Cette étude fait partie du projet A-Base &quot;Développement de techniques à haut débit pour les échantillons de viande pour réduire l&#39;écart phenomic pour les caractères de qualité multivariées en sélection assistée par marqueurs&quot; Agriculture et Agroalimentaire Canada. L&#39;assistance qualifiée de l&#39;unité de boeuf et le personnel de transformation de la viande au Centre de recherches de Lacombe sont sincèrement appréciés. Les auteurs tiennent également à remercier l&#39;assistance technique dédiée de Christine Burbidge-Boyd, Fran Costello, Glynnis Croken et Rhona Thacker.

1. Collection de Steak <ol><li> Suivant le classement à 24 h - 48 h après l&#39;abattage, le muscle long dorsal (soit la fin thoracique et / ou des lombes) est retiré de carcasses de boeuf et prélevé pour analyse de qualité. </li><li> Le muscle est garni de graisse sous-cutanée et carrée. Le muscle est ensuite découpé en morceaux de 2,5 cm (1 po) à la suite des steaks sécurité et les protocoles de manipulation des aliments. Après le découpage des steaks individuels, les étiquettes appropriées (nombre d&#39;animaux, côté, l&#39;emplacement du muscle, ou le temps) sont placés sur le steak respective. </li><li> Steaks sont ensuite préparés pour le stockage. Si elles veulent rester frais, ils sont placés sur un plateau et emmenés au grill. Si les steaks frais ne peuvent être cuits immédiatement, ils doivent être recouverts de plastique jusqu&#39;à ce que la cuisson peut commencer, pour éviter la déshydratation. Si steaks doivent être vieillies dans une glacière ou congelé, le poids est enregistré à deux décimales avant d&#39;être placé dans un imperméable à l&#39;oxygène emballage sous vide bag et scellé à l&#39;aide d&#39;une machine d&#39;emballage sous vide. Steaks sont ensuite placés dans leurs emplacements de stockage à long terme respectifs. </li></ol> 2. Procédure de cuisson <ol><li> Si l&#39;échantillon a été congelé, retirer du congélateur et placer dans un refroidisseur 4 ° C pour fondre du jour au lendemain. </li><li> Le jour de la cuisson, préchauffer un gril à sole à 210 ° C pour la cuisson de l&#39;échantillon, et à préparer le système d&#39;enregistreur de température et de l&#39;ordinateur en insérant des thermocouples dans les points de vente du dispositif de balayage. Graisser légèrement le gril avec graisse végétale environ 10 min avant la cuisson commence. </li><li> Avant de commencer à cuisiner, Retirer les biftecks ​​de la glacière. Retirer l&#39;échantillon de son emballage et éponger l&#39;excès d&#39;humidité de la viande avec du papier absorbant. Noter le poids brut du steak à deux décimales. </li><li> Insérer un thermocouple dans le milieu de la viande le long de son axe longitudinal. Démarrez la numérisation à thermocouple pour enregistrer les données de cuisson. </li><li> Placez l&#39;steaks sur la grille, en maintenant le thermocouple parallèle à la surface de cuisson plane de la viande et de la grille. Si la sonde n&#39;est pas maintenue parallèle, il peut en résulter des relevés de température inappropriées. </li><li> Cuire les steaks à une température interne de 35,5 ° C, puis retournez l&#39;échantillon et continuer la cuisson à une température interne finale de 71 ° C. Une fois la température intérieure est de 71 ° C, retirer l&#39;échantillon de la grille et tirez le thermocouple sur le steak. </li><li> Si un poids de cuisson désiré, permettre le