Soutenu par National Institutes of Health subvention R01EY018144.

1. Production, repliement et purification par HPLC de Holo-RBP <ol><li> Transformer BL-21cells avec le vecteur pET3a hébergeant l&#39;ADNc humain pour RBP avec 6x His tag sur le N-terminal. Cultivez les transformées BL-21 cellules dans un shaker à 37 ° C dans 40 ml de milieu LB carbénicilline jusqu&#39;à ce que la DO à 600 nm atteigne 0,5. Induire l&#39;expression de la protéine RBP par addition d&#39;IPTG 1 mM d&#39;. Croître les bactéries à 37 ° C un autre 5 heures. </li><li> RBP produite dans E. coli est surtout présente dans les corps d&#39;inclusion insolubles. Pour enrichir corps d&#39;inclusion, les cellules à granules à 10.000 xg pendant 20 min. Puis sonication des cellules sur de la glace dans 5 ml de PBS avec des inhibiteurs de protéase, suivis de 2 cycles de gel et dégel. Pellet bas les corps d&#39;inclusion à 20.000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et le culot garder sur la glace. </li><li> Solubiliser le culot de corps d&#39;inclusion par sonication dans 10 ml de chlorhydrate 7,5 M de guanidine. Ajouter un demi-volume (5 ml) de tampon Tris 25 mM, pH 9,0 et DTT à une finale concentration de 10 mM. Mélanger vigoureusement solution sur un vortex nuit à température ambiante pour réduire complètement et dénaturer les protéines. </li><li> Centrifuger la solution de protéines pour éliminer les matières insolubles à 18.000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Après le spin, transférer le surnageant dans un nouveau tube et placer le tube sur la glace. </li><li> Préparer quatre volumes (60 ml) de tampon de repliement (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM cystine, la cystéine mM 3,0, EDTA 1 mM). Dégazer le tampon de repliement. Également préparer 600 pl 10 mM dans l&#39;éthanol rétinol sous une lumière rouge sombre. Gardez-le dans l&#39;obscurité sur la glace. Tant le tampon de repliement et la solution de rétinol doivent être fraîchement préparées. </li><li> Refroidir à la fois la solution de protéine et le tampon de repliement sur de la glace pendant au moins 30 min. Une température plus élevée réduit probablement la qualité des RBP replié. Ajouter 1 ml de tampon de repliement goutte à goutte et 10 ul de solution de rétinol à son tour, tandis que la solution de protéine est vigoureusement mélangé dans un bécher sur la glace. Répétez cette étape jusqu&#39;à ce que tous tampon de repliement et le rétinolsont ajoutés. Gardez en remuant la réaction sur la glace dans l&#39;obscurité pendant 5 heures. </li><li> Isoler la réaction de repliement à 24.000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Il est essentiel d&#39;éliminer les agrégats juste après la réaction de repliement. </li><li> Concentrer la solution surnageante en utilisant concentrateur Amicon Ultra 15 (MWCO 10 K) à environ 10 ml. Ne vous concentrez pas la solution replié de plus de ce niveau. Concentrer trop mènera à l&#39;agrégation des protéines et diminue le rendement et la qualité finale de la RBP correctement repliée. Diluer l&#39;échantillon concentré avec du PBS froid à 100 ml. Le but de cette étape est d&#39;éliminer les composants de la réaction de repliement qui interfèrent avec la purification du nickel. </li><li> Faites tourner la solution une fois de plus à 24.000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Il est important d&#39;enlever tout précipité. Transférer le surnageant à deux tubes de 50 ml contenant chacun 1 ml de Ni-NTA boue qui a été lavées avec du PBS. Faire tourner les tubes à 4 ° C pendant une heure. Incubation f solution diluéeou 1 h peut provoquer la précipitation de protéines mal repliées qui doivent être enlevés. </li><li> Centrifuger les tubes à 500 xg pendant 3 min. Retirer le surnageant avec précaution. Flottant quelque chose doit être retiré. Ajouter du PBS froid à 30 ml pour chaque tube. Faites tourner à nouveau et retirer le surnageant. Répétez ce processus jusqu&#39;à ce que vous ne voyez rien, mais perles dans le tube. </li><li> Transférer la résine Ni-NTA à une colonne vide. Laver la résine avec 20 volumes de colonne de 10 mM d&#39;imidazole, NaCl 500 mM dans du PBS. Son éluer-RBP en 5 volumes de colonne de 100 mM d&#39;imidazole dans du PBS. Ne pas stocker cette solution pendant une période de temps prolongée, et de congélation réduit le rendement et la qualité finale. Pour