Nous remercions Fiona Foley pour les services de laboratoire et de soins excellente poisson zèbre. Ce travail a été soutenu un AHA bourse prédoctorale à GW (11PRE5730027) et des subventions du NHLBI à hjy (R01HL66292) et JDA (R01HL095690).

Vue d&#39;ensemble de la phase spécifiques injections embryon du poisson zèbre Oligonucléotides antisens morpholino (MO), qui se lient à un ARNm cible et perturber l&#39;expression des protéines à partir de ce compte rendu, sont largement utilisés dans inactivation génique (perte de fonction) des études chez le poisson zèbre 13,14. Outils Gene, LLC offre des OM qui sont marqués soit avec carboxyfluorescéine (émet la fluorescence verte) ou lissamine (émet la fluorescence rouge) pour détecter MO embryons injectés en utilisant la microscopie à fluorescence. En injectant de MO dans la cellule jaune à différents stades de développement du poisson zèbre, il est possible de livrer le MO à des compartiments spécifiques de l&#39;embryon (figures 1A-F). MO injecté dans le jaune d&#39;oeuf entre les étapes 1-4 de cellules (0-1 HPF) pénètre dans toutes les cellules embryonnaires (figures 1A, D, D &#39;) par l&#39;intermédiaire des connexions avec le jaune d&#39;oeuf qui persistent jusqu&#39;à l&#39;étape 32-15 cellule démontable pour faciliter global. MO injecté dans le jaune pendant midblastétapes ula (2,5-3 hpf) peut entrer dans les progéniteurs des SFD (figures 1B, E, E &#39;) probablement par des ponts cytoplasmiques 8 et la fonction des gènes knockdown spécifiquement dans la lignée cellulaire DFC / KV 12, sans entrer dans la plupart des autres lignées de cellules embryonnaires . Comme un contrôle important de tester si la fonction du gène est nécessaire DFC / KV ou également en jaune 12,16, il est également possible de limiter la cellule MO jaune par injection entre les étapes épibolie dôme-30% (~ 4,5 HPF) après tous les ponts cytoplasmiques ont fermé leurs portes (figures 1C, F, F &#39;). Ces injections ont été utilisés en combinaison pour analyser la fonction des gènes dans des PLC / KV cellules 17-24. Pour évaluer l&#39;écoulement du fluide dans le KV, des microbilles fluorescentes sont injectés dans la lumière KV entre les 6-10 somites étapes (12-14 hpf) et puis tout de suite imagée en utilisant la vidéomicroscopie (figures 1G-J). Microbilles sont disponibles qui émettent une fluorescence rouge ou vert (ou les deux), il est donc possible d&#39;utiliser différentscanaux à l&#39;image fluorescente microbilles et MO. 1. Spécifiques au stade de l&#39;injection de morpholinos (MO) L&#39;injection de MO dans embryons de poisson zèbre a été démontré précédemment 25,26. Ici, nous décrivons brièvement spécifiques au stade injections MO. Après toutes les injections, les embryons sont transférés dans une boîte de Pétri et incubés à 28,5 ° C. <ol><li> Mondiale injection MO: Recueillir des embryons immédiatement après la fécondation et les charger dans une plaque d&#39;injection. Chargez fluorescente MO dans une aiguille capillaire et monter l&#39;aiguille sur un microinjecteur (par exemple, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injecteur). Briser le bout de l&#39;aiguille et régler les paramètres d&#39;injection (pression et / ou de temps) pour créer une chute d&#39;injection qui a un volume de 1 nl comme décrit 25,26. L&#39;utilisation d&#39;un stéréomicroscope à dissection, injecter 1 nl de MO dans le jaune (figure 1A) ≥ 50 embryons par expérience. Travaillez rapidement pour compléter injections par le cerf à 4 cellulese. </li><li> DFC-cible d&#39;injection MO: Recueillir des embryons immédiatement après la fécondation et incuber à 28,5 ° C. Lorsque les embryons ont atteint le stade de 256 cellules (~ 2,5 hpf), rapidement les charger dans une plaque d&#39;injection et injecter 1 nl fluorescente MO dans le jaune d&#39;≥ 100 embryons entre les stades 256-cellulaires et 1000 cellules (Figure 1B). </li><li> Jaune-injection ciblée MO: Recueillir des embryons immédiatement après la fécondation et incuber à 28,5 ° C. Au stade de dôme (~ 4 hpf), chargez les embryons dans une plaque d&#39;injection et injecter 1 nl fluorescente MO dans le jaune d&#39;≥ 100 embryons entre le dôme et les étapes épibolie 30% (figure 1C). </li></ol> 2. Sélection d&#39;embryons injectés pour l&#39;analyse <ol><li> Lorsque MO injecté embryons atteignent le stade à 75% épibolie (8 hpf), retirer les embryons non fécondés et les embryons morts, puis l&#39;écran qui vivent sous un microscope à fluorescence dissection pour la distribution de la MO fluorescent. Puis allow sélectionné embryons de se développer