steak refroidir légèrement (1-2 min), puis efface l&#39;échantillon avec une serviette en papier pour enlever l&#39;excès d&#39;humidité et peser échantillon à deux décimales. </li><li> Si les données de cuisson sont nécessaires, enregistrer les données numérisées thermocouple. </li></ol> 3. réglage de l&#39;angle et de préparation des échantillons <ol><li> Bien que l&#39;échantillon est encore chaude du gril, faire une coupe 1 - 2 cm de l&#39;extrémité latérale du steak de créer un bout carré. </li><li> Une section de 5 cm à travers le wide du steak est préparé en utilisant un &quot;échantillon boîte calibrage» avec une encoche de couteau à 5 cm, parallèles à la coupe initiale. </li><li> L&#39;orientation de l&#39;angle des fibres musculaires ne peut être mesurée en plaçant un rapporteur d&#39;angle sur la surface de couteau de coupe de la viande. </li><li> La boîte de coupe à angle variable est ensuite réglé sur l&#39;angle correspondant de l&#39;échantillon en faisant coulisser la plaque métallique inférieure personnalisés avec les trous inférieurs de guidage de la lame à double couteau. Serrez les boutons pour fixer la plaque métallique inférieure à l&#39;angle correspondant. </li><li> Placer la section de 5 cm de la viande dans la zone de coupe de la zone de coupe à angle variable de telle sorte que la direction des fibres musculaires est parallèle à l&#39;angle de la double couteau à lame. </li><li> Le double couteau à lame est utilisée pour couper une tranche de 1 cm sur le coupé précédemment 5 cm pièce, afin d&#39;assurer que le couteau passe à travers la totalité de l&#39;échantillon à l&#39;angle correspondant. Lorsque vous placez le steak, veiller à ce qu&#39;il touche le bord de la zone de coupe plus proche de lal&#39;utilisateur, selon le mouvement de coupe va tirer le steak vers l&#39;utilisateur. </li><li> Pour couper, insérer le couteau à double lame dans la boîte de coupe et retirer le couteau pour couper la viande en une bande 1 cm. Pour éviter la déchirure de la viande, utiliser un léger mouvement de scie tout en tirant le couteau vers l&#39;utilisateur. Conserver les lames de couteau contre un bord de la plaque de guidage pour maintenir des proportions égales de coupe. </li><li> Le résultat devrait être une tranche épaisse chaude, 1 cm de 5 cm de long, avec les fibres courir constamment parallèle à la tranche. Cette tranche est ensuite utilisé pour une tranche de cisaillement analyse de la population de la texture de la viande. </li></ol> 4. Analyse de la force de cisaillement <ol><li> Afin de déterminer l&#39;analyse de la force de cisaillement, le protocole de la force de cisaillement de tranche (SSF) utilise les 1 cm par 5 cm couper en tranches obtenues avec le bloc de coupe à angle variable. L&#39;utilisation d&#39;un appareil analyseur de texture avec une lame de coupe de cisaillement plat, l&#39;analyse est effectuée sur la tranche chaud. </li><li> Préparer l&#39;analyseur de texture avec une cellule de charge de 50 kg et un ensemblela distance de cisaillement à 48 mm, avec une vitesse de tête transversale de 500 mm / min. </li><li> Le cisaillement est réalisée une fois, perpendiculaire aux fibres musculaires à fournir une analyse précise de la force maximale nécessaire pour cisailler les fibres dans la tranche. </li><li> Une fois que la tranche a été cisaillé complètement par le centre, enregistrer et enregistrer les données. </li></ol>

