Ce projet de recherche a été soutenue par Nombre de prix R21AA017735 (YS) des Instituts national sur l&#39;abus d&#39;alcool et l&#39;alcoolisme. Le contenu relève de la seule responsabilité de l&#39;auteur et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national sur l&#39;abus d&#39;alcool et l&#39;alcoolisme ou de la National Institutes of Health. L&#39;auteur tient également à remercier Charisse Montgomery pour éditer ce manuscrit.

1. Animaux d&#39;élevage et de traitement de peptide trophique <ol><li> Race C57BL/mice en plaçant les souris femelles (~ 6 semaines, poids moyen 20 g) dans les cages du mâle pendant 2 heures. </li><li> Voir pour un bouchon de spermatozoïdes et / ou frottis vaginal immédiatement après. </li><li> Si elle est positive, désigner ce point de temps que embryonnaire jour 0 (E0). </li><li> Le E7, poids-match femelles gravides au contrôle et à des groupes de traitement (3 groupes) sont attribuées comme décrit récemment 4: 1) L&#39;alcool (éthanol) groupe de diète liquide (ALC), 2) nourri en groupe contrôle (PF); 3) groupe de traitement peptide, qui devrait recevoir une injection intrapéritonéale (IP) de l&#39;ADNF-9 peptide instar de l&#39;alcool régime liquide d&#39;exposition (ALC/ADNF-9). Les détails de la préparation de la SLA et les régimes PF et la procédure d&#39;injections IP peuvent être trouvées dans notre récente 4 de travail. </li><li> Mesurer alimentation quotidienne de liquide d&#39;alcool qui peut être fourni que le libre accès comme la seule source de nutriments. Diète liquide PF attelé individuellement to un barrage ALC peut être mesurée tous les jours ainsi. </li><li> Le volume de diète liquide consommé au cours des 24 heures précédentes peut être enregistré à partir de 30 ml gradué tubes à bouchon à vis et l&#39;alimentation fraîchement préparée doit être fournie chaque jour à partir de E7 à E13. </li></ol> 2. Dissection du fœtus et microdissection cerveaux foetaux <ol><li> Le sacrifice des souris gravides sur E13 par euthanasie profondément les souris avec une procédure CO 2 suivie d&#39;une dislocation cervicale. </li><li> Nettoyer le site d&#39;incision abdominale à l&#39;éthanol 70%. </li><li> Faire une incision abdominale à l&#39;aide des ciseaux et des pinces stériles. </li><li> Une fois l&#39;abdomen est ouvert, disséquer l&#39;utérus en le tenant avec une pince et en utilisant les autres pinces pour arracher le mésomètre loin de l&#39;utérus. Assurez-vous de faire cette procédure lentement afin d&#39;éviter de percer les embryons. </li><li> Retirez les embryons de l&#39;utérus et les transférer dans un plat de culture cellulaire (60 mm x 15 mm) contenant une solution saline équilibrée de Hanks<html> (HBSS) dans de l&#39;eau glacée. </li><li> Disséquer le cerveau du fœtus à partir des embryons entiers sous loupe binoculaire pour microdissection. </li><li> En utilisant des pinces ultra-fines pour microdissection, retirer la peau des embryons à la partie supérieure de la tête pour exposer le crâne. </li><li> Une fois que le crâne est exposé clairement et visualisé sous la loupe binoculaire, microdissection, puis décoller le crâne à partir de la partie postérieure du cerveau à la moelle épinière et les zones du tronc cérébral. </li><li> Assurez-vous de détacher la pièce de crâne par morceau d&#39;arrière en partie antérieure de la tête. </li><li> Une fois que le cerveau du fœtus sont exposés visuellement, procéder à leur extraction. </li><li> Disséquer le cerveau du fœtus à partir de la base du bulbe olfactif ébauche à la base de la métencéphale. </li><li> Postfix tout disséqué les cerveaux foetaux dans du paraformaldéhyde 4% pendant 2-3 jours. Vous pouvez également congeler les autres cerveaux foetaux de chaque barrage si vous les testez pour le Western Blot ou dosages enzymatiques. </li></ol>nt &quot;&gt; Remarque: Les procédures d&#39;utilisation des animaux ont été approuvés par le soin des animaux institutionnel et l&#39;utilisation Comité de l&#39;Université de Toledo qui sont en conformité avec les directives de l&#39;Institutional Animal Care et utiliser Comité à la National Institutes of Health et le Guide pour l&#39; soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 3. Intégration Brains fœtus dans de la gélatine pour la coupe <ol><li> Préparer 10% de gélatine de catégorie A. </li><li> Remplir un moule pelable intégration à mi-chemin et attendre que les solidifie gélatine. </li><li> Placer le contrôle et fœtale cerveaux side-by-side traitée avant la naissance sur le dessus de la gélatine solidifiée. Cela permet de garder des conditions uniformes de détection immunologique de la mort cellulaire entre les deux groupes témoins et expérimentaux. </li><li> Ajouter la gélatine liquide sur le dessus du cerveau du fœtus pour faire un moule complet (assurez-vous que la gélatine n&#39;est pas trop chaud). </li><li> Réfrigérer le moule de gélatine préparée qui détient le cerveau du fœtus pendant 15 min. </li><li> Décollezle moule en plastique d&#39;enrobage et ensuite transférer les pré-faites de gélatine contenant cerveau du fœtus dans du paraformaldéhyde 4% pendant deux jours. </li><li> Lieu et partie fixe cerveau du fœtus en gélatine