à 28,5 ° C. <ol><li> Pour mondial MO injections, sélectionner les embryons qui ont fluorescence uniformément répartis dans toute les cellules embryonnaires (figure 1D; figure 2A). </li><li> Pour DFC-cible injections MO, sélectionner les embryons qui fluorescente MO a diffusés dans tout le jaune d&#39;oeuf et semble concentrée sur la marge blastoderme dorsal (DFC) (figure 1E, figure 2B). A ce stade, il peut être difficile de visualiser les SFD fluorescentes en raison de fluorescence brillante dans le jaune d&#39;œuf sous-jacent. Prenez soin d&#39;exclure les embryons dans lequel la lampe fluorescente MO a incorporés dans des cellules embryonnaires autres que les SFD reste agrégées ou au site d&#39;injection (figure 2D). </li><li> Pour le jaune ciblées injections MO, sélectionner les embryons qui en MO fluorescence est uniformément réparties dans le jaune et le non-respect dans toutes les cellules embryonnaires (figure 1F, figure 2C). Encore une fois, retirez embryons dans lequel la fluorescence reste MOagrégées au niveau du site d&#39;injection. </li></ol></li><li> Entre les étapes 2-4-somites (~ 11 hpf), écran embryons une seconde fois sous un microscope à fluorescence en utilisant un plus fort grossissement. Ensuite, laisser embryons sélectionnés pour développer à 28,5 ° C. <ol><li> Pour les injections MO mondiaux, assurer embryons sélectionnés ont MO fluorescence répartie uniformément dans KV et toutes les cellules embryonnaires (figure 1D »; figure 2E). </li><li> Pour DFC-cible injections MO, soigneusement sélectionner les embryons qui ont fluorescence MO uniquement dans les cellules KV et le jaune (figure 1E). Embryons transgéniques qui expriment la GFP dans les cellules KV, tels que Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, peuvent aider à l&#39;identification des embryons dans lequel MO a été livré avec succès à des cellules KV (figure 2F). Jeter embryons avec MO fluorescence dans les cellules embryonnaires d&#39;autres cellules que les KV. </li><li> Pour le jaune ciblées injections MO, sélectionner les embryons qui ont fluorescence MO exclusivement dans le jaune (figure 1F &#39;: Figure2G). </li></ol></li></ol> 3. Les embryons de montage pour analyser l&#39;écoulement des fluides dans KV <ol><li> Pour analyser l&#39;écoulement du fluide asymétrique KV mondiale de la MO, MO DFC-cible ou jaune-ciblées embryons injectés MO, soigneusement dechorionate ~ 20 embryons entre 4-6 étapes somites (~ 11-12 hpf) avec une pince tranchants. </li><li> Préparer 50 ml de 1% à bas point de fusion d&#39;agarose et aliquote en tubes de 5 ml d&#39;être maintenu sous forme liquide dans un bain à sec à 42 ° C. </li><li> Transfert d&#39;un embryon à une diapositive dépression verre (Fournitures United Scientific, Inc) et retirer autant d&#39;eau que possible. Immobiliser l&#39;embryon en ajoutant assez chaud 1% à bas point de fusion d&#39;agarose pour juste couvrir l&#39;embryon (trop d&#39;agarose peuvent interférer avec l&#39;imagerie ultérieure). Comme l&#39;agarose se solidifie, utilisez une pince pour positionner l&#39;embryon tel que KV est orientée vers le haut (vue dorsale) (figure 1H). Monter 10 embryons avec un seul embryon par diapositive. Travaillez rapidement pour s&#39;assurer que toutes les injections dans l&#39;étape suivante sont complETED par le stade 10 somites (14 hpf). </li></ol> 4. L&#39;injection de microbilles fluorescentes dans KV <ol><li> Diluer Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 micron de diamètre des microsphères (Polysciences, Inc) à 1:50 dans de l&#39;eau stérile dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Mélanger la dilution 1:50 de microbilles soigneusement en tapotant le tube et charger 3 pi dans une aiguille capillaire. En utilisant la même microinjecteur utilisé pour MO injections (par exemple Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injecteur), briser la pointe de l&#39;aiguille avec une pince et d&#39;ajuster les paramètres d&#39;injection pour générer la chute d&#39;injection plus faible possible (&lt;0,5 nl). </li><li> Sous une loupe binoculaire, aligner l&#39;aiguille avec la lumière KV de l&#39;embryon d&#39;abord monté. Insérez l&#39;aiguille dans la lumière et injecter un petit volume (&lt;0,5 nl) de billes (figure 1G). Une pointe de l&#39;aiguille des petites et volume d&#39;injection petit sont critiques pour éviter KV dommageable. </li><li> Injecter tous les embryons montés. Une fois que l&#39;embryon a été injected, une goutte d&#39;eau stérile peut être ajouté au-dessus de l&#39;agarose pour l&#39;empêcher de se dessécher. Au cours