1. Infection des macrophages avec H. capsulatum, C. albicans <ol><li> 16 heures avant l&#39;infection, les macrophages de semences à la densité désirée dans des plaques à 24 puits. Dans ce protocole, une densité de 3,0 x 10 5 cellules / puits a été utilisé. </li><li> Ajouter cellules fongiques en phase exponentielle à une multiplicité désirée d&#39;infection (MOI). Ce protocole peut accueillir une gamme de MOI (0,2 à 5,0). Pour l&#39;infection de macrophages RAW264.7 avec H. capsulatum, nous avons utilisé une MOI de 0,2. </li><li> Après 1,5 h pour permettre la phagocytose, les macrophages se laver trois fois avec du PBS pour éliminer les champignons extracellulaires. </li><li> Incuber pendant nombre d&#39;heures désiré avant l&#39;analyse de l&#39;échantillon. Au bas MOI (0,2 dans notre expérience), les cellules macrophages infectés restent viables pendant plusieurs jours, et des échantillons peuvent être analysés environ tous les 12-24 heures. </li></ol> 2. lyse des macrophages <ol><li> Pour libérer les champignons de cellules macrophages, retirez médias, laver 3 fois avec du PBS, etajouter 0,5 ml d&#39;eau stérile. Dans ces conditions, les macrophages et les cellules lyseront fongiques resteront intactes. </li><li> Incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Transfert lysat pour tube stérile, garder sur la glace. </li><li> Transférer 20 ul lysat dans un tube séparé, puis ajouter 20 AO ul / solution PI. Passez directement à l&#39;étape 5: &quot;Préparation des échantillons pour l&#39;analyse par cytométrie image&quot; </li></ol> 3. UFC Placage <ol><li> Effectuer dix fois dilution des lysats (de l&#39;étape 2.3) dans les médias. </li><li> Plaque 100 ul de chaque dilution, en double exemplaire, sur des plaques HMM-agarose. Incuber dans une chambre humide à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 7-8 jours. </li><li> Compter manuellement colonies sur des plaques présentant un minimum de 100 et un maximum de 1.000 colonies distinctes. </li></ol> 4. Visualisation des champignons dans les macrophages vivants <ol><li> Pour collecter des macrophages vivants, laver les cellules 3 fois avec PBS. Ajouter 0,5 ml de PBS et incuber pendant 30 min à 4 ° C.</li><li> Pour supprimer les macrophages des puits de culture de tissu, une pipette doucement monter et descendre plusieurs fois. Transférer le liquide dans le tube stérile, garder sur la glace. </li><li> Transférer 20 ul d&#39;échantillon dans un tube séparé, puis ajouter 20 AO ul / solution PI. Passez directement à l&#39;étape 5: &quot;Préparation des échantillons pour l&#39;analyse par cytométrie image&quot;. </li></ol> 5. Préparation des échantillons pour l&#39;analyse par cytométrie image <ol><li> Pipeter l&#39;échantillon cible à fond, puis transférer 20 ul d&#39;échantillon dans la chambre de comptage cellulaire jetable. </li><li> Laisser les cellules sédimenter dans la chambre pendant 30 sec. </li><li> Insérez chambre de comptage dans le cytomètre en image. </li></ol> 6. Configuration de l&#39;instrument Cellometer <ol><li> Insérez les modules optiques de fluorescence: VB-535-402 et VB-660-502 dans le système et assurez-vous qu&#39;ils sont verrouillés en place. <ol><li> VB-535-402 (excitation à 475 nm, émission à 535 nm) est utilisé pour la détection et l&#39;orange d&#39;acridine GFP. </li><li> VB-660-502 (excitatisur à 540 nm, émission à 660 nm) est utilisé pour la détection de l&#39;iodure de propidium. </li></ol></li><li> Allumez le cytomètre de l&#39;image et ouvrez le logiciel qui l&#39;accompagne. </li></ol> 7. Configuration du logiciel Cellometer <ol><li> Sélectionnez le preset &quot;Type Assay» et «Type de cellules&quot; dans le Menu déroulant Assay. <ol><li> Pour viabilité, le dosage est optimisée pour l&#39;orange d&#39;acridine et de détection de l&#39;iodure de propidium. </li><li> Pour la détection des infections à Candida albicans, le dosage est optimisé pour la détection de la GFP. </li></ol></li><li> Sélectionnez «Options» sur le dessus et cliquez sur &quot;Background prendre l&#39;image&quot;, et permettre à l&#39;opération se termine. </li><li> Cliquez sur &quot;Aperçu sur fond clair image&quot;. </li></ol> 8. Acquisition d&#39;image procédure <ol><li> Insérer la chambre d&#39;échantillon préparé dans le cytomètre d&#39;image. </li><li> Utilisez le bouton de mise au point et la mise au point. </li><li> Une fois mis au point, cliquez sur &quot;Count&quot;, et permettre à l&#39;opération d&#39;acquisition d&#39;image à remplir. </li><li> Remove de la chambre de comptage jetable et l&#39;éliminer. </li></ol> 9. Analyse d&#39;images de données <ol><li> La concentration et la mesure de la viabilité <ol><li> Une fois que le comptage est terminé, la concentration et la viabilité des cellules cibles sont affichés dans la page de résultat. </li><li> Cliquez sur &quot;Exporter&quot; pour exporter les données dans FCS Express 4 pour l&#39;analyse de la population cellulaire de la GFP dans l&#39;expérience d&#39;infection à Candida albicans. </li></ol></li><li> FCS analyse express de cellules infectées de Candida albicans <ol><li> Importez le fichier &quot;. NXDAT&quot; dans FCS Express 4 et intrigue les résultats dans un histogramme de fluorescence. </li><li> Appliquer grille de la population de cellules de l&#39;histogramme pour déterminer les pourcentages de la population de cellules infectées par Candida albicans. </li></ol></li></ol>