un meilleur résultat, purifier RBP par HPLC immédiatement. </li><li> Son Dialyser-RBP purifiée à partir de la résine Ni-NTA contre 25 mM de Tris, pH 8,4, et NaCl 120 mM. Un concentrateur peut également être utilisé pour l&#39;échange de tampon. Échantillons clairs pour HPLC par centrifugation à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C juste avant chaque course. </li><li> Purifier holo-RBP sur HPLC en utilisant un ioncolonne échangeuse d&#39;AX-300 par un gradient de NaCl étape (220 mM 12 min, 360 mM 15 min, et 1.000 mM 15 min) en utilisant 25 mM de Tris, pH 8,4 comme phase mobile à 1 ml / min. Avec l&#39;augmentation de la concentration de NaCl, holo-His-RBP est relâché alors que l&#39;apo-RBP RBP et mal repliées rester liée à la colonne (Figure 1). Si repliement RBP ne se fait pas de manière optimale, mal repliées RBP (par exemple mal repliées RBP-I dans la figure 1) peuvent prédominer toute la préparation. </li><li> Récupérer le correctement repliée holo-RBP des fractions du pic à 360 mM de NaCl. Surveiller attentivement le profil d&#39;élution correctement repliées et mal repliées Sa-RBP. À 1.000 mM de NaCl, la plupart des mal repliées Sa-RBP devrait être libéré. </li><li> Les fractions contenant holo-RBP sont rassemblées, concentrées et dialysées contre PBS pendant une nuit à 4 ° C. Vérifiez le rendement et la qualité finale (330 nm/280 nm) par spectrophotomètre. Produit correctement repliée devrait avoir un ratio de 330 nm/280 nm légèrement supérieur à 1 (figure 1). </li><li> Pour la productione apo-RBP, ajouter un volume égal d&#39;heptane purifié à l&#39;holo-RBP et mélanger doucement en tournant une nuit à 4 ° C. Centrifuger à 16000 g pendant 10 min à 4 ° C et transférer soigneusement la phase aqueuse inférieure à un nouveau tube (en évitant le précipité à l&#39;interface). Répétez le processus trois fois avec une incubation de 3 h pour chacun. Vérifiez absorption sur un spectrophotomètre Nanodrop pour s&#39;assurer que le pic de 330 nm a diminué au niveau de fond. </li></ol> 2. Surveillance en temps réel de STRA6-catalysée de parution rétinol et le rétinol Chargement en cours <ol><li> Bloquer un noir 96 puits Microfluor-2 plaque (Thermo Scientific) avec 200 pi de caséine Blocker (Pierce) pendant une nuit à 4 ° C afin d&#39;éviter le collage non spécifique des holo-RBP au plastique. Bloqueur de caséine donne le meilleur effet de blocage des toutes les solutions de blocage que nous avons testés. </li><li> Membranes fraîchement préparés à partir de cellules exprimant STRA6 ou des cellules de contrôle sont lavées avec du PBS et passé à travers une seringue Hamilton (Gastipo ds # 1710) 6 fois pour produire une suspension uniforme dans du PBS. On utilise généralement des membranes provenant de 1/100-1/20 de cellules cultivées sur un plat 100 mm par réaction. </li><li> Laver les puits revêtus de la plaque Microfluor-2 une fois avec 200 ul de PBS. Refroidir la plaque sur la glace avant l&#39;addition de la suspension de membrane (50 pi par puits). </li><li> Surveillance en temps réel de rétinol fluorescence est mesurée à l&#39;aide de l&#39;optique de fluorescence Omega PolarStar (BMG Labtech) avec le 320EX excitation et le filtre d&#39;émission 460-10. Le programme est réglé sur le mode de lecture Endpoint. Le mode Plaque peut également être utilisé pour mesurer une évolution dans le temps si les intervalles de temps ne sont pas modifiées. Le signal provenant de chaque point de temps est la moyenne de 10 mesures (calcul de la moyenne orbital d&#39;un diamètre de 2 mm) et le gain est fixé à 1.800. La plaque est agitée pendant 10 secondes à 500 tours par minute à l&#39;aide de double agitation orbitale avant chaque mesure. </li><li> Pour démarrer le test de libération de rétinol, les puits sont lues une fois en utilisant la lecture Endpoint mode avant holo-RBP (généralement une concentration de 1 uM final) est ajouté à 0 min. Dès que holo-RBP est ajouté, la réaction est contrôlée en permanence toutes les 5-10 minutes pendant 1-3 h. Pour démarrer le test de chargement rétinol tout-trans rétinol (typiquement de 1 uM de concentration finale) est ajouté aux puits sous une lumière rouge sombre. La plaque est lue une fois avant l&#39;apo-RBP est ajouté à 0 min. Dès que l&#39;apo-RBP est ajouté, la réaction est contrôlée en permanence toutes les 5-10 minutes pendant 1-3 h. </li><li> Après toutes