de ces injections, les perles sont souvent obstacle à l&#39;ouverture de l&#39;aiguille. Cela exige de briser la pointe de l&#39;aiguille et en ajustant le volume d&#39;injection en modulant le réglage de la pression ou l&#39;heure de l&#39;appareil micro-injection. Remplacer l&#39;aiguille si elle s&#39;émousse assez pour causer des dommages importants lors de l&#39;injection. </li><li> Écran des embryons injectés pour la livraison réussie de perles sous un microscope composé fluorescent verticale (par exemple Zeiss AxioImager M1) à l&#39;aide d&#39;un objectif 20X. Tout d&#39;abord, déterminer si la structure KV est intacte en utilisant un éclairage en fond clair (figure 1J), puis utilisez la fluorescence pour observer les perles. Sélectionner les embryons dont les perles sont présents et se déplaçant à l&#39;intérieur de la lumière KV. Jeter les embryons atteints de lésions KV ou pas de perles flottantes KV. Il est facile de manquer KV et de livrer des perles pour les tissus voisins ou le jaune sous-jacent. En cas d&#39;échec, montage another 10 embryons et répétez la procédure d&#39;injection. </li></ol> 5. Visualisation et analyse des écoulements KV <ol><li> Pour chaque embryon sélectionné avec des perles à l&#39;intérieur KV, ajouter une goutte d&#39;eau stérile pour couvrir l&#39;agarose, puis observer KV sous le microscope composé fluorescent verticale en utilisant un objectif 63X d&#39;eau de trempage (Figure 1I). Alternativement, une lamelle peut être appliquée pour une utilisation avec de l&#39;eau non-objectifs de trempage et / ou des microscopes inversés. </li><li> Utiliser une caméra à haute vitesse monté sur le microscope (par exemple Zeiss AxioCamHSm) pour enregistrer un film de 10 secondes. Enregistrer à la fois les perles en utilisant le canal de fluorescence (environ 70 images / sec) et la lumière en utilisant un fond clair KV ou le contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) canal. </li><li> Pour visualiser tous les mouvements de perles au fil du temps, importer le film de billes fluorescentes en logiciel ImageJ (téléchargement gratuit sur <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">​​http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) unee créer une projection maximale de tous les signaux fluorescents dans le film. Pour effectuer la projection maximale dans ImageJ, cliquez sur &quot;Image → → Piles projet Z». Dans le projet «Z» fenêtre, projeter toutes les tranches avec le type de projection de &quot;l&#39;intensité maximale». Cette image peut être superposée à une image DIC du KV dans lequel les perles ont été imagées (figures 3A-B). </li><li> Les mouvements des billes individuelles peuvent être suivis en utilisant ImageJ. Un plugin (&quot;Alignement manuel&quot;) peut être téléchargé à <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> . Ouvrez le film fluorescent perles dans ImageJ et exécutez la fonction de suivi manuel. Dans la fenêtre de suivi manuel, vérifiez les paramètres &quot;show&quot; et les paramètres &quot;pour des intervalles de temps» et «x / y de calibrage&quot;. Sélectionner manuellement perles qui restent dans le plan focal du film pendant ≥ 50 images puis de suivre ≥ 5 billes par embryon. La trajectoire et la vitesse de chaque bille est générée par elogiciel de courrier (figures 3 CD). </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdc14B+phosphatase+contributes+to+ciliogenesis+in+zebrafish.">The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (2), 291-302 (2011).</li><li>Matsui, T., Bessho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetry+in+zebrafish.">Left-right asymmetry in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;utilisation spécifiques au stade injections de cibler MO à la lignée cellulaire DFC / KV est une approche utile pour étudier des cellules autonomie de la fonction des gènes et de phénotypes pléiotropes éviter causés par inactivation génique globale. Toutefois, ces injections peuvent être techniquement difficile. L&#39;injection de MO entre les étapes 256-cellulaires et 1.000 cellules peut aboutir à trois résultats possibles: 1) la MO reste agrégées au site d&#39;injection, 2) les diffuse à travers...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Norme de contrôle oligo-Lissamine étiqueté </td><td> Gene Tools, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Personnalisée Rock2b morpholino oligo </td><td> Gene Tools, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 micron microsphères </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 24054 </td></tr></tbody></table>

