquent, des précautions doivent être prises pour ne couper que la surface externe de l&#39;œil et non à travers la rétine avant l&#39;injection. </li><li> Soigneusement insérer l&#39;aiguille d&#39;injection dans le site d&#39;incision et de faire avancer ce parallèlement à la paroi externe de l&#39;œil de pénétrer dans l&#39;espace sous-rétinien. Avancer trop près de la paroi extérieure ou trop profondément dans l&#39;œil dirigera l&#39;injection dans le mauvais endroit. La meilleure méthode pour comprendre si l&#39;aiguille est dans la position correcte consiste à pratiquer la technique. Pratiquer sur des souris albinos ou légèrement pigmentées peuvent aider à faire des injections précises et exactes dans l&#39;espace sous-rétinien. C&#39;est parce que le fluide d&#39;aiguille et l&#39;injection est visible dans ces yeux. </li><li> Appliquez une légère pression sur le piston de la seringue et êtregin injection du fluide désiré. Si l&#39;aiguille est correctement placée dans l&#39;espace sous-rétinien, contre-pression modérée se fera sentir. Si l&#39;aiguille se trouve dans le corps vitré, il y aura beaucoup moins de contre-pression et éventuellement certains reflux de fluide lors de l&#39;injection. S&#39;il ya contre-pression importante, maintenir l&#39;aiguille en place depuis au moins 15 secondes supplémentaires avant de retirer l&#39;aiguille lentement. Cela permettra à la haute pression intra-oculaire pour égaliser au lieu de reflux du virus injecté ou cellules vers le site de l&#39;incision. Partie de l&#39;air et de solution saline peut être injecté dans l&#39;espace sous-rétinien dû à l&#39;augmentation de la pression nécessaire au cours de la procédure d&#39;injection. Il faut prendre soin de ne pas trop injecter de l&#39;air ou de sérum physiologique, car il peut éliminer le virus injecté ou des cellules de l&#39;œil. Il est également possible de provoquer un décollement de rétine permanente de la présence de trop de liquide injecté dans l&#39;espace sous-rétinien. Aux fins de visualisation, la teinture et de l&#39;air a été injecté into la sous-rétinien dans l&#39;espace vidéo. Il peut être clairement vu comment certains de colorant seront évacués de retour de l&#39;espace sous-rétinien si trop est injecté, mais aussi comment la bulle d&#39;air reste dans l&#39;espace sous-rétinien et ne disparaît pas dans le corps vitré. Il a été utilisé pour souligner que ces injections étaient tous dans l&#39;emplacement correct de l&#39;œil, si l&#39;on peut visualiser comment l&#39;aiguille doit entrer dans le site de l&#39;incision. Toutes les injections dans l&#39;espace sous-rétinien de provoquer un décollement de la rétine temporaire en raison de la présence du fluide d&#39;injection. Si la procédure d&#39;injection est correctement rempli, ce détachement temporaire rétine va guérir dans les 24 heures et la souris peut être utilisée pour toutes les autres expériences. L&#39;œil peut rester doux pendant environ une semaine en raison de l&#39;intervention chirurgicale, donc une deuxième injection doit être évitée au cours de cette période de temps. </li><li> Pour souriceaux nouveau-nés, utilisez les pinces à pansement courbes pour pousser doucement les yeux derrière les paupières et dans l&#39;orbite. Il peut être utileattendre une minute afin de permettre au virus de s&#39;installer dans l&#39;espace sous-rétinien et non l&#39;amener à être évacuée du site d&#39;incision quand poussant doucement l&#39;œil en arrière sur son orbite. Après la chirurgie, une goutte de bupivacaïne à 0,5% (marcaïne) diluée à 0,25% dans une solution saline stérile à partir d&#39;une aiguille de calibre 25 peut être placé sur le site d&#39;injection. Les souris ne présentent pas de signes évidents de détresse après la chirurgie sous-rétinienne et l&#39;utilisation de la bupivacaïne comme un analgésique à action prolongée actualité a été suffisant pour les trois années précédentes. Les souris doivent toujours être surveillés après l&#39;intervention chirurgicale pour rechercher des signes de détresse; telles que l&#39;infection, une enflure ou une diminution dans les activités journalières habituelles de la souris. Si ceci se produit, le vétérinaire doit être notifié et d&#39;autres médicaments contre la douleur tels que la buprénorphine (0,05 mg / kg) peut être administré par injection intrapéritonéale. </li><li> Réveillez la souris de l&#39;anesthésie selon le protocole de manipulation des animaux approuvée localement. La souris doit être maintenu sur une p chauffageannonce à maintenir la température normale du corps car il se réveille de l&#39;anesthésie. La procédure chirurgicale devrait prendre moins de cinq minutes à remplir, sans compter le temps de la souris pour subir une anesthésie. Par conséquent, un coussin chauffant n&#39;est pas nécessaire lors de la procédure proprement dite, mais il peut être nécessaire alors que l&#39;on apprend la technique que la procédure pourrait prendre une plus longue durée de temps. La souris ne doit pas être remis dans une cage propre jusqu&#39;à ce qu&#39;il a commencé à se déplacer tout seul. Pour les nouveau-nés, pincées orteils doux aidera pour eux de se remettre complètement de l&#39;anesthésie, et ils devraient retrouver leur couleur rose et le mouvement avant d&#39;être remis à la mère. Les souris doivent être suivies dans le temps pour détecter tout signe de détresse comme indiqué précédemment. </li></ol>