les mesures sont effectuées, télécharger les données brutes (exemple de la figure 2) à partir du logiciel Omega analyse des données (BMG Labtech) vers Microsoft Excel pour l&#39;analyse des données. Chaque point dans le temps génère un fichier qui contient les lectures de toutes les conditions expérimentales. Par exemple, s&#39;il ya 20 points dans le temps, de consolider les 20 dossiers en un seul fichier Excel pour l&#39;analyse des données. </li><li> Pour l&#39;analyse des données, les signaux de fluorescence avant l&#39;addition de rétinol ou holo-RBP à 0 min sont considérées comme un bruit de fondd soustrait des signaux de fluorescence finale à tous les points dans le temps. Bien que les signaux de fond sont faibles par rapport au rétinol fluorescence en holo-RBP, soustraction du fond élimine l&#39;influence non spécifique de diffusion de la lumière par les membranes et permet de se concentrer sur la fluorescence de rétinol-RBP holo ou rétinol ajouté à 0 min. </li></ol> 3. Surveillance en temps réel de STRA6 catalysée par Transports de rétinol-RBP De Holo à CRBP-I <ol><li> Rétinol-EGFP est un transfert de nouvelle résonance de fluorescence (FRET) paire qui a récemment été mis en place 41. STRA6 catalysée par le transport du rétinol à partir holo-RBP pour EGFP-CRBP-I est suivie en temps réel en mesurant le rétinol-EGFP FRET. Protéine de fusion EGFP-CRBP-I avec 6XHis balise (EGFP-CRBP-I) est produit dans des cellules de mammifère et est purifié sur résine Ni-NTA avant l&#39;expérience. EGFP-CRBP-I peuvent être conservés dans du PBS avec des inhibiteurs de protéase pour une courte période de temps à 4 ° C. En variante, la protéine de fusion is congelé à -80 ° C dans de petites aliquotes. </li><li> Avant les réactions, préparer une bloqué Microfluor-2 plaque et membranes comme décrit ci-dessus. Laver les puits revêtus de la plaque Microfluor-2 une fois avec 200 ul de PBS avant l&#39;addition de la suspension de la membrane (50 pi par puits). </li><li> En temps réel rétinol-EGFP FRET est mesuré à l&#39;aide Polarstar Omega avec le filtre d&#39;excitation 320EX et les filtres d&#39;émission 460-10 et 510-10 en utilisant simultanément duel d&#39;émission optique de fluorescence. Le programme est réglé sur le mode de lecture Endpoint. Le mode Plaque peut également être utilisé pour mesurer une évolution dans le temps si les intervalles de temps ne sont pas modifiées. Le signal provenant de chaque point de temps est la moyenne de 10 mesures (calcul de la moyenne orbital d&#39;un diamètre de 2 mm) et le gain est fixé à 1.800 par canal. La plaque est agitée pendant 10 secondes à 500 tours par minute à l&#39;aide de double agitation orbitale avant chaque mesure. </li><li> Pour commencer, les réactions EGFP-CRBP-I (typiquement une concentration de 1 uM final) est ajouté aux puits. La plaque est lue surCE à l&#39;aide du mode de lecture Endpoint avant holo-RBP est ajouté à 0 min. Dès que holo-RBP est ajouté, la réaction est suivie en continu par mesure toutes les 5-10 minutes pour hr 1-2. </li><li> Après toutes les mesures sont effectuées, télécharger les données brutes (exemple de la figure 3) à partir du logiciel Omega analyse des données vers Microsoft Excel pour l&#39;analyse de données telles que décrites ci-dessus. </li><li> Rétinol-EGFP FRET est calculée par la variation dynamique dans le rapport des pics d&#39;émission accepteur / donneur 47. L&#39;équation 41 à calculer ce ratio est [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], où 510 tonnes, 510 b, 460 t et 460 b représentent les émissions à 510 nm après le début de la réaction ( t = temps point), à 510 nm avant le rétinol ou holo-RBP est ajouté (b = fond), à 460 nm après le début de la réaction (t = instant), et à 460 nm avant le rétinol ou holo-RBP est ajouté (b = fond), respectivement. </li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous partageons ici un protocole optimisé RBP RBP production en raison des procédures de production et de purification sont essentielles pour générer des RBP correctement repliée. Compte tenu de la possibilité que des espèces RBP mal repliées et la présence de quantités infimes de protéines bactériennes, même dans purifiée par HPLC bactéries produites RBP, il est utile d&#39;utiliser des pratiques commerciales restrictives natif à partir du sérum pour confirmer une conclusion liée à des pratiques comm...