analysis of gene function and visualization of cilia-generated fluid flow in kupffer's vesicle

Les organes internes comme le cœur, le cerveau et l&#39;intestin développer gauche-droite (LR) asymétries qui sont critiques pour leurs fonctions normales 1. Cils mobiles sont impliqués dans l&#39;établissement LR asymétrie dans des embryons de vertébrés, y compris la souris, grenouille, poisson zèbre et 2-6. Ces «cils LR engendre de l&#39;écoulement du fluide asymétrique qui est nécessaire pour déclencher une asymétrie conservée Nodal (TGF-β superfamille) cascade de signalisation dans le mésoderme de la plaque latérale gauche, ce qui est pensé pour fournir des informations de motifs LR pour le développement des organes 7. Ainsi, pour comprendre les mécanismes sous-jacents de motifs LR, il est essentiel d&#39;identifier les gènes qui régulent l&#39;organisation des cellules ciliées LR, la motilité et la longueur des cils LR et leur capacité à générer des flux robuste asymétrique. Dans l&#39;embryon du poisson zèbre, les cils LR sont situés dans des vésicules de Kupffer (KV) 2,4,5. KV est constitué d&#39;une seule couche de cellules épithéliales monociliatedqui entourent une lumière remplies de liquide. Cartographie destin a montré que KV est dérivé d&#39;un groupe de ~ 20-30 cellules appelées cellules précurseur dorsales (SFD) qui migrent à la marge blastoderme dorsal pendant les étapes épibolie 8,9. Au cours des phases précoces de somites, le cluster DFC et se différencient en cellules épithéliales ciliées pour former KV dans le bourgeon caudal de l&#39;embryon 10,11. La capacité d&#39;identifier et de suivre les SFD en combinaison avec transparence optique et le développement rapide de l&#39;embryon du poisson zèbre zèbre faire-KV un excellent modèle pour étudier les cellules ciliées LR. Fait intéressant, les progéniteurs de la lignée cellulaire DFC / KV conserver des ponts cytoplasmiques entre la cellule vitelline jusqu&#39;à 4 heures après la fécondation (HPF), tandis que les ponts cytoplasmiques entre la cellule vitelline et d&#39;autres cellules embryonnaires près au bout de 2 hpf 8. Profitant de ces ponts cytoplasmiques, nous avons développé une stratégie d&#39;injection spécifique du stade de livrer morpholino oligonucleotides (MO) uniquement aux SFD et démontable de la fonction d&#39;un gène ciblé dans ces cellules 12. Cette technique crée des embryons chimères dans lesquelles la fonction du gène est renversé dans la lignée DFC / KV développement dans le contexte d&#39;un embryon de type sauvage. Pour analyser l&#39;écoulement du fluide asymétrique KV, on injecte des microbilles fluorescentes dans la lumière KV et enregistrement de mouvement de billes utilisant la vidéomicroscopie 2. L&#39;écoulement du fluide est facilement visualisée et peut être quantifiée en suivant le déplacement perle au fil du temps. Ici, en utilisant la phase spécifique DFC ciblée technique inactivation génique et l&#39;injection de microbilles fluorescentes dans KV à visualiser la circulation, nous présentons un protocole qui fournit une approche efficace pour caractériser le rôle d&#39;un gène particulier au cours du développement et de la fonction KV.