à l&#39;aide vibratome machine à découpe (Leica VT 1000S) à 50 um d&#39;épaisseur pour la coupe coronale. Cette épaisseur est testé dans nos études, car il offre de meilleures caractéristiques anatomiques. En outre, les épaisseurs de 25 um et plus peuvent également être testés avec cette technique impliquant intégrée de cerveau du fœtus en gélatine à 10%. Notez que les coupes coronales ont été coupés à l&#39;aide vibratome au niveau de l&#39;éminence des noyaux gris centraux du cerveau antérieur sur </li><li> Recueillir les sections du cerveau du fœtus dans (PBS) solution saline tamponnée au phosphate. </li><li> Montez les sections du cerveau du fœtus dans Superfrost majoré des diapositives dans l&#39;eau. </li><li> Sécher les sections montées pour 15 min. </li><li> Placer les lames (monté avec les sections du cerveau du fœtus) dans PBS pour le test le lendemain de réaction TUNEL. </li></ol> 4. TUNEL réaction de Detection de la mort cellulaire ou apoptose (TUNEL: TdT médiée dUTP Nick étiquetage End; TdT: désoxynucléotidyltransférase terminale). Ce test vise à déterminer la mort cellulaire. <ol><li> Traiter les sections du cerveau du fœtus montés dans Superfrost plus diapositives avec la protéinase K (20 pg / ml) pendant 5 min à 37 ° C (300 pi de la protéinase K mixte dans 20 ml de PBS). Les lames sont assemblées en 5 Plend ouvert maile). </li><li> Rincer les coupes de cerveau fœtal (montés dans les diapositives) avec PBS trois fois pendant 5 min sous orbital. </li><li> Incuber les sections avec 3% de H 2 O 2 dans le méthanol pendant 10 min à température ambiante (3 ml 30% H 2 O 2 dans 27 ml de méthanol à 100%) (diapositives ne doivent pas être dans un shaker). </li><li> Rincer sections avec PBS trois fois pendant 5 min dans un agitateur orbital. </li><li> Incuber les coupes dans une solution de perméabilisation (0,1% Triton X-100 à 0,1% de citrate de sodium) pendant 2 minutes sur de la glace (4 ° C) (100 TritonX pi + 0,1 g de citrate de sodium + 99,9 ml distilléeeau d). </li><li> Rincer sections dans PBS deux fois pendant 5 min dans un agitateur orbital. </li><li> Zone sèche autour des sections dans les coulisses. </li><li> Dessinez barrière sur des lames Superfrost majoré en utilisant Pen PAP. Ceci a pour but d&#39;éviter toute fuite de la solution qui est utilisée pour traiter les articles pour la détection de cellules positives au TUNEL. </li><li> Incuber les sections avec le mélange de réaction TUNEL (50 pl de la bouteille 1 et 450 ul de la bouteille 2) pendant 1 heure à 37 ° C, la commande sera utilisé par incubation dans une solution de la bouteille 2. </li><li> Rincer avec du PBS trois fois 5 minutes sous Orbit shaker. </li><li> Zone sèche autour du tissu. </li><li> Incuber les coupes avec convertisseur-POD pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Rincer les sections trois fois pendant 5 minutes avec Tris HCl (pH 7,5, 0,05 M). </li><li> Incuber les sections pour 7 min à 0,05% de tétrachlorhydrate 3&#39;-3 &#39;-diaminobenzidine (DAB) et 0,003% de H 2 O 2 (25 ml Tris HCl, pH 7,5, 0,05 M + 25 pi 3% de H 2 0 2 + 500 DAB ul) Sous Oribtal agitateur à 4 ° C (dans la glace) et dans l&#39;obscurité (assurez-vous d&#39;effectuer cette procédure à nouveau 5 Plend ouvert mailer). </li><li> Rincer les sections avec PBS trois fois 5 minutes sous orbital. </li><li> Gardez les sections de lames dans du PBS pour pas plus de 24 heures dans du PBS, puis de les traiter pour la coloration de Nissl comme indiqué dans le protocole de la prochaine section. </li></ol> Note: DAB est un cancérogène. Utiliser des gants et nettoyer tous les plats utilisés avec l&#39;eau de Javel une fois fini avec toutes les expériences. 5. Coloration Nissl pour la préparation de coupes de cerveau fœtal pour l&#39;observation microscopique <ol><li> Procédure de coloration Nissl doit être effectuée sous une hotte de sécurité biologique. </li><li> Rincer les sections des diaporamas avec de l&#39;eau déminéralisée pendant 2 min. </li><li> Incuber les sections de l&#39;éthanol à 70% pendant 2 min. </li><li> Incuber les sections dans l&#39;éthanol à 95% pendant 6 min. </li><li> Incuber les sections de l&#39;éthanol à 70% pendant 2 min. </li><li> Rincer les sections déminéralisée water pendant 2 min. </li><li> Incuber les sections de crésyl violet Stain pendant 3 min. </li><li> Rincer les sections dans l&#39;eau déminéralisée pendant 2 min. </li><li> Incuber les sections de l&#39;éthanol à 70% pendant 2 min. </li><li> Incuber les sections dans 95% d&#39;éthanol + 3 ml d&#39;acide acétique glacial pendant 3 min. </li><li> Incuber les sections dans l&#39;éthanol à 95% pendant 2 min. </li><li> Incuber les sections dans l&#39;éthanol à 100% pendant 2 min trois fois. </li><li> Incuber les sections dans le xylène pendant 10 minutes trois fois. </li><li> Diapositives détenant les sections du cerveau du fœtus peuvent être montés à l&#39;aide Permount et des lames de verre de glissement de couverture. </li><li> Laisser le diapositives montées nuit avant l&#39;observation et l&#39;analyse microscopique. </li><li> Observation et microphotographies au microscope peuvent être réalisées en vertu de Leica microscope droit. </li></ol>