<ol>
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L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry.">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis,+mitochondrial+potential,+and+immunophenotyping.">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li><li>Hull, C. M., Johnson, A. 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Les auteurs Leo Li-Ying Chan et Benjamin Paradis sont des employés de Nexcelom Bioscience LLC.

cytométrie en image permet à l&#39;utilisateur de capturer des images de haute qualité et, à l&#39;aide de logiciels spécialisés, effectuer une quantification rapide des cellules. Un défi potentiel à l&#39;adoption de cytométrie d&#39;image dans le domaine de la pathogenèse microbienne est que les microbes soient comptabilisées sont présents dans une population mixte de cellules, dont les cellules hôtes de mammifères. Ici, nous démontrons que cytométrie d&#39;image peut être utilisé pour la quantificat...

Études de champignons pathogènes, en association avec leurs hôtes et / ou des cellules hôtes ont souvent besoin de quantification des cellules fongiques viables sur un parcours de temps ou dans des conditions différentes de l&#39;infection. Dénombrement des unités formant colonie (UFC) est la méthode standard par lequel le nombre de cellules fongiques viables a été mesurée, cependant, cette technique présente plusieurs inconvénients et limitations. Premièrement, de nombreuses espèces de champignons ont une croissance lente. La croissance des colonies visibles sur des supports solides peut prendre 1-2 semaines, ce qui ralentit considérablement le rythme de la recherche. Deuxièmement, la manipulation des échantillons durant UFC placage est un processus laborieux, depuis plusieurs dilutions doivent être étalées pour assurer un nombre dénombrable de colonies. Troisièmement, le nombre d&#39;UFC est généralement plus faible que le nombre d&#39;organismes viables plaqué parce que l&#39;efficacité de placage est bien en dessous de 100%. Par exemple, l&#39;efficacité de placage pour le champignon Histoplasma capsulatum pathogène dimorphisme peut être aussi élevée que 90%, mais sont systématiquement aussi bas que30% et sont encore plus faibles (10%) pour le fongique liée dimorphe Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. l&#39;efficacité de placage pour Candida albicans est également soumis à la variabilité 3. Enfin, l&#39;analyse UFC représente uniquement les cellules vivantes et en divisant activement capables de créer de la croissance sur milieu solide, alors que dans de nombreuses situations, il serait utile de déterminer la présence et la concentration de cellules inactives morts et / ou métabolique. Auparavant, les méthodes de cytométrie en flux pour la quantification de plusieurs espèces de champignons pathogènes a été décrite 4-6. Toutefois, en raison de problèmes de confinement de biosécurité liés à l&#39;utilisation du niveau de biosécurité 2 (BSL2) ou pathogènes BSL3 niveau sur cytomètres partagés, l&#39;adoption de cette technique a été limitée. Comme la cytométrie en flux, la cytométrie l&#39;image est une méthode rapide et sensible de la quantification des cellules. Cependant, cytométrie d&#39;image peut être effectuée à une fraction du coût avec des résultats comparables 7 -11. Ici, nous décrivons des méthodes pour effectuer cytométrie en image de champignons pathogènes, en association avec les cellules hôtes. Nous démontrons nos méthodes utilisant deux champignons pathogènes humains: Histoplasma capsulatum et Candida albicans H.. capsulatum est un champignon pathogène dimorphisme qui provoque des maladies respiratoires, chez les humains, il pousse la levure comme herbe et se multiplie dans les macrophages alvéolaires Candida albicans est une espèce commensale de l&#39;homme qui cause parfois candidose.. Nous montrons que cytométrie d&#39;image permet une quantification rapide de ces levures, ainsi que la capacité de visualisation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AO/PI Solution</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CSK-0102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Counting Chamber</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision Software</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells

Les études sur les mécanismes de la pathogenèse cellulaire de levures pathogènes telles que Candida albicans, Histoplasma capsulatum et Cryptococcus neoformans communément emploient infection des hôtes mammifères ou des cellules hôtes (c.-à macrophages), suivie par la quantification de la levure en utilisant formant colonie analyse de l&#39;unité ou la cytométrie de flux. Bien unité formant colonie énumération a été la méthode la plus couramment utilisée dans le domaine, cette technique présente des inconvénients et limitations, y compris la croissance lente de certaines espèces fongiques sur des supports solides et des rendements faibles et / ou variable placage, ce qui est particulièrement préoccupant lorsque l&#39;on compare la croissance des souches de type sauvage et mutant. La cytométrie en flux peut fournir des informations quantitatives rapide en ce qui concerne la viabilité des levures, cependant, l&#39;adoption de détection par cytométrie en flux pour les levures pathogènes a été limité à un certain nombre de raisons pratiques, y compris son coût élevé et considérations de biosécurité. Ici, nous démontrons une image-méthodologie cytométrie utilisant la Vision Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) pour la quantification des levures pathogènes viables en co-culture avec des macrophages. Nos études portent sur ​​la détection de deux pathogènes fongiques humains: Histoplasma capsulatum et Candida albicans H.. capsulatum colonise les macrophages alvéolaires en reproduisant dans le phagosome des macrophages, et ici, nous évaluer quantitativement la croissance de H. levures capsulatum dans des macrophages RAW 264.7 en utilisant l&#39;acridine orange / iodure de propidium coloration en combinaison avec cytométrie d&#39;image. Notre méthode fidèlement récapitule les tendances de croissance tels que mesurés par colonie traditionnelle formant unité énumération, mais avec une sensibilité accrue de manière significative. En outre, nous évaluons directement infection des macrophages vivants avec une souche exprimant la GFP de C. albicans. Notre méthodologie offre un moyen rapide, précis et économique pour la détection et la quantification d&#39;agents pathogènes fongiques humains importants en association esprith cellules hôtes.

Nous avons utilisé le Cellometer Vision image de cytomètre pour surveiller la croissance de H. capsulatum dans les cellules macrophages. Cellules RAW 264.7 ont été infectés par H. cellules de levure capsulatum et à divers points dans le temps, des échantillons ont été soumis à AO / PI coloration suivie d&#39;une analyse par cytométrie basée sur l&#39;image. En parallèle, les échantillons ont été analysés par énumération UFC traditionnel. A chaque instant, les échantillons o...

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Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Ici, nous démontrons comment cytométrie d&#39;image peut être utilisé pour la quantification des champignons pathogènes, en association avec les cellules hôtes en culture. Cette technique peut être utilisée comme une alternative à la CFU énumération.

Utilisation de la cytométrie d&#39;image pour la quantification des champignons pathogènes en association avec les cellules hôtes

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.8K vues.  Merrimack College. Ici, nous démontrons comment cytométrie d'image peut être utilisé pour la quantification des champignons pathogènes, en association avec les cellules hôtes en culture. Cette technique peut être utilisée comme une alternative à la CFU énumération.