<ol>
	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Cette technique vidéo fournit des instructions sur l&#39;achèvement de la procédure chirurgicale injection sous-rétinienne avec succès, et veiller à ce que le vecteur de thérapie génique ou les cellules souches sont placés dans l&#39;emplacement nécessaire pour traiter efficacement la maladie ophtalmique. Cette technique permet le ciblage des cellules de la rétine comme l&#39;EPR ou photorécepteurs, car il place les vecteurs de thérapie génique ou de cellules souches dérivées de tissus dans le voisinage ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 0,8 à 1,10 x 100 mm Tube capillaire (verre) </td><td> Kimble Glass, Inc </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipette Puller </td><td> Instrument Sutter </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge peut être utilisé à la place. Catalogue MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td> Silicone </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline Dubecco de chlorure de calcium et chlorure de magnésium </td><td> Gibco Invitrogen- </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Lok 25 3/4G x 12 &quot;; de prélèvement sanguin </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Sous-Q 265/8G Slip-Tip Syringe </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 à 10 ul Finnpipette II-Volume réglable Pipette </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 ul Conseils naturelles biseautés </td><td> USA Scientific, Inc </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 Microscope stéréo </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Style de traité vaisselle culture cellulaire Polystyrène </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux Vannas droites </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> Curved Forceps Dressing avec des dentelures délicates </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 Couteau microchirurgie Degré </td><td> Wilssur ophtalmique Corp </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> La kétamine </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Laboratoires Lloyd </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> La bupivacaïne (Marcaïne) </td><td> AstraZeneca </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> La buprénorphine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

La perte de la vue affecte environ 3,4 millions de personnes aux États-Unis et devrait augmenter dans les années à venir. 1 Récemment, la thérapie génique et les transplantations de cellules souches sont devenus les principaux outils thérapeutiques pour le traitement de la cécité due à des maladies dégénératives rétiniennes. Plusieurs formes de transplantation autologue pour la dégénérescence maculaire liée à l&#39;âge (DMLA), comme l&#39;iris pigment transplantation de cellules épithéliales, ont généré des résultats encourageants, et les essais cliniques humains ont commencé pour d&#39;autres formes de thérapies cellulaires de gènes et la tige. 2 Il s&#39;agit de remplacement de gène RPE65 chez des patients souffrant amaurose congénitale de Leber et une greffe de cellules RPE en utilisant de l&#39;homme souches embryonnaires (ES) cellules dans la maladie de Stargardt. 3-4 Maintenant qu&#39;il ya des vecteurs de thérapie génique et les cellules souches disponibles pour le traitement de patients atteints de maladies rétiniennes, il est important de vérifier ces thérapies potentielles dans les modèles animaux avant d&#39;appliquertion entre eux dans les études humaines. La souris est devenue un modèle important scientifique pour tester l&#39;efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique et de la transplantation de cellules souches dans l&#39;œil. 5-8 Dans cet article, vidéo, nous présentons une technique pour injecter des vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;espace sous-rétinien de l&#39;œil de la souris tout en minimisant les dommages aux tissus environnants.

Un dessin de l&#39;oeil de la souris est démontré à de grandes structures étiquetées à titre de référence, avec des flèches montrant les emplacements pour les procédures d&#39;injection intravitréenne et sous-rétinien tant chirurgicales (pointes de flèches, figure 1). Vecteurs de thérapie génique, tels que le vecteur lentiviral lacZ (figure 2), peut être injecté à l&#39;aide de ces endroits. En outre, les cellules souches, comme les cellules souches embryonnai...

Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Cette technique chirurgicale illustre l&#39;injection de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;espace sous-rétinien de l&#39;oeil de la souris.

Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l&#39;œil de la souris

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

32.9K vues.  Columbia University. Cette technique chirurgicale illustre l'injection de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'espace sous-rétinien de l'oeil de la souris.

Vidéo: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

Haute-efficacité de la transduction des cellules cancéreuses du foie par recombinants sérotype virus adéno-associé 3 Vecteurs

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Recherche

Médecine

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Création et propagation des tumeurs de l&#39;homme en rétinoblastome immunitaire chez les souris déficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

Production et détection d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) dans les cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Une nouvelle approche chirurgicale pour l&#39;administration intratrachéale d&#39;agents bioactifs dans un modèle de souris fœtale

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Décollement de la rétine modèle chez les rongeurs par injection sous-rétinienne de hyaluronate de sodium

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

Transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs purifiées par MACS dans la rétine adulte de la souris

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Exécution sous-rétinienne injections chez les rongeurs de produire des cellules de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Élaboration d&#39;un modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral adéno-associé recombinant

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

A l&#39;étape par le protocole de l&#39;étape pour la chirurgie sous-rétinienne chez les lapins

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...