<ol>
	<li>Jayasooriya, S. D., Torley, P. J., D'Arcy, B. R., Bhandari, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+high+power+ultrasound+and+ageing+on+the+physical+properties+of+bovine+Semitendinosus+and+Longissimus+muscles.">Effect of high power ultrasound and ageing on the physical properties of bovine Semitendinosus and Longissimus muscles.</a> Meat Science. 75, 628-639 (2007).</li><li>Koohmaraie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+proteinases+and+meat+aging.">Muscle proteinases and meat aging.</a> Meat Science. 36, 93-104 (1994).</li><li>Lepetit, J., Culioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+meat.">Mechanical properties of meat.</a> Meat Science. 36, 203-237 (1994).</li><li>Honikel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+methods+supported+by+OECD+and+their+use+in+Mediterranean+meat+products.">Reference methods supported by OECD and their use in Mediterranean meat products.</a> Food Chemistry. 59, 573-582 (1997).</li><li>Monin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+methods+for+predicting+quality+of+whole+meat.">Recent methods for predicting quality of whole meat.</a> Meat Science. 49, S231-S243 (1998).</li><li>Shackelford, S., Wheeler, T., Koohmaraie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+slice+shear+force+as+an+objective+method+of+assessing+beef+longissimus+tenderness.">Evaluation of slice shear force as an objective method of assessing beef longissimus tenderness.</a> Journal of Animal Science. 77, 2693-2699 (1999).</li><li>Ju&#225;rez, M., Hui, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beef+Texture+and+Juiciness.">Beef Texture and Juiciness.</a> Handbook of meat and meat processing. , 177-206 (2012).</li><li>Kerth, C. R., Montgomery, J. L., Lansdell, J. L., Ramsey, C. B., Miller, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+gradient+in+longissimus+steaks.">Shear gradient in longissimus steaks.</a> Journal of Animal Science. 80, 2390-2395 (2002).</li><li>Janz, J. A. M., Aalhus, J. L., Dugan, M. E. R., Price, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mapping+method+for+the+description+of+Warner-Bratzler+shear+force+gradients+in+beef+Longissimus+thoracis+et+lumborum+and+Semitendinosus.">A mapping method for the description of Warner-Bratzler shear force gradients in beef Longissimus thoracis et lumborum and Semitendinosus.</a> Meat Science. 72, 79-90 (2006).</li><li>Derington, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+of+slice+shear+force+and+Warner-Bratzler+shear+force+of+beef+strip+loin+steaks+as+related+to+the+tenderness+gradient+of+the+strip+loin.">Relationships of slice shear force and Warner-Bratzler shear force of beef strip loin steaks as related to the tenderness gradient of the strip loin.</a> Meat Science. 88, 203-208 (2011).</li><li>Shackelford, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+Shear+Force.">Slice Shear Force.</a> Beef Facts. , (2009).</li><li>Henrickson, R. L., Mjoseth, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenderness+variation+in+two+bovine+muscles.">Tenderness variation in two bovine muscles.</a> Journal of Animal Science. 23, 325-331 (1964).</li><li>Ju&#225;rez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+relative+contribution+of+ante-+and+post-mortem+factors+to+the+variability+in+beef+texture.">Quantifying the relative contribution of ante- and post-mortem factors to the variability in beef texture.</a> Animal. FirstView, 1-10 (2012).</li><li>Shanks, B. C., Wulf, D. M., Maddock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+note:+The+effect+of+freezing+on+Warner-Bratzler+shear+force+values+of+beef+longissimus+steaks+across+several+postmortem+aging+periods.">Technical note: The effect of freezing on Warner-Bratzler shear force values of beef longissimus steaks across several postmortem aging periods.</a> Journal of Animal Science. 80, 2122-2125 (2002).</li><li>Lawrence, T. E., King, D. A., Obuz, E., Yancey, E. J., Dikeman, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electric+belt+grill,+forced-air+convection+oven,+and+electric+broiler+cookery+methods+for+beef+tenderness+research.">Evaluation of electric belt grill, forced-air convection oven, and electric broiler cookery methods for beef tenderness research.</a> Meat Science. 58, 239-246 (2001).</li><li>Aalhus, J., Ju&#225;rez, M., Aldai, N., Uttaro, B., Dugan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meat+preparation+and+eating+quality.">Meat preparation and eating quality.</a> , 1058-1063 (2009).</li><li>Sa&#241;udo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+slaughter+weight,+breed+type+and+ageing+time+on+beef+meat+quality+using+two+different+texture+devices.">The effects of slaughter weight, breed type and ageing time on beef meat quality using two different texture devices.</a> Meat Science. 66, 925-932 (2004).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