<ol>
	<li>Sari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neuroprotective+protein-derived+peptide,+NAP,+preventing+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).</li><li>Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+peptide,+colivelin,+prevents+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mice:+signaling+pathway+investigations.">A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations.</a> Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).</li><li>Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+selective+neurotransmitters+in+fetal+brains+of+prenatally+alcohol-treated+C57BL/6+mice:+quantitative+analysis+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).</li><li>Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor-derived+peptide+prevents+alcohol-induced+apoptosis,+in+part,+through+Bcl2+and+c-Jun+N-terminal+kinase+signaling+pathways+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 202, 465-473 (2012).</li><li>Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+proteins+in+fetal+brains+of+alcohol-treated+prenatally+C57BL/6+mice:+a+proteomic+investigation.">Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation.</a> Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).</li><li>Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+sequence+of+a+novel+protein+containing+a+femtomolar-activity-dependent+neuroprotective+peptide.">Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide.</a> J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).</li><li>Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor:+structure-activity+relationships+of+femtomolar-acting+peptides.">Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).</li><li>Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+fetal+demise+and+growth+restriction+in+a+mouse+model+of+fetal+alcohol+syndrome.">Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).</li><li>Sari, Y., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+deficits+associated+with+fetal+alcohol+exposure+may+be+protected,+in+part,+by+peptides+derived+from+activity-dependent+neurotrophic+factor+and+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).</li><li>Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+femtomolar-acting+neuroprotective+peptide.">A femtomolar-acting neuroprotective peptide.</a> J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).</li><li>Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+human+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein.</a> J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).</li><li>Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoactive+intestinal+peptide+(VIP)+prevents+neurotoxicity+in+neuronal+cultures:+relevance+to+neuroprotection+in+Parkinson's+disease.">Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease.</a> Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).</li><li>Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIP+and+peptides+related+to+activity-dependent+neurotrophic+factor+protect+PC12+cells+against+oxidative+stress.">VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress.</a> J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).</li></ol>

Pas de révélations à faire.

