The authors acknowledge financial support from Houston Methodist Research Institute, the National Natural Science Foundation of China (Nos., 21231007 and 21121061), the Ministry of Education of China (Nos., 20100171110013 and 313058), the National Basic Research Program of China (973 Program No. 2014CB845604), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities.

1. Préparation de particules PCPS <ol><li> Oxyder les particules de silicium poreux non-fonctionnalisés dans une solution à 30% de peroxyde d&#39;hydrogène à 95 ° C pendant 2 heures. Aminer les particules oxydées dans 2% (3- aminopropyl) triéthoxysilane solution dans l&#39;alcool isopropylique pendant 2 jours à 65 ° C sous agitation douce. </li><li> Centrifuger la solution pendant 30 min à 18 800 xg et laver les particules deux fois dans de l&#39;alcool isopropylique et trois fois dans de l&#39;éthanol, en utilisant brève sonication de suspendre le culot. Laisser les particules dans une solution d&#39;éthanol quand on effectue l&#39;étape 1.3 et 1.4. </li><li> Ajouter un volume connu de suspension de particules (par exemple, 10 ul) au diluant de 10 ml et compter les particules avec un comptage de particules analyseur pour déterminer la concentration de particules dans la solution mère. </li><li> Activer le groupe acide de L-arginine (0,1 nmol) de N - (3-diméthylaminopropyl) - chlorhydrate -ethylcarbodiimide N &#39;(EDC, 0,1 nmol) / N </em&gt; Hydroxysuccinimide (NHS, 0,1 nmol) dans 20 ml d&#39;éthanol pendant 2 heures à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Soniquer brièvement la solution particules de stock et ajouter 1 milliard de particules à la solution de L-arginine et de laisser la réaction pendant 18 heures à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Activer le premier groupe de l&#39;acide aspartique de la N - (tert-butoxycarbonyl) -L-aspartique (Boc-Asp-OH, 1 nmol) avec du EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) dans 20 ml d&#39;éthanol pendant 4 heures à 4 ° C avec agitation douce. </li><li> Dissoudre 50 mg de polyéthylène-imine dans 10 ml d&#39;éthanol et ajouter la solution au mélange de Boc-Asp-OH. Que la réaction se déroule pendant 24 heures à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Activez le deuxième groupe d&#39;acide aspartique de la solution Boc-Asp-OH / PEI avec EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) à 4 ° C pendant 6 heures sous agitation douce. </li><li> Pour obtenir des particules, PCP, ajouter la solution de particules de l&#39;étape 1.5 dans la solution de Boc-Asp-OH / PEI de l&#39;étape 1.8. Laisser la réaction se dérouler pendant 18 heures à température ambiante avec douceur st<html> irring. </li><li> Centrifuger la solution pendant 30 min à 18 800 xg et laver la solution de particules à trois reprises avec de l&#39;éthanol, en utilisant brève sonication à suspendre la pastille. </li></ol> 2. PCPS caractérisation des particules <ol><li> Mesure de la taille des particules en utilisant un microscope électronique à balayage (MEB). <ol><li> Placez une goutte de suspension de particules (10 000 particules / ul dans de l&#39;éthanol) sur un échantillon de silice propre SEM talon et laisser sécher à température ambiante sous vide. </li><li> Mesurer images MEB à 8 kV avec une distance de travail de 3-5 mm en utilisant un détecteur de lentille. </li></ol></li><li> Mesurer le potentiel zêta des particules en utilisant un système d&#39;analyse de particules. <ol><li> Mélanger 10 pl de suspension de particules (10 000 particules / ul) dans de l&#39;éthanol avec 1 ml de 10 mM de tampon phosphate (pH 7,4). </li><li> Chargez l&#39;échantillon dans les cellules capillaires plié et en mesurer le potentiel zêta selon les instructions du fabricant. </li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 3. Chargement de siRNA dans des particules PCPS <ol><li> Sécher les particules PCPS (PCPS de particules étape de préparation 1,9) sous vide O / N. </li><li> Ajouter siRNA (4 pg) dans l&#39;eau sans nucléase (20 pi) pour les particules PCPS secs et brièvement sonicat. Utilisez la particule rapports suivants siARN: 2 × 10 5 particules / 0,2 pg siRNA, 4 × 10 5 particules / 0,2 pg siARN, 6 × 10 5 particules / 0,2 pg siRNA, 8 × 10 5 particules / 0,2 pg siARN, 10 × 10 5 particules / 0,2 ug siRNA et 12 × 10 5 particules / 0,2 ug siARN. </li><li> Incuber pendant 3 heures à 4 ° C sur un agitateur (1000 rpm) pour permettre la liaison des particules de siRNA. </li></ol> 4. Optimisation du ratio des particules siRNA / PCPS <ol><li> Ajouter ADN colorant de charge à 20 pi de particules de siARN PCPS / de contrôle avec particules différents rapports siARN (voir Chargement de siRNA en particules PCPS). </li><li> Chargez le sampes dans un gel d&#39;agarose à 2% contenant du gel de l&#39;ADN tache. </li><li> Effectuer l&#39;électrophorèse à une tension constante de 120 V pendant 20 min dans un tampon en cours d&#39;exécution. </li><li> Analyser le gel avec l&#39;acquisition de l&#39;image et des logiciels d&#39;analyse. </li></ol> 5. Libération de siRNA de PCPS particules <ol><li> Mélanger 20 pi de particules de siARN PCPS / de contrôle avec particules différents rapports siRNA (voir l&#39;étape 3) en dodécylsulfate de sodium (SDS, 2%) et laisser reposer pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Ajouter ADN colorant de charge pour les échantillons. </li><li> Charger les échantillons dans un gel agarose à 2% contenant du gel de l&#39;ADN tache. </li><li> Effectuer l&#39;électrophorèse à une tension constante de 120 V pendant 20 min dans un tampon en cours d&#39;exécution en utilisant un équipement d&#39;électrophorèse de l&#39;ADN et une alimentation électrique. </li><li> Analyser le gel avec l&#39;acquisition de l&#39;image et des logiciels d&#39;analyse. </li></ol> 6. microscopie confocale de PCPS particules <ol><li> Ajouter 5 ul de particules fluorescentes de siARN de contrôle PCPS / (10 × 10 5 particules / 0.2 pg siRNA / 20 pi) à une lamelle de verre. </li><li> Visualiser couches de particules par microscopie confocale. </li></ol> 7. Caractérisation de Arg-PEI / siRNA contrôle nanoparticules <ol><li> À dégrader le matériau de silicium et former Arg-PEI nanoparticules / contrôle de siARN, ajouter des particules PCPS / siRNA (10 × 10 6 particules PCPS / 2 pg siARN) à 100 pi de tampon phosphate salin et secouer (1000 rpm) à 37 ° C pendant 2 jours. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon pendant 30 min à 18 800 xg et récupérer le surnageant. </li><li> Mesurer la taille des nanoparticules formées Arg-PEI / siARN avec diffusion de la lumière dynamique (DLS). <ol><li> Mélanger 10 pi du surnageant avec 1 ml de tampon phosphate 10 mM (pH 7,4) et le placer dans une cuvette en matière plastique. </li><li> Mesure de la taille des particules en utilisant un système d&#39;analyse de particules selon les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Déterminer la taille et la morphologie du Arg / PEI-siRNA forménanoparticules avec la microscopie à force atomique. <ol><li> Prenez 10 pi du surnageant et déposer sur une plaquette de silicium. </li><li> Visualisez les particules avec la microscopie à force atomique (AFM). </li></ol></li></ol> 