La boîte à angle réglable assure la lame SSF cisaille toujours fibres musculaires à un véritable angle perpendiculaire, plutôt que d&#39;à peu près perpendiculaire qui pourrait arriver avec une coupe à 45 ° d&#39;angle fixe 8. L&#39;application de la zone de coupe à angle variable permet de représentations plus exactes de la force de cisaillement maximale dans un échantillon, et c&#39;est sur cette base de l&#39;amélioration des techniques d&#39;analyse objective de la qualité que la zone de co...

La tendresse est l&#39;un des attributs de qualité les plus importants dans la viande 1. Incohérence dans tendreté de la viande a été identifié comme l&#39;un des principaux problèmes de l&#39;industrie du bœuf 2. L&#39;(FCWB) essai force de cisaillement Warner-Bratzler, caractérisé par un trou triangulaire dans une plaque de cisaillement usinées avec précision, est la méthode la plus répandue pour indiquer tendreté de la viande sensorielle 3,4, comme c&#39;est la méthode instrumentale qui a sans doute montré le meilleur corrélation avec les scores de panel sensoriel pour dureté de la viande 5. Toutefois, le protocole de la force de cisaillement de tranche (SSF) est devenue une technique importante pour l&#39;analyse de la texture du muscle et de tendresse 6, comme une alternative au protocole FCWB niveau 7. Il est bénéfique dans les cas où une analyse rapide ou un grand nombre d&#39;échantillons doivent être traités. Pour le SSF, un seul core est tiré de la viande quand il est encore chaud, par rapport aux noyaux multiples (3-6) tiré du bifteck généralement à l&#39;arrièreer 24 h de réfrigération pour la FCWB 6. A partir de cette seule tranche, le SSF analyse la texture moyenne de l&#39;ensemble du bifteck 8, comme il a été constaté que la tendresse varie entre les latéraux sur les côtés médial du steak 9, avec le centre et le milieu de steaks ayant la meilleure représentation pour la moyenne FCWB . La chute de la SSF est que, dans un steak, du latéral sur les côtés médial, il existe des variations dans les valeurs de force de cisaillement 9, mais en utilisant systématiquement la boîte de dimensionnement pour rendre sections de 5 cm, il peut réduire la variabilité qui pourrait venir de l&#39;utilisation de différentes sections de la viande. Cependant, depuis quelques steaks sont de tailles différentes, un cm la tranche 5 peut se produire à différents endroits sur le steak, qui pourrait alors affecter des valeurs de force de cisaillement 10. D&#39;autre part, la boîte de coupe d&#39;origine conçu pour obtenir la section à analyser dans le protocole SSF permet seulement 2 angles fixes, 45 ° et 90 °, mais musclechangements d&#39;orientation des fibres dans les steaks, et dans le muscle 11. Shackelford et Wheeler 12 ont déclaré que l&#39;angle moyen longissimus était de 43,8 °, qui était proche de 45 ° et est donc considérée appropriée lorsque les échantillons étaient toujours rassemblées au même endroit. Cependant, Derington et al. 11 a rapporté une plage dans l&#39;angle des fibres le long du muscle long dorsal entre 33,1 ° et 53,9 °. Ainsi, lorsque, à des fins de recherche, plusieurs steaks du même animal doivent être analysées, attribuant tous les angles fibres à 45 ° ou 90 ° réduit potentiellement la précision. L&#39;utilisation d&#39;une zone de coupe à angle variable peut fournir une représentation plus exacte de la force de cisaillement maximale, comme ayant la capacité à mesurer et à régler l&#39;angle de coupe permet la découpe de courir systématiquement parallèle avec les fibres musculaires.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Packager</td>
			<td>Koch Equipment, Kansas City, MO, USA</td>
			<td>Model UV2100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Winpak Ltd., Winnipeg, MB, Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouples and Scanning Device</td>
			<td>Agilent / Hewlett Packard, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>34970A Data Acquisition Switch Unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grill</td>
			<td>Garland Commercial Ranges Ltd., Mississauga, ON, Canada</td>
			<td>Model ED-30-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crisco Vegetable Shortening</td>
			<td>The J.M. Smucker Company, Orrville, OH, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample sizing box</td>
			<td>G-R Manufacturing Co., Manhattan, KS, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angle adjustable box</td>
			<td>Innovation Centre, Red Deer College, Red Deer, AB, Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texture Analyzer Machine</td>
			<td>Texture Technologies, Hamilton, MA, USA</td>
			<td>Model TA-XT Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Load Cell, 50 kg</td>
			<td>Texture Technologies, Hamilton, MA, USA</td>
			<td>TA-XT Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USDA Warner-Bratzler knife w/guillotine block</td>
			<td>Texture Technologies, Hamilton, MA, USA</td>
			<td>TA-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat rectangle Blade for Slice Shear Force</td>
			<td>Texture Technologies, Hamilton, MA, USA</td>
			<td>TA-7C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing an angle adjustable cutting box for analyzing slice shear force in meat