La méthodologie et la technologie présentée dans cette étude mettent en évidence les effets de l&#39;exposition prénatale à l&#39;alcool dans le cerveau du fœtus et le rôle des peptides trophiques dans la prévention de ces effets. Ceux-ci peuvent fournir des informations sur la façon d&#39;étudier d&#39;autres drogues ou d&#39;autres substances chimiques toxiques dans le cerveau du fœtus au cours des différentes étapes de la grossesse. En ce qui concerne le paradigme de reprod...

L&#39;objectif des méthodes expérimentales décrites ici est d&#39;évaluer les effets neuroprotecteurs de peptides trophiques dans un modèle d&#39;exposition d&#39;alcoolisation fœtale en utilisant plusieurs techniques concernant la reproduction, l&#39;alimentation, microdissecting, et la détection de la mort cellulaire. Le travail de notre laboratoire a impliqué une diète liquide mélangé avec de l&#39;alcool comme un modèle de consommation d&#39;alcool modérée, ce qui pourrait être similaire à un paradigme à la consommation humaine en termes de la quantité d&#39;alcool consommée 1-5. Nous et d&#39;autres avons identifié trois peptides dérivés qui sont neuroprotecteur contre les effets délétères de l&#39;exposition d&#39;alcoolisme foetal. Les études portant sur l&#39;exposition à l&#39;alcool pendant les stades embryonnaires utilisant des modèles animaux peuvent conduire à l&#39;identification des mécanismes potentiels de neuroprotection et de permettre le développement de procédures d&#39;intervention. Cela peut fournir suffisamment d&#39;informations sur les effets neuroprotecteurs et l&#39;atténuation des effets délétères de l&#39;exposition à l&#39;alcool pendant la grossesse. Prévention possible des effets de l&#39;exposition prénatale à l&#39;alcool peut impliquer le traitement des souris gravides avec des peptides qui ont été montrés pour être impliqués dans la neuroprotection in vitro et in vivo 6,7 1,2,4,8,9. Parmi ces peptides, SALLRSIPA, connu sous le nom ADNF-9 ou SAL, est dérivé d&#39;activité dépendant de facteur neurotrophique (ADNF) 7,10. Un autre peptide avec la séquence NAPVSIPQ peptide, appelé PAN, dérivé de la protéine neuroprotectrice dépendant de l&#39;activité (ADNP) 6,11, a démontré un effet protecteur puissant contre le stress oxydatif associé à l&#39;exposition à l&#39;alcool 12,13. En outre, nous avons récemment identifié un nouveau peptide synthétisé, colivelin qui semble jouer un rôle clé neuroprotecteur dans le alcoolisation fœtale modèle d&#39;exposition 2. Colivelin est composé de ADNF-9 et AGA (C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). L&#39;importance de l&#39;utilisation de ces peptides, c&#39;est qu&#39;ils ont la capacité detraverser la barrière sang-cerveau pour prévenir les effets de l&#39;apoptose induite par l&#39;alcool et les déficits de croissance du cerveau. Les méthodes expérimentales ont utilisé des souris C57BL / 6 pour tester les effets neuroprotecteurs contre l&#39;apoptose induite par l&#39;alcool. Nous avons adopté une fenêtre de 2 heures au lieu de reproduction pendant la nuit afin d&#39;estimer avec précision le jour embryonnaire 0 (E0), car il peut être révélée par la détection d&#39;un bouchon de sperme et un frottis vaginal 1-5. Nous avons utilisé une diète liquide avec des tubes d&#39;alimentation, car cela est considéré comme libre accès au lieu de la livraison de l&#39;alcool par voie gavage, ce qui peut induire un stress à des souris gravides. D&#39;autre part, microdissection peut être difficile en raison de la douceur du tissu du cerveau du fœtus, ce qui peut être rencontrée en disséquant le cerveau du fœtus aux stades embryonnaires. Ici, nous montrons techniques visualisées pour faire face à tous les défis impliquant microdissection. En outre, depuis le sectionnement du cerveau du fœtus peut aussi être difficile, nous avons adoptéune technique qui consiste à intégrer le cerveau du fœtus en gélatine à l&#39;aide pelable intégration des moules. Nous avons réussi à réduire le cerveau du fœtus dans les sections flottantes à 50 um d&#39;épaisseur. Cela nous permet d&#39;étudier des modifications de protéines contenu dans les sections du cerveau du fœtus, y compris l&#39;identification de la mort cellulaire.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus Slides</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48311-703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAP PEN</td>
 <td>Research Products Int. Corp.</td>
 <td>195506</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-Plend Open Mailer </td>
 <td>Heathrow Scientific, LLC</td>
 <td>HS 15983G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peel away embedding molds</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70182</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>In situ cell death detection kit, POD</td>
 <td>Roche Diagnostics, Inc</td>
 <td>11684817910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14170-120 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelatin Type A</td>
 <td>FisherScientific</td>
 <td>G8-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc </td>
 <td>Leica M60, KL 200 LED</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro-Vibratome</td>
 <td>Leica, Inc </td>
 <td>Leica VT 1000S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Ultra Fine Forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11370-40</td>
 <td>2 pairs</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Graduate 30 ml feeding tubes</td>
 <td>Dyets, Inc </td>
 <td>900012 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vitamin Mix </td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8031 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral Mix</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8598 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maltose Dextrin</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>3650 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons</td>
 <td>111000190-SS05 </td>
 <td>Pharmco-AAPER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc</td>
 <td>LEICA DM 4000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