8. Culture Cellulaire <ol><li> Culture MDA-MB-231 cellules de cancer du sein humain dans un milieu de culture cellulaire supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine à 5% de CO2, 95% d&#39;humidité et 37 ° C. </li></ol> 9. microscopie confocale de cellules vivantes avec PCPS particules <ol><li> cellules de la plaque dans la culture deux puits diapositives à une densité de semis de 3 x 10 5 cellules / puits pendant 24 heures. </li><li> Ajouter particules PCPS chargés de siRNA contrôle fluorescent (10 × 10 5 particules / 0,2 pg particules rapport siRNA, 50 nM siRNA) pour les cellules. </li><li> Enregistrer un film des cellules avec un microscope confocal (fourni avec une chambre, 5% de CO 2, 95% d&#39;humidité et 37 ° C) pendant 12 heures suivant expo de particulesassurer. </li></ol> 10. microscopie confocale de cellules fixes avec PCPS particules <ol><li> cellules de la plaque dans la culture deux puits diapositives à une densité de semis de 3 x 10 5 cellules / puits pendant 24 heures. </li><li> Ajouter PCPS particules chargées avec l&#39;ARNsi de contrôle fluorescent (10 x 10 5 particules / particules de 0,2 ug rapport siRNA, 50 nM de siRNA) aux cellules et incuber pendant 1 jour, 7 jours et 10 jours. </li><li> Laver les cellules deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate, puis les fixer avec une solution de paraformaldehyde à 4% pendant 10 min. </li><li> Laver les cellules avec du tampon phosphate salin. </li><li> Perméabiliser les cellules avec 0,1% d&#39;octyl phénol éthoxylate pendant 10 min, puis les laver trois fois avec du tampon phosphate salin. </li><li> Bloquer les cellules avec de l&#39;albumine de sérum bovin (10 mg / ml) dans une solution saline tamponnée au phosphate pendant 10 min à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Pour visualiser l&#39;actine filamenteuse, incuber les cellules avec fluorescence phalloïdine marquée (1 pi / 40 piune solution de blocage) pendant 20 min à température ambiante avec agitation douce, puis lavez en tampon phosphate salin. </li><li> Retirer les glissières du cadre et ajouter antifade réactif avec 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour visualiser le noyau. </li><li> Ajouter un verre de couverture sur le dessus et prendre des images de cellules avec la microscopie confocale. </li></ol> 11. cytométrie en flux des cellules avec PCPS / fluorescentes contrôle Particules siARN <ol><li> cellules de la plaque dans une plaque à 6 puits à une densité d&#39;ensemencement de 3 x 10 5 cellules / puits pendant 24 h. </li><li> Ajouter PCPS particules chargées avec l&#39;ARNsi de contrôle fluorescent (10 x 10 5 particules / particules de 0,2 ug rapport siRNA, 50 nM de siRNA) aux cellules et incuber pendant 24 heures. </li><li> Laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate et les gratter avec un grattoir à cellules. </li><li> Stocker les cellules dans une solution saline tamponnée au phosphate avec 2% de sérum bovin foetal avant l&#39;analyse. Utilisation des cellules non traitées comme témoin négatif. </li><li> Effectuer cy de fluxtometry. </li></ol> 12. viabilité cellulaire des cellules avec des particules et PCPS PCPS / commande particules siARN <ol><li> cellules de la plaque dans une plaque à 96 puits à une densité cellulaire de 3 × 10 3 cellules / puits pendant 24 heures. </li><li> Traiter les cellules avec des particules PCPS (1,5 x 10 5 / puits et 6 × 10 5 / puits) ou des particules de siARN PCPS / de commande (10 x 10 5 particules / 0,2 ug particules rapport siRNA, 10 nM et 100 nM d&#39;ARNsi) de 48 h et 72 h. Utilisation des