Ce travail a été soutenu par le NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) et des subventions du NIH AR052785 AR046786 et (AEO et W. MW).

1. Préparer 0 à 2 jours Vieux souriceaux nouveau-nés pour la peau Dissection <ol><li> Euthanasier les chiots de souris en utilisant une chambre de CO 2 pendant au moins 20 min. Laisser petits sur la glace jusqu&#39;à une heure jusqu&#39;à ce que la dissection. P0-P2 souris est fortement recommandé que les cellules préparées à partir de souris plus âgées ont réduit la capacité de progéniteurs qui se traduit par une baisse des rendements greffés. Préparer un plat d&#39;éthanol à 70% (pour l&#39;étape 1.3) et trois plats de solution de lavage (pour l&#39;étape 3) lorsque vous êtes prêt à effectuer la dissection peau. Décongeler Solution Dispase et le laisser à 4 ° C. Col de l&#39;utérus disloquer petits après une surexposition CO 2 afin d&#39;assurer l&#39;euthanasie. </li><li> Placez chiots euthanasiés dans une boîte de culture sur la glace et le transfert à une hotte à flux stérile. </li><li> Laver les chiots par une brève immersion dans l&#39;éthanol à 70% et le placer sur boîte de Pétri stérile. </li></ol> 2. Disséquer la peau de souris <ol><li> Couper chaque branche et de la queue à la base du tronc avec des ciseaux stériles. </li><li> Saisir fermement le corps entre une paire de Cupince rved et faire une incision le long de la peau du dos, de la tête à la queue à l&#39;aide d&#39;un scalpel, sans pénétrer le fascia sous-jacent. </li><li> Retirer délicatement la peau loin de la ligne médiane de la souris. </li><li> Saisissez la souris exposée fermement avec le côté long de la pince courbes et insérez une autre paire de pinces courbées sous la peau à l&#39;extrémité postérieure de la souris et tirez doucement la peau sur les hanches vers la moitié ventrale de la souris. </li><li> Retirer délicatement la peau complètement à côté de la souris dans un mouvement fluide et jeter la carcasse. </li></ol> 3. Laver la peau et incuber avec la solution de dispase <ol><li> Placer la peau dans le premier plat de la solution de lavage avec le derme vers le bas. Étaler la peau sur et agiter avec une pince. Laisser la peau dans le premier plat de la solution de lavage tout en disséquant la peau prochaine. </li><li> Après avoir placé la peau à côté découpé dans le premier plat de la solution de lavage, transférer la peau avant le deuxième plat de solution de lavage. Gardez peaux èmesolution e second lavage jusqu&#39;à ce que toutes les peaux sont collectées. Transfert de toutes les peaux pour le lavage final, agiter brièvement. </li><li> Ajouter 10 ml Dispase glacée à une boîte de culture stérile de 10 cm. Transfert peau pour la solution de dispase et aplatir la peau derme vers le bas. </li><li> Float peau pour 8-16 heures à 4 ° C (option alternative: 1 heure à 37 ° C). </li></ol> 4. Derme et de l&#39;épiderme séparé <ol><li> Transfert à la peau une boîte de culture stérile nouveau et aplatir la peau derme vers le bas. Soigneusement maintenez le derme d&#39;un coin avec un scalpel. </li><li> Saisissez l&#39;épiderme avec une pince et lentement se détacher de la derme. Épiderme devrait décoller en une seule pièce. L&#39;épiderme est blanc et fin et le derme doit être brunâtre, épais et gélatineux. </li><li> Séparez les deux tissus distincts dans des boîtes de culture stériles. <ol class="lalpha"><li> Pour effectuer un gène spécifique cutanée knockdown / surexpression du greffon, prenez le derme et l&#39;émincer en très petits morceaux avec tscalpels wo. Jeter épiderme. Le jour de l&#39;infection (étape 7), disséquer une autre série de peaux de souris pour préparer frais, non traités cellules épidermiques à combiner avec lentiviral cellules infectées par voie cutanée. </li><li> Pour faire un épiderme gène spécifique knockdown / surexpression du greffon, couper chaque épiderme dans 6 à 8 petits morceaux. Jeter derme. Le jour de l&#39;infection (étape 7), disséquer une autre série de peaux de souris pour préparer frais, non traités cellules dermiques à combiner avec lentiviral infectées par les cellules épidermiques. </li></ol></li></ol> 5. Dissocier les cellules de souris primaire de la peau (MDC) à partir de tissus hachée <ol><li> Dissocier mDC par incubation de pièces dermiques avec la solution de collagénase fraîchement préparé à 37 ° C pendant 1 heure. Utilisez 10 ml de solution de collagénase par souris nouveau-nés. </li><li> Mélanger doucement le derme solution contenant toutes les 10 min. Vérifiez la mesure de la dissociation sous un microscope; la suspension cellulaire doit être digéré cellules plupart des célibataires. La solution doit passer de clair à nuageux,les cellules dermiques sont dissociés du derme. </li><li> Ajouter FBS à la solution contenant la collagénase derme pour un volume de 10% final de réduire l&#39;activité de la collagénase. </li><li> Passez la suspension de cellules à travers un tamis 70 pm cellule dans un nouveau tube de 50 ml pour éliminer de grandes touffes non digérés et les follicules entiers. Ajouter 10 ml de FBS DMEM/10% par 30 ml de la accréditives afin de diluer la collagénase. </li><li> Tubes à centrifuger contenant derme digéré à 30 xg sur une centrifugeuse de paillasse pendant 5 minutes pour éliminer davantage de follicules entiers. </li><li> Transférer délicatement le surnageant dans un nouveau tube de 50 ml. Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 xg sur une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec FBS DMEM/10% (1 ml par chiot) et compter les cellules. Cellules de la plaque avec Amniomax C-100 médias de l&#39;infection (étape 7), ou à combiner avec des lentivirus infectées par KC pour le greffage (étape 9). Rendement typique est de 20 x 10 6 cellules par chiot. </li></ol> 6. Dissocier les kératinocytes primairess (KC) à partir de tissus hachée <ol><li> KC dissociable par incubation avec des morceaux épidermiques fraîchement décongelée 0,05% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 15 min. Utilisez 7 ml de trypsine-EDTA par souris nouveau-nés. </li><li> Solution agiter doucement l&#39;épiderme contenant toutes les 5 min. </li><li> Ajouter un volume égal de solution de neutralisation à Trypsine-EDTA contenant épiderme pour réduire l&#39;activité de la trypsine. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 xg sur une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min. Ce tissu non digérée doit flotter sur le dessus. </li><li> Versez délicatement la majeure partie de l&#39;surnageant avec du tissu non digéré. Retirer le surnageant restant avec une pipette de 10 ml sans cellule inquiétant granulés. Resuspendre culot de cellules avec du PBS. En KCs cas ne sont pas complètement granulés, verser la majeure partie du surnageant et répéter jusqu&#39;à ce que la centrifugation plupart des cellules sont culottées. </li><li> Filtrer suspension cellulaire à 70 um tamis cellulaire dans un nouveau tube pour enlever le tissu restant ou grumeaux. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugationà 200 xg sur une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min. </li><li> Resuspendre les cellules dans CnT-07 des médias ou de PBS (1 ml par chiot) et des cellules de comptage. Utilisez CnT-07 pour étalement des cellules de l&#39;infection (étape 7), utilisez PBS à combiner avec les lentivirus infectés mDC pour le greffage (étape 9). Rendement typique est de 3-10 x 10 6 cellules par chiot. </li></ol> 7. Infecter les cellules primaires avec des lentivirus contenant shRNA ou d&#39;ADNc Le jour de l&#39;infection disséquer un autre ensemble de peaux de souris pour préparer fraîches, non traitées KCs primaires ou PID pour combiner avec les cellules infectées à jour de la greffe (étape 9). <ol><li><ol class="lalpha"><li> Pour mDC, plaque 4 x 10 6 mDC par plaque de 10 cm avec AmnioMAX-C100 médias et incuber à 37 ° C + 5% de CO 2 pour l&#39;infection lendemain à la densité cellulaire de 50%. Plaques habituellement 3-4 de mDC sont utilisés pour générer un greffon, et un total de 10-12 plaques sont nécessaires pour générer trois greffes dans une expérience. Sinon, laissez-mDC attacher et de répandre fou un minimum de 2 heures à 37 ° C + 5% de CO 2 et suivez l&#39;infection, le jour même de placage cellule. mDC aura des fibroblastes-like morphologie. </li><li> Pour KC, plaque de 12 x 10 6 par KC 10 cm plaque avec le CNT-07 médias et incuber à 37 ° C + 5% de CO 2 pour l&#39;infection lendemain. Sinon, laissez-KC fixer et de diffuser un minimum de 2 heures à 37 ° C + 5% de CO 2 et suivez l&#39;infection, le même jour. Plaques habituellement 3-4 de KC sont utilisées pour générer une greffe. Un total de 10-12 plaques sont nécessaires pour générer trois greffes pour une expérience. KCS ont une morphologie pavés. </li></ol></li><li> Préincuber cellules de 5-10 min avec 8 pg / ml Solution Polybrene à 37 ° C + 5% de CO 2. </li><li> Média d&#39;échange et d&#39;ajouter lentivirus + 8 pg / ml Solution Polybrene. Lentiviral titre variera en fonction de la construction utilisé et doit être déterminé avant l&#39;infection. </li><li> Centrifuger les plaques à 200 xg sur une centrifugeuse de paillasse pendant 1 heure à 32 °, C pour infecter des cellules avec des lentivirus. </li><li> Retirer lentivirus contenant médias et ajouter du milieu frais. Pour KC, laver les cellules une fois avec du PBS avant d&#39;ajouter des fichiers multimédia fraîches. Cellules infectées Habituellement récupérer une nuit à 37 ° C + 5% de CO 2. Sinon, attendez au moins deux heures de récupération à 37 ° C + 5% CO 2 avant trypsinisation des cellules pour les greffes. Continuer à la culture une petite partie des cellules infectées pour vérifier l&#39;efficacité infection tel que décrit dans la section Représentant résultats. </li></ol> 8. Préparer les cellules infectées par greffage <ol><li> Isoler frais mDC primaires ou KCS de la peau en utilisant les étapes 4-6. Resuspendre les cellules dans du PBS glacé stérile. Compter les cellules. </li><li><ol class="lalpha"><li> Pour cutanée gène knockdown / surexpression du greffon spécifique, dissocier mDC infectés à partir de plaques en utilisant 0,05% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 8 min. </li><li> Pour épidermique gène knockdown / surexpression du greffon spécifique, dissocier KC infectés à partir de plaques using 0,125% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 15 min. </li></ol></li><li> Neutraliser l&#39;activité de la trypsine en utilisant FBS DMEM + 10% (MDC) ou d&#39;une solution de neutralisation (KC). Transférer les cellules trypsinisées un tube de 50 ml. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 xg sur une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min. </li><li> Resuspendre les cellules dans du PBS glacé stérile. Compter les cellules. </li><li> Combinez les cellules infectées par le virus avec le type fraîchement préparé homologue non traitée cellule. Pour une greffe, combiner 7-10 x 10 6 mDC avec 7-10 x 10 6 KCs dans du PBS glacé et stérile culot de la suspension de cellules dans une centrifugeuse de paillasse à 4 ° C. Resuspendre les cellules dans 50 -100 ul glacée PBS stérile. Gardez les cellules sur la glace jusqu&#39;à ce nu / nu souris chambres sont prêtes. </li></ol> 9. Créer lit de la plaie et de la Chambre Fix sur Retour de nu / nu souris Une journée avant la greffe, stériliser les instruments chirurgicaux avec les chambres de silicium autoclave et stérile par trempage dans de l&#39;éthanol à 70%. Remplacer l&#39;étha 70%nol avec du PBS stérile avant d&#39;utiliser les chambres. <ol><li> Anesthetize nu / nu souris (7-12 femelles semaines d&#39;âge) en utilisant la kétamine (8 mg / ml) / xylazine (1,6 mg / ml) par injection intrapéritonéale (100 μl/10 g de poids corporel) ou autre méthode préférée. Appliquer du lubrifiant oculaire. Lieu coussin chauffant sous la souris. </li><li> Désinfecter la peau nue arrière de la souris avec de l&#39;iode et le nettoyer avec des tampons d&#39;alcool. </li><li> Ajouter 1-3 gouttes bupivicaïne 0,25% à site de l&#39;incision par voie topique. Pincer la peau de souris nue de retour à la base du cou avec une pince. </li><li> Découpez un petit trou circulaire (~ 1 cm de diamètre) dans la peau pincée avec des ciseaux stériles. </li><li> Placez chambre stérile sur le lit de la plaie et couvrir les bords de la chambre avec la peau environnante. </li><li> Chambre sécurisée en place avec des sutures le long des bords de la chambre (6 points par chambre) comme indiqué sur la figure 2A. </li><li> Lorsque chambres sont prêtes, doucement suspension de cellules de turbulence et d&#39;élaborer en 23 aiguille de la jauge fixée à une seringue de 1 ml. Si suspension cellulaire a condensé en bas, doucementremettre en suspension avec 1 embout de pipette ml avant de tirer dans l&#39;aiguille. </li><li> Chambre de ponction avec une aiguille et lentement goutte à goutte sur les cellules de la plaie. </li><li> Souris placer dans des cages propres, autoclavés. Maison 2 souris par cage et ajouter des antibiotiques et des Tylenol (3 mg / ml) à de l&#39;eau potable. Dans notre expérience, deux souris femelles par cage n&#39;ont pas abouti à un traumatisme défavorable à la chambre, greffe, ou des animaux. </li><li> Placez le coussin chauffant moins de la moitié de la cage et observer souris jusqu&#39;à ce que l&#39;anesthésie se dissipe. </li></ol> 10. Retirer Chambre Après 7-9 jours <ol><li> Anesthésier chambré nu / nu souris comme à l&#39;étape 9.1. Appliquer du lubrifiant oculaire. </li><li> Désinfectez la peau autour de la chambre avec de l&#39;iode et le nettoyer avec des tampons d&#39;alcool. </li><li> Découpez soigneusement points et retirer de la chambre. </li><li> Retirez délicatement la chambre de la souris. Si de nouveaux bâtons de greffes de peau à la chambre, lever une partie de la chambre et du greffon doucement séparé de la chambre à l&#39;aide de pinces. Maintenir vers le bas lors de l&#39;enlèvement de greffage de la chambre. Greffe devrait toilettesk terne et opaque comme dans la figure 2B. </li><li> Appliquez une compresse non adhérente d&#39;une mince pellicule d&#39;antibiotiques sur la plaie ouverte et suture en place (2 points). </li><li> Enveloppez bandage autour de la souris pour fixer le tampon et protéger la plaie. Suturer pansement en place. </li><li> Les chambres de silicium sont nettoyés en les frottant avec du savon doux et rincer abondamment avec de l&#39;eau déminéralisée. Faire tremper les chambres de l&#39;éthanol à 70% pendant la nuit, l&#39;air sec, et à stocker. </li></ol> 11. Examinez la souris pour la croissance des cheveux <ol><li> Retirer pansements et tampons après 3 jours de retrait de chambre. Greffe doit être sec et opaque à une couleur brune. </li><li> Vérifiez périodiquement souris pour la croissance des cheveux. Les cheveux doivent commencer à montrer moins 16 jours après la greffe. </li></ol> Aperçu des méthodes d&#39; Jour 1 (2-3 h): Sacrifiez les nouveau-nés, enlever la peau, et laissez dispase à 4 ° C pendant la nuit. Jour 2 (2-3 h): Isoler les cellules primaires de la peau etplaque à une densité cellulaire recommandée. Jour 3 (3-4 h): infecter les cellules avec des lentivirus. Enlever la peau d&#39;un autre ensemble de nouveaux-nés et de laisser le dispase à 4 ° C pendant la nuit. Jour 4 (6-8 h): Isoler les cellules primaires de peau, compter, et laisser sur la glace. Récupérer lentivirus cellules infectées par la trypsine et centrifugation, compter, et de combiner 7-10 x 10 6 cellules dermiques et les kératinocytes dans 50-100 pi de PBS par greffe. Créer lit de la plaie sur la souris, fixez chambre, et appliquer le mélange de cellules à lit de la plaie. Procédure Alternative Présente Contours procédure alternative sera de raccourcir la procédure de quatre jours à trois. <ol><li> Combinez les jours 1 et 2 par le traitement des peaux de souris dans la dispase à 37 ° C pendant une heure (h heure 5-7). </li><li> Combinez Jour 2 et Jour 3 par infection de cellules avec des lentivirus après étalement des cellules pendant deux heures (heure de temps estimé 5-7). </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Essais de reconstitution de coiffure fournir un modèle de régénération organe unique d&#39;examiner le mécanisme de la formation de novo follicule pileux. Ici, nous décrivons un essai de chambre modifié cheveux utile pour déterminer la fonction des gènes dans la formation du follicule pileux. Notre test est basé sur l&#39;analyse reconstitution chambre cheveux signalé 5, 6,11, ce qui nous modifiée pour introduire une technique d&#39;expression lentiviral pour atteindre la surexpression du gène ou effet de choc soit dans les types de cellules dermiques ou épidermiques. Notre analyse offre une alternative rapide à générer tissu-spécifique KO génétique. Ce test nous permet de démontrer la fonction des gènes dans la formation des follicules pileux en aussi peu que trois semaines d&#39;infecter les cellules primaires avec des lentivirus à la collecte de greffe. Notre analyse peut être étendue pour traiter les interactions génétiques utilisant combinaison shRNA / livraison ADNc par lentivirus dans un type de cellule 12, ainsi que permet l&#39;examen de la signalisation entre le typ de cellules dermiques et épidermiqueses. Notre analyse des cheveux est le mieux adapté pour la détection de fortes phénotypes de gain ou de perte-de-fonction dans la régénération du follicule pileux, tandis que les défauts subtils sont plus difficiles à observer. Nous avons démontré avec succès la fonction cutanée gène spécifique de quelques gènes à l&#39;aide de notre test régénération des cheveux 1,12. Basé sur le marqueur GFP co-exprimé à partir du vecteur lentivirus exprimant shRNA 10, nous avons démontré que l&#39;expression de shRNA cellules du donneur dermiques persisté dans les greffes de cheveux régénérés. Cellules GFP-positives étaient présents dans la papille dermique (DP) des follicules pileux régénérées (figure 3). Les cellules DP probablement composé de différents niveaux d&#39;inactivation génique comme cellules expriment des niveaux variables de la GFP, donc le phénotype observé cheveux follicule est une gamme de génétique hypomorph à null. Une amélioration pour ce test sera d&#39;établir une sélection rapide et efficace pour les cellules exprimant shRNA élevés avant Grafting telles que l&#39;utilisation FACS pour purifier fortes cellules exprimant la GFP. Une alternative est de remplacer les cellules mutantes déficientes ou conditionnelle dans cet essai 9. D&#39;autre part, un système de culture qui peut préserver la fonction des cellules DP est très utile en tant que puissance DP est progressivement perdue dès que les cellules dermiques primaires sont passées. Systèmes de culture possibles comprennent l&#39;utilisation de biomatériaux dérivés de niche artificielle ou de cultures d&#39;agrégation 2,7,8,13. Une autre amélioration consiste à générer une méthode fiable épidermique gel cellule avec un taux de récupération élevé de cellules car cela permettra de réduire l&#39;utilisation de la deuxième série de souriceaux (étape 7) pour générer des kératinocytes fraîches dans cutanée spécifique de perte ou de gain de études de la fonction. Ce dosage cheveux chambre de produit de densité follicule pileux et une qualité similaire à la peau de souris normale, bien que la croissance des cheveux est légèrement moins synchronisée et l&#39;orientation follicule est plus aléatoire. A quelques limitations du test génétique régénération des cheveux inclus,e l&#39;exigence d&#39;une grande quantité de lentivirus et le nombre de cellules, et c&#39;est un travail très intensif en termes de méthodes chirurgicales par rapport à d&#39;autres formes d&#39;essais de reconstitution de cheveux tels que le patch et analyses rabat 3,4,14. Cependant, la qualité des follicules pileux et le calendrier de détecter la croissance des cheveux est supérieur à d&#39;autres épreuves 4. Notre analyse ciblée régénération des cheveux fournit un compagnon pratique et rapide pour les modèles existants génétiques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Cnt-07 </td><td> Cellule N Tec </td><td> CnT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 Supplément </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase de type 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrène </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de culture tissulaire </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux à dissection </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> courbe </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex Supply </td><td> GRF-2975 n ° 10 </td><td> Pas de taille. 10 </td></tr><tr><td> 70 coloration cellulaire pm </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> Tube de 15 ml à centrifuger conique </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 959-49D </td><td></td></tr><tr><td> Tampons imbibés d&#39;alcool </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille de calibre 23 jauge </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Lubrifiant oculaire </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone-Lodine tampons </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silicon Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Sutures </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Bandage souple </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Pansement non-adhérent </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Matériels </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solution de lavage PBS 500 pg / ml de pénicilline / streptomycine 12,5 pg / ml Fungizone 100 pg / ml de gentamycine Solution Dispase HBSS 2,5 mg / ml final Dispase 100 pg / ml de gentamycine Médias neutralisants HBSS 15% (v / v) FBS Solution de collagénase 0,25% (p / v) de la collagénase de type 1 ontenu &quot;&gt; 100 pg / ml de pénicilline / streptomycine 2,5 pg / ml Fungizone 50 pg / ml de gentamycine Solution polybrène HBSS 8 ug / ml (p / v) Polybrène </td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

Morphogénèse du follicule pileux, un processus complexe nécessitant l&#39;interaction entre l&#39;épithélium dérivées de kératinocytes et le mésenchyme sous-jacent, est un système modèle intéressant pour étudier le développement d&#39;organes et de tissu-spécifique de signalisation. Bien que le développement du follicule pileux est génétiquement docile, une analyse rapide et reproductible des facteurs essentiels de ce processus demeure un défi. Nous décrivons ici un procédé destiné à générer une surexpression ou à médiation shRNA knockdown utilisant des facteurs de lentivirus de manière spécifique d&#39;un tissu. En utilisant une version modifiée d&#39;un modèle de régénération des cheveux 5, 6, 11, on peut réaliser un gain ou une perte robuste de fonction d&#39;analyse dans des kératinocytes primaires de souris ou des cellules dermiques de faciliter l&#39;étude des cellules épithéliales-mésenchymateuses voies de signalisation qui conduisent à la morphogénèse du follicule pileux . Nous décrivons comment isoler les kératinocytes primaires de souris frais et les cellules dermiques, qui contiennent des cellules de papilles dermiques et de leurs précurseurs, livrer lentivirus contaiNing soit shRNA ou de l&#39;ADNc de l&#39;une des populations de cellules, et de combiner les cellules pour produire des follicules pileux entièrement formées sur le dos des souris nude. Cette approche permet l&#39;analyse des tissus des facteurs spécifiques nécessaires pour générer les follicules pileux dans les trois semaines et fournit un compagnon pratique et rapide pour les modèles existants génétiques.