experimental methods for testing the effects of neurotrophic peptide, adnf-9, against alcohol-induced apoptosis during pregnancy in c57bl/6 mice

Les modèles expérimentaux pour étudier les effets de l&#39;exposition prénatale à l&#39;alcool au cours de stades embryonnaires de la croissance du cerveau du fœtus sont difficiles. Cela est principalement dû à la difficulté de microdissection du cerveau du fœtus et leur sectionnement pour la détermination des cellules apoptotiques causées par l&#39;exposition prénatale à l&#39;alcool. Les expériences décrites ici fournir des techniques visualisées à partir des souris d&#39;élevage à l&#39;identification de la mort cellulaire dans les tissus du cerveau du fœtus. Cette étude a utilisé C57BL / 6 que le modèle animal pour l&#39;étude de l&#39;exposition d&#39;alcoolisation fœtale et le rôle du peptide trophique contre l&#39;apoptose induite par l&#39;alcool. La sélection consiste en une fenêtre de matage en 2 heures pour déterminer le degré exact de l&#39;âge embryonnaire. Un modèle d&#39;exposition d&#39;alcoolisation fœtale établie a été utilisée dans cette étude afin de déterminer les effets de l&#39;exposition prénatale à l&#39;alcool dans le cerveau du fœtus. Cela implique le libre accès à l&#39;alcool ou nourri en régimes liquides comme la seule source de nutriments pour les souris enceintes. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Les techniques impliquant dissection des fœtus et microdissection du cerveau du fœtus sont décrites avec soin, puisque celle-ci peut être difficile. Microdissection nécessite un microscope stéréoscopique et pince ultra-fines. Procédures étape par étape pour disséquer le cerveau du fœtus sont fournis visuellement. Les cerveaux sont disséqués foetales à partir de la base du bulbe olfactif ébauche à la base de la métencéphale. Pour enquêter sur l&#39;apoptose, le cerveau du fœtus sont d&#39;abord ancrées dans la gélatine à l&#39;aide d&#39;un moule pelable afin de faciliter leur sectionnement avec un appareil vibratome. Cerveau fœtal embarqués et fixes en paraformaldéhyde sont facilement sectionné, et les sections flottantes peuvent être montés en plus des diapositives SUPERFROST pour la détermination de l&#39;apoptose ou mort cellulaire. TUNEL (TdT médiée dUTP Nick étiquetage End; TdT: désoxynucléotidyltransférase terminale) test a été utilisée pour identifier la mort des cellules ou des cellules apoptotiques. Il est à noter que l&#39;APoptosis et la cytotoxicité à médiation cellulaire sont caractérisés par la fragmentation de l&#39;ADN. Ainsi, les cellules TUNEL positifs visualisés sont révélateurs de la mort des cellules ou des cellules apoptotiques. Les modèles expérimentaux ici fournissent des informations sur l&#39;utilisation d&#39;un régime liquide établi pour étudier les effets de l&#39;alcool et le rôle des peptides neurotrophiques dans le cerveau pendant la grossesse foetus. Il s&#39;agit de reproduction et d&#39;alimentation des souris gravides, microdissecting cerveau du fœtus, et la détermination de l&#39;apoptose. Ensemble, ces techniques visuelles et textuelles peuvent être une source d&#39;enquêter sur l&#39;exposition prénatale de substances nocives dans le cerveau du fœtus.

