Ce protocole est important parce qu’il aide à comprendre la pharmacocinétique de l’éthanol dans le développement d’embryons de poisson zèbre, ce qui aidera à normaliser les régimes d’exposition à l’éthanol dans les études sur le poisson zèbre. Le principal avantage de notre technique est qu’elle permet aux chercheurs de mesurer rapidement et reproductiblement les niveaux d’éthanol pendant le développement embryonnaire, en particulier dans les embryons où l’approvisionnement en sang n’est pas disponible. Cette méthode peut être facilement appliquée à d’autres systèmes modèles ainsi qu’à d’autres facteurs environnementaux en supposant une technique et une configuration adéquates de l’équipement.
Je m’attends à ce que les personnes qui exécutent ce protocole pour la première fois luttent avec la vitesse nécessaire pour prévenir l’évaporation de l’éthanol pendant le traitement de l’embryon. Commencez par transférer 10 embryons avec du liquide embryonnaire supplémentaire dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre marqués d’une ligne à un volume de 250 microlitres. Ajouter de l’eau à la ligne de remplissage.
Préparer d’autres tubes de microcentrifugeuse pour les échantillons déchorionnés. Pour enlever la chorion, incuber les embryons dans une boîte de Pétri de 100 millimètres avec deux milligrammes par millilitre de cocktail de protéase dans les médias embryonnaires pendant 10 minutes. Faites tourbillonner doucement le plat toutes les quelques minutes pour briser la chorion.
Une fois que tous les embryons sont exempts de la chorion, retirez-les du cocktail de protéase et lavez-les deux fois avec des supports frais. Transférer ensuite les embryons dans un plat frais de 100 millimètres. Lorsque tous les échantillons sont prêts pour la mesure du volume, utilisez une micropipette P200 avec la plus petite pointe possible pour enlever soigneusement tout liquide autour des embryons.
Pesez l’eau avec une balance avec moins de 0,1 milligramme de précision, puis déterminez le volume des 10 embryons en soustrayant le poids de l’eau prélevée de 250 microlitres. Pour déterminer le volume d’un seul embryon, divisez la différence par 10. Recueillir les embryons dans les réservoirs d’accouplement et les placer dans une boîte de Pétri standard de 100 millimètres, puis incuber le plat à 28,5 degrés Celsius.
À six heures après la fécondation, transférer jusqu’à 100 embryons dans un nouveau plat avec des supports embryonnaires et 1 % d’éthanol ou de médias seuls. Couvrir, mais ne pas sceller les boîtes de Pétri et les placer dans un incubateur de 28,5 degrés Celsius pendant 18 heures ou jusqu’à ce qu’elles atteignent 24 heures après la fécondation. Utilisez deux micropipettes P200 réglées sur 50 microlitres et aspirez la solution de cocktail protéase en une seule et l’eau dans la seconde.
Placez ensuite rapidement 10 embryons dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette en verre et fermez le bouchon. Répétez ce processus pour que tous les échantillons soient testés, contrôlent et traités à l’éthanol des embryons. En travaillant avec un échantillon à la fois, ouvrez rapidement le bouchon et aspirez tous les supports embryonnaires résiduels avec une micropipette P200 réglée sur 200 microlitres.
Ajouter rapidement mais doucement et retirer les 50 microlitres d’eau, puis ajouter les 50 microlitres de cocktail protéase et fermer le bouchon de tube. Laissez reposer l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante, puis ajoutez rapidement 450 microlitres de cinq chlorure de sodium molaire et fermez le bouchon de tube. Homogénéiser l’échantillon en vortexant pendant 10 minutes et transférer deux microlitres de supernatant à un flacon de chromatographie gazeuse.
Sceller le flacon à l’aide d’un bouchon de polytétrafluoroéthylène. Après avoir terminé la méthode de démarrage, chargez 436 éthanol SPME actuels de deux à cinq minutes. meth du menu méthodes dans le logiciel d’analyse pour chaque échantillon sur la liste d’échantillons.