Dans la figure 1, nous montrons le résultat de la dermo-knockdown shRNA spécifique lentiviral de Smoothened (Smo), une composante essentielle de signalisation Shh, dans une greffe de cheveux de régénération de 3 semaines vieux. Greffes de contrôle à l&#39;aide vecteur lentiviral eux seuls montrent la croissance des cheveux robuste (figure 1A). En revanche, cutanée spécifique knockdown des résultats Smo en perte de croissance des cheveux (figure 1B). Hématoxyline et éosine représente le stade de follicules pileux en matière de contrôle et des conditions expérimentales (figure 1C, D). Le phénotype de croissance des cheveux des traitements similaires peuvent varier en fonction des expériences, y compris le contrôle positif à l&#39;infection par vecteur lentiviral seul. Par conséquent greffes de contrôle positif doit toujours être inclus dans chaque expérience comme une référence de 30% des greffes peut échouer en raison de la cicatrisation ou une pièce jointe incomplète des greffes. Dans le cas du test d&#39;une interaction entre deux facteurs tels que la surexpression d&#39;un facteur d&#39;ADNc à nouveauSCUE shRNA médiation knockdown d&#39;un autre facteur, il faut toujours inclure des greffes knockdown seules à manifester le résultat la perte de fonction dans chaque expérience. Cela fournira une gamme nécessaire pour déterminer comment un gène particulier perturbe la voie de la régénération des follicules pileux et de deux gènes interagissent. Retrait de la chambre (figure 2A) doit être fait avec soin. Le greffon nouvellement créé devrait être légèrement opaque avec une surface mate (figure 2B). La greffe peut s&#39;en tenir à la chambre, donc soulevant délicatement un côté est important de s&#39;assurer que la greffe reste attaché au lit de la plaie. Le greffon est assez stable après trois jours et devrait présenter peu de difficultés lors du retrait du pansement. La croissance des cheveux consistant devrait être observé après trois semaines (figure 2C). L&#39;omission soit mDC ou KCS se traduira par une plaie récupéré sans cheveux (figure 2D) 11. La mort cellulaire ou de perte de cellules dans l&#39;un destypes de cellules se traduit également par pas de cheveux, contrairement à la régénération des cheveux réduite en dermo-Smo knockdown, comme indiqué dans la figure 1B. Afin d&#39;assurer un dosage de succès, il est essentiel pour atteindre plus de 90% infection virale des cellules avec surexpression approprié ou l&#39;efficacité knockdown avant la greffe. En raison des contraintes de temps de la procédure de greffe, nous vous recommandons DÉPANNAGE efficacité d&#39;infection virale avant de commencer une expérience de greffe, et de toujours enregistrer une petite partie des cellules le jour de la greffe procédure pour vérifier perte ou gain de l&#39;expression. Lentiviral titre variera en fonction de la construction utilisé et doit être déterminé avant l&#39;infection d&#39;atteindre une efficacité de 90-100%. Nous surveillons l&#39;efficacité infection virale co-exprimée avec la GFP à partir du vecteur lentiviral. Nous avons régulièrement effectuer une PCR quantitative et / ou Western blot pour déterminer l&#39;étendue de knockdown ou la surexpression. En utilisant deux vecteurs d&#39;expression de marqueurs fluorescents pour marquercellules infectées fournit un moyen de signaler perdurance du signal et le nombre de cellules exprimant nos constructions dans les greffes matures. Nous utilisons GFP dirigée par un promoteur CMV du vecteur lentiviral pSicoR-CMV-GFP 10 en combinaison avec Smo shRNA. Dans la figure 3, on montre une vieille de 3 semaines cutanée du greffon spécifique où la GFP est exprimée en lentivirally-papille dermique du follicule pileux représentant. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;analyse histologique de la croissance du follicule pileux. (A) Voir la régénération de la greffe de cheveux avec le contrôle des cellules dermiques infectées par le vecteur lentiviral vide et kératinocytes non traités. (B) à l&#39;aide shRNA knockdown Smoothened lentiviral dans les cellules dermiques combinée avec les résultats des kératinocytes non traités dans la perte des follicules pileux. (C) hématoxyline et éosine montre f cheveux anagènesollicles dans les greffes de commande s&#39;étendent vers le bas dans le derme et (D) Smoothened follicules pileux knockdown restent chétifs et largement absents. Toutes les images sont trois semaines après la greffe. La barre d&#39;échelle représente 100 um. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Figure 2. Greffe de cellules primaires. (A) nu / nu à la souris avec suturées chambre de logement primaires des cellules dermiques et les kératinocytes. (B) Retrait de la chambre expose nouvellement formé peau est terne et opaque par nature. (C) les poils entièrement cultivées sur l&#39;utilisation du greffon sauvage Primaire cellules dermiques et les kératinocytes à trois semaines après la greffe. (D) Ajout de cellules dermiques primaires sans kératinocytes conduit à aucun cheveu après trois semaines. Des résultats similaires sont observés avec plus de kératinocytes primaires sans cellules dermiques. Figure 3. Maintien de l&#39;expression de la GFP dans papille dermique. Images confocales de papille dermique d&#39;une greffe de 3 semaines régénéré ancienne. GFP a été exprimé dans la population de cellules dermiques à partir d&#39;un vecteur lentiviral et détectés dans la papille dermique (vert). Versican (rouge) délimite la papille dermique et les noyaux étaient étiquette avec Hoechst (bleu). Remarque GFP est exprimé spécifiquement dans les cellules dermiques mais pas dans les kératinocytes environnants. La barre d&#39;échelle représente 20 um.

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Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Tissu-spécifique de l&#39;analyse d&#39;un modèle de régénération des cheveux à l&#39;aide follicule lentivirus de médiation de gain ou de perte de fonction.

Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K vues.  Stanford University School of Medicine. Tissu-spécifique de l'analyse d'un modèle de régénération des cheveux à l'aide follicule lentivirus de médiation de gain ou de perte de fonction.

Vidéo: Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection de l&#39;hippocampe gyrus denté de souris adulte

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

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Biologie

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant l&#39;embryogenèse

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adénovirus suppression génétique des molécules de signalisation dans les cultures de fibroblastes de souris embryonnaires primaires

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Évaluation des propriétés de signalisation ectodermique épithéliums au cours du développement cranio-facial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Pharmacologiques et des essais de génétique pour manipuler la régénération de l&#39;Planaires Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cultures Suspension cellulaires

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Extraction et analyse de cortisol de l&#39;homme et de singe cheveux

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Détection de l&#39;épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Une nouvelle technique pour l&#39;analyse quantitative de la perte de cheveux chez la souris Utilisation de l&#39;analyse des niveaux de gris

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...