Les méthodes expérimentales décrites ici montrent qu&#39;une fenêtre de sélection de 2 heures est essentielle pour estimer stade gestationnel précis. Nous avons démontré la dissection des embryons à l&#39;âge de E13. Nous avons également démontré microdissection du cerveau fœtal à E13. La procédure comporte plusieurs étapes (AC), tel que décrit dans la figure 1. Cerveau du fœtus sont disséqués à partir de la base du bulbe olfactif de primordium à la base de la métencéphale <stro...

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Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Les modèles expérimentaux proposés ici se concentrer sur l&#39;étude des effets de l&#39;exposition à l&#39;alcool dans l&#39;apoptose et l&#39;application de peptide neurotrophique pendant la grossesse dans le cerveau du fœtus. Une description détaillée de l&#39;élevage à la collecte de cerveau du fœtus est décrite. Techniques pour la détermination de l&#39;apoptose sont également décrites en détail.

Méthodes expérimentales pour tester les effets du peptide neurotrophique, ADNF-9, contre l&#39;apoptose induite par l&#39;alcool pendant la grossesse dans C57BL / 6

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K vues.  University of Toledo. Les modèles expérimentaux proposés ici se concentrer sur l'étude des effets de l'exposition à l'alcool dans l'apoptose et l'application de peptide neurotrophique pendant la grossesse dans le cerveau du fœtus. Une description détaillée de l'élevage à la collecte de cerveau du fœtus est décrite. Techniques pour la détermination de l'apoptose sont également décrites en détail.

Vidéo: Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Méthodes de manipulations expérimentales après section du nerf optique dans le SNC des mammifères

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Recherche

Neurosciences

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Cultures organotypiques cérébelleuse: Défis apoptotiques et détection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, latéral Septal Nucleus- et le striatum spécifique<em&gt; In Utero</em&gt; L&#39;électroporation dans la souris C57BL / 6

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

Modèles expérimentaux pour étudier la neuroprotection du postconditionnement acide contre l&#39;ischémie cérébrale

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the application of these techniques to identify gait deficits in a mouse model of MS, known as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Paralysis and motor deficits in mice subjected to EAE are typically assessed using a clinical scoring scale. However, this scale yields only ordinal data that provides little information about the precise nature of the motor deficits. EAE disease severity has also been assessed by rotarod performance, which provides a measure of general motor coordination. By contrast, kinematic gait analysis of the hind limb in the sagittal plane generates highly precise information about how movement is impaired. To perform this procedure, reflective markers are placed on a hind limb to detect joint movement while a mouse is walking on a treadmill. Motion analysis software is used to measure movement of the markers during walking. Kinematic gait parameters are then derived from the resultant data. We show how these gait parameters can be used to quantify impaired movements of the hip, knee, and ankle joints in EAE. These techniques may be used to better understand disease mechanisms and identify potential treatments for MS and other neurodegenerative disorders that impair mobility.

Kinematic gait analysis in the sagittal plane yields highly precise information about how movement is executed. We describe the application of these techniques to identify gait deficits for mice subjected to autoimmune-mediated demyelination. These methods may also be used to characterize gait deficits for other mouse models featuring impaired locomotion.

Analyse cinématique démarche plan sagittal chez les souris C57BL/6 soumis à MOG35-55 induit une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by immunizing mice with neurogenic peptides to direct an inflammatory attack toward components of the peripheral nervous system (PNS). Recent advances have enabled the induction of EAN in the relatively resistant C57BL/6 mouse line using myelin protein zero (P0)106-125 or P0180-199 peptides delivered in adjuvant combined with the injection of pertussis toxin. The ability to induce EAN in the C57BL/6 strain allows for the use of the numerous genetic tools that exist on this mouse background, and thus allows the sophisticated study of disease pathogenesis and interrogation of the mechanistic action of novel therapeutics in combination with transgenic approaches. In this study, we demonstrate a simple approach to successfully induce EAN using the P0180-199 peptide in C57BL/6 mice. We also outline a protocol for the assessment of functional deficits that occur in this model, accompanied by an array of neuropathological features. Thus, this model is a powerful experimental model to study the pathogenesis of human peripheral demyelinating neuropathies, and to determine the efficacy of potential therapies that aim to promote myelin repair and protect against nerve damage in autoimmune neuritis.