La recherche indique l&#39;angle des fibres du muscle long dorsal peut varier en fonction de l&#39;emplacement au sein d&#39;un steak et tout le muscle. Au lieu d&#39;utiliser les 45 ° fixe originales ou 90 ° angle de coupe pour tester la force de cisaillement, une zone de coupe à angle variable peut être ajustée de sorte que les angles des couteaux correspondent à l&#39;angle de fibre de chaque échantillon. À moins de 2 min après la cuisson à une température interne de 71 ° C sur un gril à foyer ouvert fixé à 210 ° C, de 1 cm par 5 cm coeur est coupé de la viande, parallèlement à la direction de la fibre musculaire, avec 2 lames de couteau set 1 cm d&#39;intervalle. Ce noyau chaud est ensuite soumis au protocole de travail de cisaillement Slice (SSF) pour évaluer la texture de la viande. L&#39;utilisation de la zone de coupe à angle variable et le protocole SSF donne une représentation précise de la force de cisaillement maximal, comme les fibres de tranche et les muscles sont constamment parallèle. Par conséquent, la zone de coupe à angle variable, en liaison avec le protocole SSF, peut être utilisé comme un haut-ièmetechnique de roughput d&#39;évaluer avec précision tendreté de la viande dans des endroits différents du muscle long dorsal et, éventuellement, dans d&#39;autres muscles.

Trente et un fini bouvillons commercial ont été abattus et leurs carcasses (528 à 601 kg) ont été partagés. Afin de créer la variabilité de la tendreté, côté droit ont été immédiatement stockés à 2 ° C, tandis que les côtés gauche ont eu lieu à 10 ° C pendant 3 heures, puis à 2 ° C. Les muscles longissimus des côtés droit et gauche ont été retirés 24 heures après l&#39;abattage. Les échantillons provenant des bons côtés (traitement «dur») ont été analysées dans la journée, ...

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Introducing an Angle Adjustable Cutting Box for Analyzing Slice Shear Force in Meat

force de cisaillement Slice est une méthode de référence pour l&#39;analyse de la texture de la viande bovine. En utilisant une boîte de coupe réglable angle pourrait augmenter sa précision à des fins de recherche. Les résultats de différents endroits dans le<em&gt; Longissimus</em&gt; Musculaire montrent une forte corrélation avec la méthode de la force de cisaillement Warner-Bratzler et grande adaptabilité potentiel pour les différents muscles.

L&#39;introduction d&#39;une boîte de coupe réglable Angle pour l&#39;analyse Slice Force de cisaillement dans la viande

Research indicates the fibre angle of the longissimus muscle can vary, depending upon location within a steak and throughout the muscle. Instead of using ...

introducing-an-angle-adjustable-cutting-box-for-analyzing-slice-shear

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K vues.  Agriculture and Agri-Food Canada. force de cisaillement Slice est une méthode de référence pour l'analyse de la texture de la viande bovine. En utilisant une boîte de coupe réglable angle pourrait augmenter sa précision à des fins de recherche. Les résultats de différents endroits dans le Longissimus Musculaire montrent une forte corrélation avec la méthode de la force de cisaillement Warner-Bratzler et grande adaptabilité potentiel pour les différents muscles.