cellules non traitées et des cellules traitées avec une solution saline tamponnée phosphate (même volume que les particules ajoutées) comme témoins. Doser chaque échantillon en triple exemplaire. </li><li> Effectuer un essai de prolifération de cellules selon les instructions du fabricant. </li><li> Représenter des données comme la moyenne ± écart-type. </li></ol> 13. Western Blot de cellules avec PCPS / ATM mutées particules siARN <ol><li> cellules de la plaque dans une plaque à 6 puits à une densité de cellules de 2 x 10 5 cellules / well pendant 24 heures. </li><li> Incuber les cellules avec siRNA PCPS / de commande (50 nM) de particules ou PCPS / ATM siRNA (50 nM) particules pour 72 h. Utilisation des cellules non traitées comme témoin. </li><li> Lyse des cellules en utilisant un réactif d&#39;extraction de protéine additionné d&#39;un cocktail d&#39;inhibiteurs de protease. </li><li> Centrifuger les lysats cellulaires pendant 10 min à 14 000 xg et récupérer le surnageant. </li><li> Déterminer la concentration en protéine par un dosage de protéine de quantification selon les instructions du fabricant. </li><li> Ajouter tampon de charge d&#39;échantillon (avec 5 pi 2-mercaptoéthanol / ml de tampon) pour les échantillons et les chauffer pendant 6 min à 99 ° C. </li><li> Charger les échantillons de protéine (20 ug / ul) dans un gel de SDS-polyacrylamide 12% en tampon en cours d&#39;exécution et exécuter une électrophorèse sur gel de Polyacrylamide (1 h, 120 V) en utilisant un équipement d&#39;électrophorèse et une alimentation électrique. </li><li> Transvaser le gel dans un tampon de transfert (avec 20% de methanol) à une membrane de nitrocellulose (1 h, 100 V) en utilisant un équipement d&#39;électrophorèse etune alimentation électrique. </li><li> Bloquer la membrane avec 5% de lait en poudre pendant 1 h. </li><li> Incuber la membrane avec l&#39;anticorps primaire ATM (de lapin) dans une solution de blocage (à partir de l&#39;étape 13.9) à une dilution de 1: O / N 1000. </li><li> Laver la membrane avec du tampon phosphate salin contenant 0,1% de polyethylene glycol sorbitan monolaurate, puis incuber avec l&#39;anticorps secondaire (anti-lapin) dans une solution de blocage (à partir de l&#39;étape 13.9) à une dilution de 1: 2500 pendant 1 heure. </li><li> Laver la membrane avec du tampon phosphate salin contenant 0,1% de polyéthylène glycol monolaurate de sorbitan et de détecter les bandes de protéines par Western blot avec un réactif de détection à l&#39;aide de l&#39;acquisition d&#39;image et un logiciel d&#39;analyse. </li><li> Pour le contrôle de chargement, laver la membrane et répétez les étapes de 13,9 à 13,12 utilisant un anticorps primaire β-actine (de la souris, 1: 10,000 dilution) et un anticorps secondaire (anti-souris 1: 4000 dilution). </li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+confinement+of+gadolinium-based+contrast+agents+in+nanoporous+particles+enhances+T1+contrast.">Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast.</a> Nat Nanotechnol. 5 (11), 815-821 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ce protocole décrit un procédé pour le succès de livraison de siRNA et la transfection dans les cellules. En particulier, la délivrance de siRNA est obtenue en utilisant une plate-forme multifonctionnelle constituée de particules de l&#39;ISP polycation-fonctionnalisé. L&#39;utilisation de la thérapie siRNA a un grand potentiel, par exemple, le traitement du cancer, que divers oncogènes peuvent être ciblées avec une grande spécificité. Par conséquent, il existe une demande pour développer des vé...