Remplissez la liste des échantillons en commençant par l’air, l’eau et cinq blancs de cocktail de chlorure de sodium molaire. Ensuite, entrez dans les normes d’éthanol dans l’ordre de 0,3125 à 40 millimolar. Suivez les normes avec la deuxième série de blancs.
Entrez tous les échantillons homogénéisés de supernatants embryonnaires à tester de la concentration et de la finition d’éthanol les plus faibles aux plus élevées prévues en entrant dans une troisième série de blancs. Ajouter les flacons de chromatographie gazeuse à l’autosampler dans l’ordre dans lequel les échantillons ont été entrés et leur permettre de se réchauffer pendant 10 à 15 minutes. Démarrez ensuite l’exemple à l’aide du logiciel.
Une fois toutes les exécutions terminées, activez la méthode d’arrêt en ajoutant un échantillon final dans la liste d’échantillons et en exécutant standby.meth. Revenez sur toutes les données acquises pendant l’analyse de l’échantillon. Une fois la méthode d’arrêt terminée, cliquez sur le chromatogramme ouvert et ouvrez le dossier avec les résultats.
Les échantillons sont automatiquement intégrés dans ce programme. Dans les résultats, assurez-vous que les pics corrects ont été intégrés. Une fois que tous les échantillons ont été confirmés, imprimez ou exportez les résultats.
Tracez la hauteur maximale des normes d’éthanol sur un graphique, puis calculez la pente, l’interception y et les valeurs au carré r. Obtenez la valeur de l’éthanol pour chaque échantillon en soustrayant la hauteur maximale de l’échantillon de l’interception y des normes et en divisant cette valeur par la pente des normes. Pour calculer la concentration d’éthanol dans les embryons, calculer le facteur de dilution pour chaque échantillon et multiplier la valeur de l’éthanol échantillon par ce facteur de dilution.
Enfin, calculer les échantillons de référence des médias en multipliant la valeur de l’éthanol média par un facteur de dilution de 10. Pour calculer correctement les concentrations embryonnaires d’éthanol, les volumes d’embryons dans leur chorion et retirés de leur chorion ont été mesurés. Dans cette analyse, l’embryon représentait 56 % du volume total à l’intérieur de la chorion.
D’après les travaux publiés précédemment, 73,6 % ont été utilisés comme teneur en eau embryonnaire pour toutes les analyses présentées. Il en est résulté de l’eau comprenant 0,82 microlitres des 1,1 microlitres de volume embryonnaire. Sur le volume total de l’eau, 49% est contenu dans l’embryon et 51% dans le liquide extraembryonique.
Pour l’analyse de la chromatographie gazeuse, deux groupes de 15 échantillons et les supports avec lesquels ils ont été traités ont été mesurés cinq fois par groupe ont été analysés. Les niveaux d’éthanol dans les médias étaient de 143,6 millimolaires pour le groupe 1 et de 133,6 millimolaires pour le groupe deux. Les concentrations d’éthanol des embryons étaient en moyenne de 63,5 millimlaires et de 53,1 millimolaires pour les groupes un et deux respectivement.
Un rapport entre la concentration embryonnaire d’éthanol et les niveaux de éthanol dans les médias pour chaque échantillon a été calculé. Le premier groupe avait 44 % des niveaux d’éthanol dans les médias, tandis que le groupe avait 40 % des niveaux d’éthanol dans les médias. Les embryons de contrôle non traités ont été mesurés à zéro concentration millimolaire d’éthanol dans les médias.
La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est que le traitement des embryons pour l’analyse GC correctement est critique que l’éthanol est volatile et s’évaporera rapidement. La meilleure façon d’effectuer cette étape est décrite, mais il doit être pratiqué pour développer une bonne mémoire musculaire. Cette procédure aidera à normaliser les régimes de traitement de l’éthanol chez le poisson zèbre et permettra aux travaux futurs de disséquer les mécanismes génétiques et cellulaires de la tératgénicité éthanale.