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Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Culture organotypique des cerveaux de rat E18

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Recherche

Biologie

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

Cellules entières Recordings of Light évoqués courants synaptiques excitateurs dans la tranche la rétine

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

L&#39;identification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3&#39;UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Une méthode de sélection aptamères Structure commutation Appliqué à un colorimétrique Or nanoparticules Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Conception et développement d&#39;aptamères-or à base de nanoparticules colorimétriques Assays pour In-the-champ Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

L&#39;Assemblée et l&#39;application des «Shear Anneaux»: A Novel Endothelial Modèle pour Orbital, unidirectionnel et périodique Fluid débit et contrainte de cisaillement

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Détection et caractérisation de l'auto-assemblage des protéines in Vivo par la cytométrie des flux

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Automated Charting of the Visual Space of Housefly Compound Eyes

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands of visual units called ommatidia. Each ommatidium samples the optical information from a small solid angle, with an approximate Gaussian-distributed sensitivity (half-width on the order of 1&#730;) centered around a visual axis. Together, the ommatidia gather the visual information from a nearly panoramic field of view. The spatial distribution of the visual axes thus determines the eye's spatial resolution. Knowledge of the optical organization of a compound eye and its visual acuity is crucial for quantitative studies of neural processing of the visual information. Here we present an automated procedure for mapping a compound eye's visual axes, using an intrinsic, in vivo optical phenomenon, the pseudopupil, and the pupil mechanism of the photoreceptor cells. We outline the optomechanical setup for scanning insect eyes and use experimental results obtained from a housefly, Musca domestica, to illustrate the steps in the measurement procedure.

The protocol here describes the measurement of the spatial organization of the visual axes of housefly eyes, mapped by an automatic device, using the pseudopupil phenomenon and the pupil mechanism of the photoreceptor cells.

Cartographie automatisée de l’espace visuel des yeux composés de mouches domestiques

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands ...

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled environments enables an enriched comprehension of their biology that can contribute to applied research. This practice is usually employed in population control studies of species that cause economic loss, such as Atta ants. To cultivate their mutualistic fungus, these leaf-cutting ants collect leaves and for this are considered agricultural pests widely distributed throughout the American continent. They are highly socially organized and inhabit elaborated underground nests composed of a variety of chambers. Their maintenance in a controlled environment depends on a daily routine of several procedures and frequent care that are described here. It starts with the collection of queens during the reproductive season (i.e., nuptial flight), which are then individually transferred to plastic containers. Due to the high mortality rate of queens, a second collection can be carried out about 6 months after the nuptial flight, when incipient nests with developed fungus wad are excavated, hand-picked, and placed in plastic containers. In the laboratory, leaves are daily provided to established colonies, and ant-produced waste is weekly removed along with remaining dry plant material. As the fungus garden keeps growing, colonies are transferred to different types of containers according to the experimental purpose. Leaf-cutting ant colonies are placed in interconnected containers, representing the organizational system with functional chambers built by those insects in nature. This setup is ideal to monitor factors such as waste amount, fungus garden health, and the behavior of workers and queen. Facilitated data collection and more detailed observations are considered the greatest advantage of keeping ant colonies in controlled conditions.

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants Atta in Laboratory Conditions

Here, a protocol is described to successfully collect and maintain healthy Atta (Hymenoptera: Formicidae) ant colonies in laboratory conditions. Additionally, different nest types and configurations are detailed together with possible experimental procedures.

Collecte et entretien à long terme des fourmis coupeuses de feuilles (Atta) dans des conditions de laboratoire

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled ...