Nous remercions Asya Smirnov et Laura Gonyar pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été financé par des subventions du NIH R00 R01 TW008042 et AI097312 à AKCMBJ a été soutenu en partie par les NIH T32 AI007046.

Une. Évaluation de la viabilité bactérienne avec l&#39;iodure de propidium et SYTO9 <ol><li> Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries d&#39;intérêt. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques. </li><li> Rincer les cellules une fois doucement dans 0,1 M de 3 - (N-morpholino) propanesulfonique (MOPS), pH 7,2, contenant 1 mM de MgCl2 (MOPS / MgCl 2). </li><li> Incuber les cellules pendant 10 min à l&#39;obscurité à la température ambiante avec Alexa Fluor 647 anticorps ou la lectine qui se lie à couplage de l&#39;espèce bactérienne d&#39;intérêt, dans MOPS / MgCl 2, pour détecter les bactéries externes. </li></ol> REMARQUE: procéder à des contrôles par des bactéries vivantes et mortes, en l&#39;absence de cellules hôtes, pour montrer que la lectine ou anticorps d&#39;intérêt se lie toutes les bactéries indépendamment de la viabilité (Figure 1). <ol start="4"><li> Rincer les cellules deux fois avec MOPS / MgCl 2. </li><li> Aspirer mdias de cellules et ajouter 0,5 ml Vivant / Mort coloration Solution. Vivant / Mort Solution de coloration est de 5 uM SYTO9, 30 uM de l&#39;iodure de propidium, et 0,1% de saponine (concentrations finales) dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Incuber les cellules pendant 15 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl 2. </li><li> lamelles Inverser face vers le bas sur des lames de verre et sceller avec du vernis à ongles transparent. N&#39;utilisez pas de support de montage. </li><li> Acquérir des images à l&#39;intérieur de 30 min, en utilisant un microscope à fluorescence avec des jeux de filtres compatibles avec l&#39;acquisition des images verte, rouge, et rouge lointain. </li></ol> REMARQUE: Les deux microscopie de fluorescence conventionnelle et la microscopie confocale à balayage laser peut être utilisé. Après 30 minutes, les colorants fluorescents commencent à fuir par les bactéries et les données acquises ne sont plus exactes. Les images présentées dans cet article ont été acquis sur un montant microscope à fluorescence Nikon Eclipse E800 avec appareil photo numérique Hamamatsu Orca-ER en utilisant un logiciel Openlab. La fluorescence de l&#39;Alexa Fluor 647 a été détectée en utilisant un filtre ayant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 590-650 nm et un filtre d&#39;émission de 663 à 735 nm, et est de couleur bleu-faux. La fluorescence de l&#39;iodure de propidium a été détectée en utilisant un filtre ayant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 540-580 nm et un filtre d&#39;émission de 600 à 660 nm. La fluorescence a été détectée à partir de SYTO9 en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d&#39;onde de 465-495 nm et un filtre d&#39;émission de 515 à 555 nm. <ol start="10"><li> Ce protocole se traduira par des images où les bactéries non viables externes apparaissent bleu + rouge, bactéries internes non viables apparaissent en rouge seulement, bactéries viables externes apparaissent en bleu + vert, et les bactéries viables internes apparaissent en vert seulement. Compter oeil par le nombre de bactéries qui sont externes non viables, non viables interne, externe viable, et interne viable. </li><li> Calculer le pour cent de bactéries viables externe en divisant le nombre de bactéries viables externes par le nombre total de bactéries externes (viable, plus nonvimesure). Calculer le pour cent des bactéries viables internes en divisant le nombre de bactéries viables internes par le nombre total de bactéries internes (non viable, plus viable) (Figure 4). </li><li> Il existe deux contrôles essentiels à effectuer avec ce protocole. Tout d&#39;abord, valider que toutes les bactéries non viables sont l&#39;iodure de propidium positif et toutes les bactéries vivantes sont SYTO9 positif. Un milieu de culture logarithmique de bactéries (en l&#39;absence de toute cellule de l&#39;hôte) doit être&gt; 95% SYTO9-positif. Illustrée à la figure 2 est une culture à mi-logarithmique de N. gonorrhoeae (à 10 8 unités formatrices de colonies par ml former) incubées avec mort Colorant / Live. Deuxièmement, valider que les deux iodure de propidium et SYTO9 peuvent entrer perméabilisées, des cellules hôtes infectées. <ol><li> Pour générer une population de bactéries mortes, de recueillir 2 x 10 8 unités colonie bactérienne dans un tube de 1,5 ml former, ajouter 70% d&#39;isopropanol et de s&#39;asseoir pendant 10 min. Pellet les bactéries dans une micro-une laver les bactéries deux fois dans du PBS pour éliminer l&#39;isopropanol résiduel. Ensuite, suivez les étapes protocole 1.5 à 1.7. Ajouter 5 ul de suspension bactérienne à une lame de verre et recouvrir d&#39;une lamelle. échantillons de l&#39;image que dans le protocole étape 1.9. Dans ces conditions, 100% de la population devrait être l&#39;iodure de propidium-positive (figure 2). Chez certaines espèces bactériennes, l&#39;iodure de propidium peut pas complètement submerger SYTO9 coloration, et les bactéries non viables peut apparaître jaune ou orange. </li><li> Pour des cellules phagocytaires telles que les neutrophiles, exposer les cellules de bactéries tuées par l&#39;isopropanol et de veiller à ce que 100% des bactéries intracellulaires sont l&#39;iodure de propidium-positif (Figure 3). Pour les cellules non phagocytaires qui ne peuvent pas internaliser les bactéries mortes, il peut être suffisant pour traiter les cellules infectées avec l&#39;azoture de sodium ou d&#39;autres agents antimicrobiens cellules infiltrant avant d&#39;ajouter Vivant / Mort coloration Solution. </li></ol></li></ol> 2. Évaluation de la viabilité bactérienne avec SYTOX Green et DAPI <ol><li> bactéries Label d&#39;intérêt avec 10 pg / ml DAPI en milieu défini de Morse 25 pendant 20 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries marquées au DAPI. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques. </li><li> Rincer les cellules une fois avec MOPS / MgCl 2. </li><li> Incuber les cellules pendant 10 min à température ambiante dans l&#39;obscurité avec Alexa Fluor 647 anticorps ou la lectine qui se lie à couplage de l&#39;espèce bactérienne d&#39;intérêt, dans MOPS / MgCl 2, pour détecter les bactéries externes. Voir la note dans le protocole étape 1.3 pour les contrôles proposés. </li><li> Aspirer le milieu de cellules et ajouter 0,5 ml 0,4 uM SYTOX vert dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Laver les cellules une fois dans du MOPS / MgCl 2 à 5 min. </li><li&gt; Acquérir les images dans les 30 min avec un microscope à fluorescence. Voir protocole étape 1.9 pour la description de microscope, appareil photo numérique, et le logiciel d&#39;acquisition. </li></ol> REMARQUE: La fluorescence à partir de l&#39;Alexa Fluor 647 a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d&#39;onde de 590-650 nm et un filtre d&#39;émission de 663 à 735 nm, et est de couleur rouge-faux. La fluorescence de SYTOX vert a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d&#39;onde de 465-495 nm et un filtre d&#39;émission de 515 à 555 nm. La fluorescence de DAPI a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d&#39;onde de 355-375 nm et un filtre d&#39;arrêt de 400 nm. <ol start="10"><li> Ce protocole se traduira par des images où les bactéries non viables externes apparaissent rouge + vert, les bactéries non viables internes apparaissent en vert + bleu, bactéries viables externes apparaissent en rouge + bleu, et les bactéries viables internes apparaissent en bleu uniquement (Figure 4). Quantifier le pour cent des bactéries internes et externes, comme décrit dans le protocole step 1,11. </li><li> Les contrôles décrits dans le protocole étape 1.12 doivent être effectués avec le colorant combinaison DAPI / SYTOX vert (figures 2 et 3). </li></ol> 3. Évaluation de la viabilité bactérienne Outre la localisation subcellulaire <ol><li> bactéries Label d&#39;intérêt avec 10 pg / ml DAPI dans Défini le moyen de Morse pendant 20 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Infecter des cellules qui sont adhérentes à 12 mm de diamètre de cercle des lamelles de verre dans des plaques à 24 puits avec des bactéries marquées au DAPI. Ne pas fixer les cellules avec des aldéhydes ou des solvants organiques. </li><li> Rincer les cellules une fois avec MOPS / MgCl 2. </li><li> Incuber 10 min à température ambiante dans l&#39;obscurité avec Alexa Fluor 647 anticorps ou la lectine qui se lie à couplage de l&#39;espèce bactérienne d&#39;intérêt, dans MOPS / MgCl 2, pour détecter les bactéries externes. Voir la note dans le protocole étape 1.3 pour les contrôles proposés. </li><li> Aspirer le milieu de cellules et rincer les cellules deux times dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Incuber les cellules avec Alexa Fluor 555 anticorps contre le marqueur couplé subcellulaire d&#39;intérêt pendant 20 min, en MOPS / MgCl 2 contenant 0,2% de saponine. </li><li> Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Laver les cellules une fois dans du MOPS / MgCl 2 à 5 min. </li><li> Aspirer le milieu de cellules et ajouter 0,4 uM SYTOX vert dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Incuber les cellules 5 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Rincer les cellules deux fois dans MOPS / MgCl 2. </li><li> Laver les cellules une fois dans du MOPS / MgCl 2 à 5 min. </li><li> Acquérir les images de diapositives dans les 30 minutes sur un microscope à fluorescence. Voir protocole étape 1.9 pour la description de microscope, appareil photo numérique, et le logiciel d&#39;acquisition. </li></ol> REMARQUE: Fluorescence de Alexa Fluor 647 a été détecté en utilisant un filtre à onde d&#39;excitation de 590 à 650 nm et un filtre d&#39;émission de 663 à 735 nm, et est faux de couleur pourpre. Fluorescence from Alexa Fluor 555 a été détectée en utilisant un filtre ayant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 540-580 nm et un filtre d&#39;émission de 600 à 660 nm. La fluorescence de SYTOX vert a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d&#39;onde de 465-495 nm et un filtre d&#39;émission de 515 à 555 nm. La fluorescence de DAPI a été détectée en utilisant un filtre avec une excitation de longueur d&#39;onde de 355-375 nm et un filtre d&#39;arrêt de 400 nm. <ol start="14"><li> Ce protocole se traduira par des images où les bactéries non viables externes apparaissent violet + vert, les bactéries non viables internes apparaissent en vert + bleu, bactéries viables externes apparaissent violet + bleu, bactéries viables internes apparaissent en bleu seulement, et la protéine intracellulaire apparaît rouge (Figure 4). Quantifier la perecent de bactéries viables externes et internes tel que décrit dans le protocole étapes 1.11. </li><li> Les contrôles décrits dans le protocole étape 1.12 doivent être effectués avec le colorant combinaison DAPI / SYTOX vert (figures 2 et 3). </li><li> Dansplus de compter des bactéries viables et non viables, de classer chaque bactérie comme positif ou négatif pour la colocalisation avec le marqueur subcellulaire d&#39;intérêt. </li><li> Calculer le pour cent de bactéries viables colocalisés avec le marqueur subcellulaire en divisant le nombre de bactéries viables colocalisés par le nombre total de bactéries viables. Calculer le pour cent des bactéries non viables colocalisés avec le marqueur subcellulaire en divisant le nombre de bactéries non viables colocalisés par le nombre total de bactéries non viables. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Présentés ici sont deux protocoles qui utilisent liaison à l&#39;ADN et les colorants de viabilité en conjonction avec une lectine fluorescente pour identifier les bactéries vivantes et mortes et attachés à l&#39;intérieur des cellules humaines. Depuis deux protocoles pénalisent en direct de bactéries mortes, le choix de protocole à utiliser dépend du but de l&#39;expérience. Le premier protocole utilise l&#39;iodure de propidium pour détecter les bactéries non viables et SYTO9 pour détecter les bactéri...

Il existe une interaction dynamique et co-évolution entre les bactéries et les hôtes où ils résident. Les bactéries ont évolué organelles d&#39;adhérence, des systèmes de sécrétion, et / ou la capacité de produire des toxines qui permettent leur infection productive de phagocytose de l&#39;hôte et des cellules non phagocytaires. Les bactéries doivent également composer avec la reconnaissance et l&#39;activité antimicrobienne du système immunitaire de l&#39;hôte. Le système immunitaire de l&#39;hôte est constitué de composants innée et adaptative, y compris des barrières physiques et chimiques, les cellules du système immunitaire, le système du complément et d&#39;autres composants de l&#39;immunité humorale. Alors que de nombreuses bactéries sont sensibles à la destruction et à un dégagement de la réponse de l&#39;hôte immunisé à couches multiples, certaines bactéries pathogènes et opportunistes ont développé des mécanismes d&#39;infecter une variété de cellules hôtes et de dénaturer un dégagement de l&#39;hôte immunisé réponse 1. Neisseria gonorrhoeae est un exemple d&#39;un agent pathogène bactérien qui est très adapté à persister dans son hôte humain. N. gonorrhoeae colonise rapidement les surfaces luminales de cellules épithéliales de la muqueuse du tractus urogénital, du pharynx, de la conjonctive, et le rectum. Colonisation déclenche le recrutement abondant des neutrophiles au niveau des muqueuses. Les neutrophiles sont des phagocytes professionnels qui possèdent une variété de procédés antimicrobiens pour tuer les micro-organismes, mais N. gonorrhoeae est capable de survivre en présence de neutrophiles 5.2. Comprendre comment les bactéries pathogènes telles que N. gonorrhoeae subvertir, supprimer, et détourner la réponse immunitaire à survivre finalement dans des environnements d&#39;accueil normalement hostiles est cruciale pour le développement de nouvelles thérapies pour lutter contre les maladies infectieuses. Les protocoles expérimentaux souvent utilisés pour étudier la survie des bactéries dans les cellules hôtes comprennent des dosages de comptage de colonies, des essais de protection de la gentamicine, et la microscopie électronique. Dans les dosages de comptage de colonies, une population de cellules infectées est lysé (par exemple, avec un détergent à WHich les bactéries sont résistantes) pour libérer les bactéries. Les lysats sont dilués et étalés sur des milieux à base d&#39;agar-agar-, et des unités formant des colonies dans les lysats sont énumérées pour chaque point de temps et / ou d&#39;une condition expérimentale. Cette approche rend compte de la viabilité de l&#39;ensemble de la population bactérienne, mais n&#39;est pas capable de faire la différence entre la survie intracellulaire et extracellulaire. Une variante de l&#39;essai de comptage de colonies, l&#39;essai de protection de la gentamicine, la mesure spécifiquement la survie bactérienne intracellulaire, sur la base de l&#39;incapacité des antibiotiques gentamicine à traverser la membrane plasmique eucaryote 6. Toutefois, ce dosage est dépendant de la bactérie étant sensible à la destruction par la gentamicine (ou un autre antibiotique qui est similaire à la membrane eucaryote impermeant) et l&#39;incapacité de l&#39;antibiotique d&#39;avoir accès à des bactéries internes. Par conséquent, un test de protection de la gentamicine peut ne pas être efficace pour l&#39;examen de toutes les espèces bactériennes ou lors de l&#39;examen survie bactérienne dans trèspinocytaire cellules telles que les neutrophiles. Aucune de ces approches révèle la localisation subcellulaire ou tout autre comportement de bactéries individuelles (par exemple, si les bactéries forment des agrégats ou microcolonies qui se comportent différemment à partir de cellules bactériennes individuelles). Une autre approche fréquemment utilisé pour examiner la viabilité des bactéries externes et internes individuelles est la microscopie électronique à transmission à section mince (TEM). Cette approche est avantageuse en ce qu&#39;elle peut fournir des informations concernant l&#39;emplacement de la bactérie dans les cellules hôtes (par exemple phagosome, cytoplasme, autophagosome), qui peut être davantage étudiée par microscopie immuno-électronique avec des anticorps d&#39;or couplés à des marqueurs contre subcellulaires. Cependant, la microscopie électronique n&#39;est pas particulièrement sensible à l&#39;évaluation de la viabilité bactérienne. Lorsque les sections sont colorées incorporées à l&#39;acétate d&#39;uranyle, le citrate de plomb, ou d&#39;autres réactifs denses aux électrons et imagées par microscopie électronique, les bactéries denses aux électrons sont considérés comme viable et electron-lucent non viable 7,8. Toutefois, cette hypothèse surestime la viabilité bactérienne, puisque seuls les bactéries mortes avec des membranes gravement perturbés et dépourvu de cytoplasme semble électron-Lucent. De plus, certaines espèces bactériennes peuvent présenter une gamme de densités d&#39;électrons en fonction de leur stade de croissance, ce qui rend difficile la détermination de la viabilité. Comme alternative ou en plus de ces procédés couramment utilisés, nous fournissons ici les protocoles et les raisons de l&#39;utilisation de colorants fluorescents qui indiquent la viabilité bactérienne afin d&#39;évaluer la survie des bactéries fixées à et internalisées par des cellules hôtes. Pour identifier les bactéries extracellulaires, les cellules infectées sont d&#39;abord exposés à un réactif fluorescent, tel que la lectine ou un anticorps spécifique de bactéries. Les cellules infectées sont ensuite perméabilisées et exposés à des colorants spécifiques à l&#39;ADN qui sont accessibles aux bactéries de façon différentielle avec des membranes intactes vs dégradés, comme substitut de la viabilité bactérienne. Dans la première protocol, la membrane perméable SYTO9 de colorant identifie la population bactérienne totale, tandis que l&#39;iodure de propidium est uniquement accessible aux bactéries qui ont compromis les membranes et sont donc considérés comme non viable. L&#39;iodure de propidium et SYTO9 ont été utilisées pour évaluer la viabilité bactérienne dans les biofilms, discrimination pathogène à partir de bactéries non pathogènes, et énumérer les bactéries d&#39;origine hydrique viables 9-12. Dans le second protocole, 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phénylindole (DAPI) identifie les bactéries totales, tandis que SYTOX vert est uniquement accessible à la population non viable. Ces paires viabilité de colorants peuvent être combinés avec immunofluorescence pour déterminer l&#39;emplacement de chaque bactérie par rapport à une protéine d&#39;intérêt, par exemple pour définir la localisation sous-cellulaire bactérienne. L&#39;utilisation de ces tests donne un aperçu de la clé dans les interactions qui résultent en la destruction des bactéries ou de la survie au cours de l&#39;infection de cellules hôtes. Les protocoles décrits dans cet article ont été utilisés pour évaluer la viabilité deN. gonorrhoeae qui est fixée à l&#39;intérieur et les neutrophiles humains primaires, y compris dans les différentes populations de neutrophiles 5,13,14 phagosomes. Toutefois, ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer la viabilité de bactéries gram-positives et gram-négatives dans les phagocytes professionnels, des phagocytes non-professionnels, des protozoaires et des 15 à 24.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>07-09-64-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>RDCD0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS no Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80 12CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-32463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD63</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H5C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004377</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Les protocoles actuels pour répondre à ces questions comprennent des essais de comptage des colonies, des essais de protection gentamicine, et la microscopie électronique. le nombre de colonies et de protection de la gentamicine essais seulement évaluer la viabilité de l&#39;ensemble de la population bactérienne et sont incapables de déterminer la viabilité bactérienne individu. La microscopie électronique peut être utilisé pour déterminer la viabilité des bactéries individuelles et fournir des informations en ce qui concerne leur localisation dans les cellules hôtes. Cependant, les bactéries présentent souvent une gamme de densités d&#39;électrons, ce qui rend difficile l&#39;évaluation de la viabilité. Cet article décrit les protocoles pour l&#39;utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l&#39;intérieur et associés à des cellules hôtes. Ces tests ont été développés à l&#39;origine pour évaluer la survie de Neisseria gonorrhoeae dans les neutrophiles humains primaires, mais doit être unpplicable toute interaction cellulaire bactérie-hôte. Ces protocoles associent des colorants fluorescents membrane perméable (SYTO9 et 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), qui colore toutes les bactéries, avec des colorants de membrane imperméable fluorescent (iodure de propidium et SYTOX vert), qui ne sont accessibles à bactéries non viables. Avant la perméabilisation de la cellule eucaryote, d&#39;un anticorps ou d&#39;un réactif fluorescent est ajouté à identifier les bactéries extracellulaires. Ainsi, ces tests de discrimination de la viabilité des bactéries adhérentes et à l&#39;intérieur des cellules eucaryotes. Un protocole est également prévue en utilisant les colorants de viabilité en combinaison avec des anticorps fluorescents à des marqueurs de cellules eucaryotes, afin de déterminer la localisation subcellulaire des bactéries individuelles. Les colorants de viabilité bactériennes décrites dans cet article sont un complément et / ou solution de rechange adaptée à des techniques de microbiologie traditionnelle pour évaluer la viabilité des bactéries individuelles et fournir des informations sur l&#39;endroit où les bactéries survivent dans une cellule hôtes.

Les protocoles décrits ont été utilisés pour examiner la survie de N. gonorrhoeae après l&#39;exposition à l&#39;humain primaire neutrophiles 5,26. Les neutrophiles ont été infectées par N. gonorrhoeae et traitées avec le protocole 1, en ​​utilisant la viabilité SYTO9 colorant vert fluorescent et de l&#39;iodure de propidium-rouge fluorescent (figure 4A). Les colorants ont été ajoutés en présence de saponine, qui séquestre le cholestérol pour perméabili...

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Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Cet article décrit les protocoles pour l&#39;utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l&#39;intérieur et associés à des cellules hôtes.

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.5K vues.  University of Virginia Health Sciences Center.  Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Cet article décrit les protocoles pour l'utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l'intérieur et associés à des cellules hôtes. 

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Recherche

Immunologie et infection

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Infections traitables avec des cellules de mammifères Protozoaire amorcées bactéries

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Utilisation de la cytométrie d&#39;image pour la quantification des champignons pathogènes en association avec les cellules hôtes

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluorescence<em&gt; In situ</em&gt; Hybridations (FISH) pour la localisation des virus et des bactéries dans Endosymbiotic plantes et d&#39;insectes tissus

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Électroporation d&#39;effecteurs bactériens fonctionnels dans des cellules mammifères

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l&#39;évaluation de l&#39;interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantification des Efferocytosis en microscopie par Fluorescence des cellules individuelles

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Traitement d’image protocole pour l’analyse de la Diffusion et la taille de Cluster de récepteurs membranaires par microscopie de Fluorescence

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...