La vitamine A est une molécule organique qui est essentiel à la survie et au bon fonctionnement de presque tous les organes de l&#39;homme. Dérivés de vitamine A (rétinoïdes) participer à divers événements biochimiques et cellulaires, y compris la détection de la lumière pour 1,2 vision et la régulation de l&#39;expression des gènes et la traduction des protéines au cours du développement embryonnaire et dans les tissus adultes 3-6. Bien que le rétinol est capable de diffuser par voie systémique, l&#39;évolution a proposé plasma protéine de liaison du rétinol, une protéine de support spécifique pour le transport de la vitamine A dans le sang d&#39;atteindre une efficacité et une spécificité élevées et pour éviter la toxicité associée à la diffusion aléatoire 7-10. Un récepteur de haute affinité qui se lie à RBP et prend de la vitamine A a été imaginé dans les années 1970, 11-13. Malgré les preuves accumulées depuis trois décennies sur l&#39;existence du récepteur RBP 14-31, l&#39;hypothèse du récepteur a été débattue pendant de nombreuses années en raison de l&#39;existence d&#39;une définition incorrecte des holo-RBP. La définition correcte des holo-RBP est que c&#39;est la grande affinité complexe 1:1 entre le rétinol et la RBP. L&#39;extraction répétée de holo-RBP par un solvant organique est nécessaire pour produire apo-RBP. Cette définition est utilisée par presque tous les laboratoires qui étudient RBP 7,9,32-35 ou le récepteur RBP 14-31,36-42. La définition incorrecte des holo-RBP qui a servi à réfuter l&#39;existence du récepteur RBP est le mélange aiguë de libre rétinol-RBP avec apo. Puisque la fonction du récepteur de la vitamine A dans les RBP absorption de holo-RBP est de libérer le rétinol-RBP de holo, le récepteur RBP ne jouerait aucun rôle dans l&#39;absorption du rétinol si rétinol est libre de commencer (comme proposé par la définition erronée du holo -RBP). La récente identification du récepteur RBP comme un domaine protéique appelé multitransmembrane STRA636 et sa fonction dans l&#39;absorption de la vitamine A à partir de holo-RBP 36-43 milite fortement contre l&#39;hypothèse que les pratiques commerciales restrictives nebesoin d&#39;un récepteur pour fournir des analyses de vitamine A. détaillée a révélé que STRA6 9 domaines transmembranaires avec l&#39;extrémité N-terminale extracellulaire situés et C-terminaux situés intracellulaire 40. Situé entre transmembranaire 6 et 7 est un domaine essentiel RBP contraignant 39. STRA6 est couplé à la fois LRAT et CRBP-je en vitamine A à partir de l&#39;absorption holo-RBP, mais ni LRAT ni CRBP-I est absolument nécessaire pour une meilleure STRA6 activité 41. STRA6 capacité à catalyser la libération de rétinol-RBP holo est la clé de son activité de vitamine A 41 l&#39;absorption. En s&#39;appuyant sur STRA6 pour libérer son rétinol, vitamine A par RBP peut transporter la vitamine A pour cibler les cellules dans les tissus périphériques avec une spécificité et une efficacité élevées. L&#39;importance cruciale de holo-RBP définition et la préparation est illustrée non seulement par le débat historique sur l&#39;existence du récepteur RBP, mais aussi par trois associés travaux récents sur holo-RBP définitions difrents de la définition originale et correcte 44-46. Le premier document utilisé la définition holo-RBP qui a été utilisé pour désapprouver l&#39;existence du récepteur RBP pour étudier le récepteur RBP 44. Les deuxième et troisième venu avec une troisième définition de holo-RBP qui rend encore moins probable que le rétinol à étudier pour former un complexe avec bon RBP 45,46. Ces études préparées en mélangeant 3 H-retinol/RBP holo-RBP (même pas apo-RBP) avec 3 H-rétinol. Depuis ce test n&#39;a pas 3 H-retinol/RBP formé et ne retirez pas excessive gratuitement 3 H-rétinol 45,46, ce n&#39;est pas un essai de 3 H-rétinol absorption de 3 H-retinol/RBP, mais est un logiciel gratuit 3 test de diffusion H-rétinol. Il a été montré précédemment que STRA6 ne favorise pas l&#39;absorption cellulaire du rétinol libre par LRAT 38 ou CRBP-I 41. La quasi-totalité rétinol est lié à des pratiques commerciales restrictives dans le sang et il n&#39;y a pas détectable fréquencee rétinol. Une fonction principale du récepteur RBP est de catalyser la libération de rétinol-RBP holo pendant la prise de rétinol-RBP holo 41. Si le rétinol est artificiellement liberté provisoire ou sous forme libre pour commencer 45,46, le récepteur RBP n&#39;est pas nécessaire. Les résultats radicalement différents obtenus à partir du dosage du rétinol libre diffusion par rapport aux tests basés sur correctement préparés holo-RBP illustrer le fait que la préparation correcte de la RBP est crucial pour ses tests fonctionnels. RBP peut être purifiée à partir de sérum humain 41, mais la procédure est complexe et le rendement est faible. Une autre approche consiste à produire des RBP dans E. coli. Parce E. coli n&#39;a pas la capacité de plier correctement mammifères protéines sécrétées avec plus d&#39;une paire de liaisons disulfures comme RBP, il est essentiel de replier RBP et purifier la protéine correctement repliée. Protéines mal repliées non seulement se comportent différemment des RBP plié corrigé dans divers dosages,mais aussi provoquer l&#39;agrégation des protéines au cours du stockage. Pour la même raison, l&#39;apo-RBP est seulement produit de haute qualité holo-RBP. Nous décrivons ici un protocole optimisé pour produire des RBP haute qualité 100% chargé avec le rétinol par l&#39;expression bactérienne, repliement et purification par HPLC. Purification par HPLC élimine non seulement les pratiques commerciales restrictives mal repliées, mais aussi importante contamination bactérienne qui peut causer des artefacts graves si RBP est utilisé dans des essais de transduction du signal. Nous avons également décrire deux techniques sensibles de surveillance en temps réel pour étudier le transport du rétinol par STRA6. Les deux techniques dépendent de la RBP de haute qualité. Faute d&#39;espace, les techniques classiques de la vitamine rétinoïde basée sur HPLC et basée sur des tests radioactifs A absorption ne sont pas décrites ici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> chlorhydrate de guanidine </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> cystine </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> cystéine </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pêcheur </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Pêcheur </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> TNT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> rétinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbénicilline </td><td> Pêcheur </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pêcheur </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazole </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptane </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> La caséine Blocker </td><td> Percer </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 concentrateur (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 plaque </td><td> Pêcheur </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton seringue étanche aux gaz # 1710 </td><td> Pêcheur </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