Les petits ARN interférents (siRNA) sont des molécules d&#39;ARN double brin qui peuvent supprimer l&#39;expression des gènes. Au cours des dernières années, siRNA ont été développés comme une nouvelle génération de biomédicaments qui montrent un potentiel thérapeutique pour une utilisation future dans les applications cliniques 1-5. Cependant, la mise en œuvre réussie de la thérapie siRNA reste un défi considérable, en raison de la dégradation par les nucléases, une mauvaise absorption intracellulaire, la faible efficacité de transfection et la libération inefficace de l&#39;endosome / 5 lysosome. Beaucoup de ces obstacles peuvent être surmontés par le développement de plates-formes de livraison, qui peuvent en toute sécurité et efficacement offrir siRNA pour les tissus malades. Comparé aux transporteurs virales, les plates-formes non-virales offrent plusieurs avantages, tels que la sécurité, le faible coût et la facilité d&#39;adaptation. En particulier, les nanoparticules cationiques, tels que des polymères et des lipides, se sont révélés utiles pour la délivrance de siRNA 3. Auparavant, nous avons développé un dr discoïdeug système de distribution, appelé le vecteur à plusieurs étages (MSV). Cette plate-forme est basée sur les étapes séquentielles, dans lequel un véhicule est libéré à partir de l&#39;autre. Le premier véhicule de l&#39;étape est un microparticules biodégradables fabriqués à partir de silicium poreux (PSI), tandis que les secondes véhicules de scène sont des nanoparticules chargées de médicaments ou d&#39;agents de contraste 6,7. Les nanoparticules qui sont noyés dans le matériau de PSI sont progressivement libérés comme le Si dégrade 8. Un avantage d&#39;utiliser des particules de Si est que les caractéristiques de morphologie et de surface peuvent être facilement adaptées pour réaliser la biodistribution et la libération du médicament optimal. Récemment, l&#39;utilisation réussie de la plate-forme MSV pour la fourniture de liposomes à siARN tissu tumoral a été démontré dans un modèle de souris de l&#39;ovaire et le cancer du sein 9, 10. Dans ce travail, nous avons fabriqué un système de distribution universel pour siRNA basée sur les principes de la plate-forme de MSV. L&#39;efficacité de ce système de livraison a déjà été démontré nousment différente des molécules de siRNA 11. Le système est un silicium poreux (PCPS) porte-polycation-fonctionnalisé, comprenant des ISP greffé avec la polyéthylèneimine (PEI) et l&#39;arginine (Arg). PEI peut aider à former des interactions électrostatiques avec des siRNA, tandis que Arg et psi peuvent servir à réduire la toxicité de PEI, comme précédemment demonstarted 11. En outre, la présence de PEI peut aider à l&#39;absorption intracellulaire et endosomal évasion, tandis que les microparticules de l&#39;ISP permettent la protection de siRNA et la libération prolongée. Les particules de l&#39;ISP dégradent peu à peu dans des conditions physiologiques, ce qui conduit à la formation de nanoparticules Arg-PEI / siRNA (figure 1), qui ont une morphologie distincte et une distribution de taille étroite 11. Pour plus de détails au sujet de la stabilité du système PCPS / siRNA, se il vous plaît se référer à l&#39;étude de Shen et al. 11. Cette plate-forme de PCPS diffère de la MSV classique, puisque les secondes nanoparticules de scène ne sont pas initialement Present dans le support, mais sont formées au fil du temps que le support de premier étage dégrade 11, 12. L&#39;efficacité siRNA chargement efficacité, la cytotoxicité et silençage génique du système PCPS a été évaluée in vitro. L&#39;efficacité de transfection a été mesurée en utilisant le siRNA contre l&#39;ataxie télangiectasie mutée (ATM) oncogene, qui est impliqué dans la réparation de l&#39;ADN 10. Auparavant, la suppression de l&#39;ATM a été montré pour diminuer la croissance tumorale dans un modèle de cancer du sein 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1812">
	<tbody>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:605px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:421px;">Company/Institution</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:653px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Polyethylenimine (PEI), branched</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">408727</td>
			<td style="width:653px;">Average molecular weight ~25,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">A5006</td>
			<td style="width:653px;">Reagent grade, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Boc-Asp-OH</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">408-468</td>
			<td style="width:653px;">99%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">(3-&#8203;Aminopropyl)&#8203;triethoxysilane</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">440140</td>
			<td style="width:653px;">99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">216763</td>
			<td style="width:653px;">30&#160;wt. % in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">339741</td>
			<td style="width:653px;">100.00%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">W292907</td>
			<td style="width:653px;">&#8805;99.7%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Ethanol</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">459844</td>
			<td>&#8805;99.5%&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03449</td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030-10G</td>
			<td>Blocking agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Ataxia-telangiectasia mutated siRNA&#160;</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:653px;">Designed in-house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Tris Acetate-EDTA buffer</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">T9650</td>
