Cette méthode peut aider à comprendre les questions clés dans le domaine de la migration des cellules immunitaires, telles que la façon dont le cytosquelette envoie des forces de cisaillement et comment les ligands et les chimiokines de l’intégrine affectent la migration induite par le flux des leucocytes. Le principal avantage de cette technique est que c’est un nouveau type d’analyse de migration qui est facile pour les débutants à effectuer. Il n’utilise que de l’équipement disponible dans le commerce et des reagents, ainsi que des logiciels libres.
Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des cellules marginales de la zone B, elle peut également être appliquée à d’autres cellules immunitaires, telles que les cellules T activées. La veille de l’expérience, décongeler un aliquot d’ICAM-1, et le diluer dans PBS à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre. Ensuite, ajoutez 30 microlitres d’ICAM-1 aux chambres désirées d’une glissière d’écoulement.
Placez la glissière dans une chambre humide et réglez-la à quatre degrés Celsius pour l’incuber pendant la nuit. Le lendemain, lavez la chambre en ajoutant 100 microlitres de PBS à un puits, puis en retirant 100 microlitres de l’autre puits de la chambre. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de blocage à une chambre, et incubez la lame dans une chambre humide à température ambiante pendant 90 minutes.
Ensuite, lavez la chambre en ajoutant 100 microlitres de PBS à un puits, en la retirant de l’autre puits, puis ajoutez 100 microlitres de tampon de migration à la chambre. La diapositive est maintenant prête à l’emploi. Conservez-le dans une chambre humide à température ambiante jusqu’à l’expérience.
Tout d’abord, branchez une pompe fluide et fixez l’unité fluidique. Ensuite, allumez le logiciel de la pompe. Ensuite, lavez le tube une fois avec cinq à 10 millilitres de tampon de migration.
Cela prendra environ une minute. Ensuite, ajoutez 11,7 millilitres de tampon de migration également aux deux réservoirs et éliminez les bulles d’air. Maintenant, serrez le tube à environ 10 centimètres du morceau de connecteur, et placez l’unité fluidique dans la chambre d’incubation chauffée sur le microscope.
Dans le logiciel, réglez le choix de diapositive à micro-slide VI 0.4 et l’option tube au blanc. En outre, réglez le stress de cisaillement désiré à environ quatre dynes par centimètre carré et le temps d’imagerie à 30 minutes. Ensuite, réglez le débit désiré et le stress de cisaillement en entrant les valeurs dans le logiciel de pompe.
Ensuite, préchauffer la chambre d’incubation du microscope, unité fluidique, et la migration tampon aliquots à 37 degrés Celsius. Une fois chaude, testez la pompe fluide, en vous assurant que le tampon de migration circule dans les réservoirs et qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le système. Tout d’abord, isoler les leucocytes et purifier les cellules marginales de la zone B décrites dans le protocole texte qui l’accompagne.
Ensuite, nettoyez le fond de la lame avec un tissu amorti à l’éthanol. Ajouter 30 microlitres de la suspension cellulaire dans un puits de la chambre et retirer 30 microlitres du tampon de migration stocké de l’autre puits. Couvrez la lame et incubez-la pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de s’attacher.
Ensuite, ajoutez lentement un tampon de migration préchauffé à chaque puits de la glissière jusqu’à ce qu’un ménisque positif s’élève du puits. Retirez les bulles d’air avec la pointe pipette. Il est important de maintenir la cohérence avec les facteurs qui affectent l’adhérence cellulaire, afin de garder les tampons et les cellules à 37 degrés, et d’éviter d’utiliser une force excessive lors de l’entrée du tampon dans la chambre.
Serrez la glissière jusqu’au stade du microscope et retirez le côté non marqué du tube fluide du connecteur. Ensuite, remplissez l’extrémité du tube avec tampon de migration jusqu’à ce qu’un ménisque positif sans bulles d’air s’élève de la fin. Retournez l’extrémité du tube et insérez-le dans le puits supérieur de la chambre d’écoulement.