Spécifiques au stade injections MO fournir une approche utile pour analyser la fonction des gènes dans des compartiments spécifiques de l&#39;embryon. La figure 1 présente un diagramme des stratégies d&#39;injection utilisés pour tester la fonction des gènes dans des PLC / KV cellules et comment introduire des billes fluorescentes de visualiser l&#39;écoulement du fluide dans KV. La distribution des MO fluorescente succès spécifiques au stade embryons injectés est représenté schématiquemen...

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Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer&#039;s Vesicle

Cilia généré par l&#39;écoulement du fluide dans des vésicules de Kupffer (KV) contrôle de gauche à droite structuration de l&#39;embryon de poisson zèbre. Nous décrivons ici une technique permettant de moduler la fonction du gène spécifiquement dans les cellules KV. En outre, nous montrons comment livrer des billes fluorescentes dans KV de visualiser l&#39;écoulement du fluide.

L&#39;analyse de la fonction des gènes et visualisation de Cilia généré par l&#39;écoulement des fluides dans des vésicules de Kupffer

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

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Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

14.7K vues.  Upstate Medical University. Cilia généré par l'écoulement du fluide dans des vésicules de Kupffer (KV) contrôle de gauche à droite structuration de l'embryon de poisson zèbre. Nous décrivons ici une technique permettant de moduler la fonction du gène spécifiquement dans les cellules KV. En outre, nous montrons comment livrer des billes fluorescentes dans KV de visualiser l'écoulement du fluide.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Recherche

Biologie

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induction et les essais de l&#39;hypoxie en culture cellulaire

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as knockout mutants, wild accessions and advanced breeding populations, there is a rising burden for gene functional annotation. In this protocol, annotation of plant gene function using combined co-expression gene analysis, metabolomics and informatics is provided (Figure 1). This approach is based on the theory of using target genes of known function to allow the identification of non-annotated genes likely to be involved in a certain metabolic process, with the identification of target compounds via metabolomics. Strategies are put forward for applying this information on populations generated by both forward and reverse genetics approaches in spite of none of these are effortless. By corollary this approach can also be used as an approach to characterise unknown peaks representing new or specific secondary metabolites in the limited tissues, plant species or stress treatment, which is currently the important trial to understanding plant metabolism.

Combination of genomics, co-expression gene analysis and the identification of target compounds via metabolism give gene functional annotation.

Annotation de la fonction des gènes des plantes par l&#39;intermédiaire de génomique, la métabolomique et combinés informatique

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

L&#39;Assemblée et l&#39;application des «Shear Anneaux»: A Novel Endothelial Modèle pour Orbital, unidirectionnel et périodique Fluid débit et contrainte de cisaillement

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

Hybridation in situ pour Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...