This report outlines a simple approach to successfully induce experimental autoimmune neuritis (EAN) using the myelin protein zero (P0)180-199 peptide in combination with Freund&#39;s complete adjuvant and pertussis toxin. We present a sophisticated paradigm capable of accurately assessing the extent of functional deficits and neuropathology that occur in this EAN.

Une approche Simple pour induire une névrite auto-immune expérimentale chez la souris C57BL/6 pour les évaluations fonctionnelles et neuropathologiques

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Implant cochléaire et les enregistrements de réponse électriquement évoqué auditif du tronc cérébral chez les souris C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

Mesure quantitative des protéines synthétisées intrathéquement chez les souris

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Murine Corneal Nerve Abrasion for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal abrasion, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Next, position the mouse on its side on a heated plate. Gently use a cotton swab to absorb the artificial tear, and brush aside the mouse's eyelashes without making contact with the eye. Turn on the ocular burr, and carefully open the mouse's eyelid with two fingers.Simultaneously shield the vibrancy to prevent them from entangling in the burr. Locate the pupil or the eye center and gently apply the ocular burr to the eye's surface in circular motions until the epithelium is removed. Alternatively, perform about 20 circular movements on the cornea.Now apply a drop of fluorescent staining solution on the abraided eye. After 20 seconds, dab the eye with a tissue to absorb the solution. Then rinse it with a drop of artificial tear.Finally, absorb the artificial tear with a tissue, and illuminate the eye using a blue cobalt lamp. Prior to the surgery, the basal epithelium was intact and the nerve fibers in the sub basal plexus formed a vortex. The burr tip removed the outer corneal layer, leaving the stroma and endothelium intact with a visible gap at the basal epithelium and sub basal plexus.Regeneration of the epithelium occurred over a week post-surgery. However, the vortex remained absent from the corneal center.

Abrasion du nerf cornéen murin pour l’induction de la kératite neurotrophique

Paradigme du stress social chez les souris C57BL/6 pour la recherche comportementale

Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL&#47;6 Male and Female Mice

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female rodents is needed to understand its effects on ongoing brain development and behavioral outcomes. The chronic social defeat stress paradigm (CSDS) has been widely used to model social stress in adult C57BL/6 male mice by leveraging on the aggressive behavior displayed by an adult male rodent to an intruder invading its territory. An advantage of this paradigm is that it allows to categorize defeated mice into resilient and susceptible groups based on their individual differences in social behavior 24 h after the last defeat session. Implementing this model in adolescent C57BL/6 mice has been challenging because adult or adolescent mice do not typically attack early adolescent male or female mice and because adolescence is a short period of life, encompassing discreet temporal windows of vulnerability. This limitation was overcome by adapting an accelerated version of the CSDS to be used for adolescent male and female mice. This 4-day stress paradigm with 2 physical attack sessions per day uses a C57BL/6 male adult to prime the CD-1 mouse for aggressiveness such that it readily attacks the male or female adolescent mouse. This model was termed accelerated social defeat stress (AcSD) for adolescent mice. Adolescent exposure to AcSD induces social avoidance 24 h later in both males and females, but only in a subset of defeated mice. This vulnerability occurs despite the number of attacks being consistent across sessions between resilient and susceptible groups. The AcSD model is short enough to allow exposure during discrete periods within adolescence, allows the segregation of mice according to the presence or absence of social avoidance behavior, and is the first model available to study social defeat stress in adolescent C57BL/6 female mice.

Pleins feux sur l’auteur : Comprendre les effets de l’adversité sociale chez les adolescents sur le développement neurologique chez la souris

We developed an accelerated social defeat stress model for adolescent C57BL/6 mice, which works in both males and females and allows exposure during discrete adolescent periods. Exposure to this model induces social avoidance, but only in a subset of defeated male and female mice.

Modèle de stress de défaite sociale pour les souris mâles et femelles C57BL/6 adolescentes

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female ...