Ce protocole permet l’identification et l’isolement des cellules souches cancéreuses d’une manière robuste à l’aide d’analyses fonctionnelles et de caractérisation phénotypique. L’isolement de cellules souches cancéreuses d’un échantillon de tumeur pourrait être une plate-forme pour guider l’application clinique des thérapies spécifiques aux tumeurs individuelles, prédisant la résistance et la répétition conséquente. Pour préparer les cultures de suspension non adhérentes, enduire d’abord les contenants de culture cellulaire de 50 microlitres par centimètre carré de 15 milligrammes par millilitre de polyHME, et placer les contenants dans un four à séchage de 37 degrés Celsius pendant au moins deux jours.
Lorsque les contenants sont complètement secs, laver dans 80 à 90 pour cent confluent culture de lignée de cellules cancéreuses avec PBS, et détacher les cellules avec un à deux millilitres de trypsine EDTA. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, arrêter la réaction avec deux à quatre millilitres de milieu de culture cellulaire fraîche, et laver les cellules dissociées par centrifugation. Re-suspendre la pastille dans le milieu de culture fraîche pour le comptage, et diluer les cellules dans la sphère fraîche milieu de culture contenant deux pour cent de cellulose méthyle à une concentration de 500 à 2000 cellules par centimètre au carré par concentration de plat de culture.
Pour assurer la monoconalité de la sphère, ensemencer chaque lignée cellulaire à faible densité dans un environnement exempt d’ancrage. Puis ensemencer les cellules sur les plaques recouvertes de polyHEMA pour une incubation de cinq jours à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone, en ajoutant dix nanogrammes par millilitre de facteur de croissance épidermique et dix nanogrammes par millilitre de facteur de croissance fibroblaste de base au milieu de culture cellulaire tous les deux jours. Trois à douze jours après le placage, des colonies cellulaires tridimensionnelles en forme de boule devraient être observées par microscopie légère.
Pour obtenir des populations adhérentes dérivées, transférez les sphères dans un nouveau plat de culture dans les conditions de culture appropriées pour la lignée originale de cellules cancéreuses. Après un à deux jours de culture, un monocouche cellulaire doit être observé se développer autour des sphères adhérentes avec une morphologie similaire à celle de la lignée cellulaire d’origine. Déterminer la capacité de formation de la sphère de la lignée d’intérêt des cellules cancéreuses, après l’achèvement du protocole de formation de sphères, recueillir les sphères par centrifugation.
Resuspendez doucement la pastille de sphère dans le milieu frais, et utilisez un hemocytomètre pour compter le nombre de sphères avec un diamètre supérieur à 40 micromètres. Calculez ensuite le pourcentage de la sphère obtenue par rapport au nombre de cellules initialement plaquées. Pour déterminer la capacité d’auto-renouvellement de la ligne d’intérêt cellulaire, recueillir les sphères par centrifugation et resuspendre doucement la pastille de sphère dans trypsine EDTA pour une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, ajouter l’enzyme et le milieu d’activation au tube, et pipette la solution pour obtenir une suspension à cellule unique. À l’aide d’un hémocytomètre et de la méthode d’exclusion bleue trypan, comptez les cellules viables dans la suspension et plaquez les cellules dans des plaques recouvertes de polyHEMA pour un test de formation de sphère comme nous venons de le démontrer. Après huit jours, utiliser un hémocytomètre pour compter le nombre de sphères d’un diamètre de plus de 40 micromètres, et calculer le pourcentage de sphères obtenues par rapport au nombre de cellules initialement plaquées.
Pour évaluer la zone occupée par les sphères, placez le plat de culture sur la scène d’un microscope inversé équipé d’un module d’acquisition d’images et sélectionnez un grossissement 100X à 400X. Obtenez des images d’au moins dix champs aléatoires par condition et utilisez un logiciel d’analyse d’image approprié pour attirer des régions d’intérêt autour des sphères. Mesurez ensuite la zone de chaque région d’intérêt pour les pixels et calculez la zone de projection de sphère comme la zone moyenne des pixels mesurée.
La caractérisation fonctionnelle de la capacité de formation de la sphère, de l’auto-renouvellement et de la zone de projection des cellules souches cancéreuses permet de comparer leur lignée éloignée et leur tissu d’origine. Le protocole de formation de sphère permet d’obtenir des colonies sphériques en suspension à partir de plusieurs lignées cellulaires d’endomètres et de cellules cancéreuses du sein ou après une digestion enzymatique douce des tissus à partir d’échantillons de tumeurs humaines. Les sphères de cancer de l’endomètre et du sein donnent naissance à un monocouche cellulaire avec des morphologies similaires à leur lignée cellulaire d’origine un à deux jours après le placage.
Dans ces expériences représentatives, les cellules mcf-7 positives de cancer du sein de récepteur hormonal ont démontré une capacité de sphere-formation plus élevée, capacité d’auto-renouvellement, et zone de projection que les cellules triple-négatives de cancer du sein de HCC1806. Outre l’enrichissement des cellules souches cancéreuses par le protocole de formation de sphères, nous recommandons d’évaluer davantage leur stemness en utilisant des méthodes complémentaires telles que la cytométrie du flux. Dans cette analyse représentative des sphères obtenues à partir des lignées cellulaires endométriales, quatre populations de cellules exprimant des marqueurs de cellules souches cancéreuses ont été identifiées dans chaque lignée cellulaire par cytométrie de flux.
L’évaluation des sphères tumorales par d’autres techniques de biologie moléculaire peut confirmer la stemness, et la plasticité des cellules souches cancéreuses et a facilité le développement de thérapies ciblées. L’analyse occidentale de tache après récolte douce de sphère a également indiqué un phénotype de cellules souches cancéreuses pour les sphères générées in vitro. Ce protocole d’isolement contribue à notre compréhension de l’importance des cellules souches cancéreuses qui se traduit cliniquement par la compréhension des rechutes, des métastases et de la résistance au traitement.