La vitamine A est essentielle pour la vision et l&#39;. Croissance / différenciation de presque tous les organes de l&#39;homme Plasma retinol binding protein (RBP) est le principe et le transporteur spécifique de vitamine A dans le sang. Nous décrivons ici une technique optimisée pour produire et purifier holo-RBP et deux techniques de surveillance en temps réel pour étudier le transport de la vitamine A par le récepteur de haute affinité RBP STRA6. La première technique permet de produire une grande quantité de haute qualité holo-RBP (100%-chargé avec rétinol) pour la vitamine A des dosages de transport. RBP haute qualité est essentielle pour les tests fonctionnels, car mal repliées RBP communiqués de vitamine A contamination bactérienne facilement et en préparation RBP peut causer des artefacts. Techniques de surveillance en temps réel, comme l&#39;électrophysiologie ont apporté des contributions essentielles aux études de transport membranaire. La RBP médiée par le récepteur de transport du rétinol n&#39;a pas été analysé en temps réel jusqu&#39;à récemment. La seconde technique décrite ici est la raisonl analyse en temps STRA6 catalysée par la libération de rétinol ou le chargement. La troisième technique est analyse en temps réel de STRA6 catalysée par le transport du rétinol à partir holo-RBP au cellulaire retinol binding protein I (CRBP-I). Ces techniques offrent une sensibilité et une résolution élevées en révélant récepteur de la vitamine RBP Un mécanisme de captation.