Tout en gardant le tube serré, répétez la procédure pour l’extrémité marquée du tube. Maintenant, passez le système d’imagerie en mode Live, et sélectionnez un champ de vision qui est au milieu de la diapositive. Ici, mettre l’accent sur les cellules, puis se déco concentrer légèrement pour améliorer le contour noir des cellules et de produire un intérieur blanc.
Le fond noir et le centre blanc seront plus faciles à utiliser dans le programme de suivi automatisé. Configurez le programme de séquence d’imagerie pour enregistrer une image toutes les cinq secondes pendant 30 minutes à l’aide d’un objectif sec 10x. Ensuite, commencez à enregistrer.
Retirez la pince du tube et allumez la pompe. Cela fera se laver les cellules non adhérentes et les cellules adhérentes commenceront à migrer. À la fin du programme d’imagerie, étiquetez et enregistrez le film.
Si vous utilisez un inhibiteur ou un modificateur de la migration cellulaire, il peut être ajouté soit aux cellules de la suspension cellulaire avant de les mettre sur la diapositive ou au tampon de migration dans l’unité fluidique. Pour commencer l’analyse automatique de la voie de migration, ouvrez le programme ImageJ. Copiez MTrack2_kt fichier Java dans le dossier Plugins ImageJ.
Dans le menu Plugins, sélectionnez Compiler et exécuter. Ensuite, redémarrez ImageJ, et le plugin doit apparaître dans le menu Plugins. Ouvrez la pile d’images du film de migration cellulaire dans ImageJ, et traiter les images telles qu’elles sont montrées ici afin de convertir la vidéo des images couleur en images à contraste élevé montrant les cellules comme des objets noirs sur un fond blanc.
Ensuite, aiguiser les images deux fois, despeckle les images, puis convertir les images en huit bits. Dans le menu Image, accédez au submenu Ajuster la luminosité/contraste et placez le curseur contrasté au contraste maximal. Cela fera apparaître les cellules comme des objets blancs sur un fond noir.
Ensuite, retournez au sous-ménu du seuil d’ajustement pour vous assurer que les cellules apparaissent comme des objets noirs sur un fond blanc. Maintenant, exécutez le plugin automatique de suivi cellulaire MTrack2 kt. Sur l’écran d’options, réglez la taille des particules au minimum à un pixel et la taille des particules maximale à 30 pixels.
Réglez la valeur de vitesse à 10 pixels, bien que les cellules marginales de zone B ne dépassent généralement pas deux pixels sur les images successives qui sont à cinq secondes d’intervalle. Les pistes cellulaires sont maintenant prêtes à être analyses à l’aide de l’outil ibidi Chemotaxis. Ces deux champs montrent les trajectoires de migration des cellules marginales de la zone B qui ont été ensemencées sur des glissières enduites de l’ICAM-1.
Les cellules ont été suivies automatiquement avec MTrack2 en utilisant les méthodes décrites dans cet article. Sur la gauche, les cellules ont été photographiées dans des conditions statiques, et sur les cellules droites ont été exposées à un flux de cisaillement de quatre dynes par centimètre carré. Les pistes cellulaires individuelles peuvent être importées dans l’outil ibidi Chemotaxis pour générer des parcelles de piste de chaque film.
Ici, les traces cellulaires individuelles sont de couleur rouge pour indiquer qu’elles se sont terminées en aval de leur point d’origine ou noires si elles se terminaient en amont. L’analyse des pistes cellulaires de quatre films individuels pour les deux flux et aucune condition de flux sont montrés ici. Cela inclut l’indice moyen de migration directionnelle, la vitesse cellulaire, la droititude du chemin et la distance finale en ligne droite pour les deux conditions.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’image de la migration directionnelle des cellules marginales de la zone B vers le flux de cisaillement et comment suivre automatiquement les cellules. Au cours de cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie TIRF peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions, telles que la façon dont le cytosquelette et les intégrines réagissent au stress du cisaillement?