			<td style="width:653px;">For DNA agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td style="width:653px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td style="width:653px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td style="width:653px;">Polyethylene glycol sorbitan monolaurate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:421px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td style="width:653px;">For Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td style="width:653px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>71496</td>
			<td style="width:653px;">For making phosphate buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>71640</td>
			<td style="width:653px;">For making phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse IgG</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">A4416</td>
			<td style="width:653px;">Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">N-Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td style="width:421px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">130672</td>
			<td style="width:653px;">98%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid</td>
			<td style="width:421px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:133px;">655182</td>
			<td style="width:653px;">96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">10X Tris-Glycine Liquid</td>
			<td style="width:421px;">Li-Cor&#160;</td>
			<td style="width:133px;">928-40010</td>
			<td style="width:653px;">Transfer buffer for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Paraformaldehyde solution 4% in PBS&#160;</td>
			<td style="width:421px;">Santa Cruz</td>
			<td>Sc-281692</td>
			<td style="width:653px;">Fixation of cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS)</td>
			<td style="width:421px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">G5421</td>
			<td style="width:653px;">Proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:421px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">BP399-500</td>
			<td style="width:653px;">10 X Solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Corning cellgro Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s (Mod.)</td>
			<td style="width:421px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:133px;">MT-15-017-CM</td>
			<td style="width:653px;">Cell culture media, 1X solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:421px;">Fisher Scientific</td>
			<td>AC21568-2500</td>
			<td style="width:653px;">Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Cover glass</td>
			<td style="width:421px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-530C&#160;</td>
			<td style="width:653px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Methanol</td>
			<td style="width:421px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A412-1</td>
			<td style="width:653px;">For Western blot transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Plastic Cuvettes</td>
			<td style="width:421px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:133px;">14-377-010&#160;</td>
			<td style="width:653px;">For size measurements using Zetasizer Nano ZS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td style="width:421px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">14-754-34</td>
			<td style="width:653px;">Spray for removing RNAse contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Agarose</td>
			<td style="width:421px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">BP165-25</td>
			<td style="width:653px;">Low melting point, for running RNA samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI&#160;</td>
			<td style="width:421px;">Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td style="width:653px;">Antifade reagent with DAPI, nucelus detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:421px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:133px;">A12379</td>
			<td style="width:653px;">Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:421px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:133px;">S33102</td>
			<td style="width:653px;">Visualization of RNA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Negative Control siRNA</td>
			<td style="width:421px;">Qiagen</td>
			<td style="width:133px;">1022076</td>
			<td style="width:653px;">Control siRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">AllStars Neg. siRNA AF 555</td>
			<td style="width:421px;">Qiagen</td>
			<td style="width:133px;">1027294</td>
			<td style="width:653px;">Fluorescent control siRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:421px;">Celltreat</td>
			<td>229310</td>
			<td style="width:653px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioLite Multidishes and Microwell Plates</td>
			<td style="width:421px;">Thermo Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td style="width:653px;">6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce LDS Sample Loading Buffer (4X)&#160;</td>
			<td style="width:421px;">Thermo Scientific</td>
			<td>84788</td>
			<td style="width:653px;">Sample loading buffer for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Pierce BCS Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:421px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:133px;">23227</td>
			<td style="width:653px;">Protein quantification assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100X)</td>
			<td style="width:421px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:133px;">78430</td>
			<td style="width:653px;">Protease inhibitor cocktail, use at 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td>
			<td style="width:421px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:133px;">78501</td>
			<td style="width:653px;">Protein extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Sorvall Legend Micro 21R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002440</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Beta Actin Antibody&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>MA1-91399</td>
			<td>&#946;-actin primary antibody (from mouse) for western blor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6X TriTrack DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:421px;">Thermo Scientific</td>
			<td>R1161</td>
			<td style="width:653px;">DNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-Free Water&#160;</td>
			<td style="width:421px;">Life Technologies</td>
			<td>AM9938</td>
			<td style="width:653px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-Fat Dry Milk</td>
			<td style="width:421px;">Lab Scientific</td>
			<td>M0841</td>
			<td style="width:653px;">For Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-well BD Falcon culture slides&#160;</td>
			<td style="width:421px;">BD Biosciences</td>
			<td>354102</td>
			<td style="width:653px;">2-well culture slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham ECL Western blot detection reagent.&#160;</td>
			<td style="width:421px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:133px;">RPN2106</td>
			<td style="width:653px;">Western blot detection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BA Membranes</td>
			<td style="width:421px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10402096</td>
			<td style="width:653px;">Nitrocellulose membrane for Wester blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATM (D2E2) Rabbit mAb</td>
			<td style="width:421px;">Cell Signaling</td>
			<td>2873S</td>
			<td style="width:653px;">ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td style="width:421px;">Cell Signaling&#160;</td>
			<td>7074</td>
			<td style="width:653px;">Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Folded capillary cells</td>
			<td style="width:421px;">Malvern&#160;</td>
			<td style="width:133px;">DTS 1061</td>
			<td style="width:653px;">For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">MDA-MB-231 cell line</td>
			<td style="width:421px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">HTB-26</td>
			<td style="width:653px;">Mammary Gland/Breast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">12% Mini-PROTEAN TGX Gel</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>456-1043&#160;</td>
			<td style="width:653px;">For Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biorad PowerPac HC</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>164-5052</td>
			<td>Power supply for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-0732</td>
			<td>Running buffer for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wide Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>170-4405</td>
			<td>Electrophoresis equipment for DNA agarose gel&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-PROTEAN Tetra cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>165-8000</td>
			<td>Electrophoresis equipment for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>170-8265</td>
			<td>Image acquisition and analysis software for gels and blots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#34; (10cm) dia., 5x7mm diced Silicon Wafer</td>
			<td>Ted Pella&#160;</td>
			<td>16007</td>
			<td>Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670107</td>
			<td>Shaker&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoton II diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td>Isoton diluent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multisizer 4 Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63076</td>
			<td>Particle counting analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Non-functionalized porous silicon particles&#160;</td>
			<td style="width:421px;">Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:653px;">Dicoidal shape. 2.6 &#956;m (diameter) x 0.7 &#956;m (hight), provided in isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td style="width:421px;">Malvern</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:653px;">Particle analyzer system for size and zeta potential&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:421px;">FEI</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:653px;">Particle size and shape&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:605px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:421px;">Bruker</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:653px;">Particle size and shape</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:605px;">Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope</td>
			<td style="width:421px;">Olympus</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:653px;">Visualization of fixed and live cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porous silicon microparticles for delivery of sirna therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Ce protocole décrit l&#39;utilisation d&#39;un système de distribution non viral sûr et efficace pour la transfection de siRNA. Les résultats de SEM montrent que les particules PCPS sont de forme cylindrique et ont un diamètre de 2,6 um (figure 2A). Les particules sont chargées positivement à un potentiel zêta d&#39;environ 8,21 (figure 2B), ce qui permet la liaison électrostatique avec des nucleotides chargés négativement. Les images confocales de différentes couches de par...

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Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Livraison reste le principal défi pour la mise en œuvre thérapeutique de petits ARN interférents (siRNA). Ce protocole implique l&#39;utilisation d&#39;une plate-forme de délivrance de siRNA biocompatible et multifonctionnel, constitué par l&#39;arginine et polyéthylènimine greffé microparticules de silicium poreux.

Silicium poreux microparticules pour la livraison de siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

porous-silicon-microparticles-for-delivery-of-sirna-therapeutics

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K vues.  Houston Methodist Research Institute.  Livraison reste le principal défi pour la mise en œuvre thérapeutique de petits ARN interférents (siRNA). Ce protocole implique l'utilisation d'une plate-forme de délivrance de siRNA biocompatible et multifonctionnel, constitué par l'arginine et polyéthylènimine greffé microparticules de silicium poreux. 