Nous présentons les résultats ici représentatives des holo-RBP production et la purification par HPLC (figure 1), analyse en temps réel de STRA6 catalysée par la libération de rétinol-RBP holo et le chargement en rétinol-RBP apo (figure 2) et analyse en temps réel des STRA6 catalysée par le transport du rétinol à partir holo-RBP pour EGFP-CRBP-I (Figure 3). Sans repliement, RBP produit dans des bactéries est pratiquement complè...

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Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Nous décrivons ici une technique optimisée pour produire de haute qualité complexe de la vitamine A / RBP et deux techniques de surveillance en temps réel pour étudier le transport de la vitamine A par STRA6, le récepteur de la RBP.

Les analyses en temps réel des Transports rétinol par le récepteur membranaire de plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

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Biology

13.6K vues.  University of California, Los Angeles. Nous décrivons ici une technique optimisée pour produire de haute qualité complexe de la vitamine A / RBP et deux techniques de surveillance en temps réel pour étudier le transport de la vitamine A par STRA6, le récepteur de la RBP.

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Mesure du taux plasmatique des protéines membranaires par endocytique Biotinylation réversible

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Recherche

Biologie

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Mesure quantitative de GLUT4 Translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Reconstitution biochimique des récepteurs stéroïdiens • complexes de protéines Hsp90 et la réactivation de la liaison du ligand

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Cartographie Diffusion moléculaire dans la membrane plasmique par multiple-cible de Recherches (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Surveillance en temps réel des interactions ligand-récepteur avec Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Cellules de mammifères autonome bioluminescentes pour la surveillance continue et en temps réel de la cytotoxicité

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasma Membrane déformations Avec pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Temps réel Mesures de Membrane Protein Receptor Interactions: Utilisation de résonance plasmonique de surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...