Cette méthode peut aider à répondre aux questions dans le domaine de l’immunométabolisme sur la contribution des cellules immunitaires à l’inflammation induite par l’obésité dans l’adipeux et la stéatohépatite dans le tissu hépatique. Ces techniques ont été optimisées pour l’isolement des cellules immunitaires adipeuses et hépatiques dans un modèle induit par l’alimentation de stéatohépatite non alcoolique réalisée grâce à un logement non spécifique de rongeurs exempts d’agents pathogènes. Ces méthodes peuvent aider à approfondir notre compréhension des mécanismes immunologiques impliqués dans le maintien de l’homéostasie métabolique.
En général, les personnes nouvelles à cette technique auront du mal à maximiser le rendement des cellules dissociées fonctionnellement viables et à mettre en place le bon gating dans la cytométrie de flux. Pour générer une suspension adipeuse à cellules simples, vaporisez la poitrine d’une souris euthanasiée à 70 % d’éthanol et faites soigneusement une incision centrale de cinq à six centimètres à travers l’intégument et la paroi abdominale sur toute la longueur de la cage thoracique pour exposer la cavité pleurale et le cœur. À l’aide d’une aiguille de calibre 26, injectez au moins 10 millilitres de solution saline de 0,9 % dans l’apex du ventricule gauche et utilisez des ciseaux pour ouvrir la cavité péritonéale.
Puis, disséquez le tissu adipeux épigonadal, et pesez-le. Dissocier mécaniquement le tissu adipeux en morceaux fins dans une boîte de Pétri à quatre degrés Celsius avant de transférer les fragments de tissu dans un tube conique de 50 millilitres. Rincer la boîte de Pétri avec un millilitre d’albumine sérique bovine à 0,5 %, ou BSA, dans PBS, et ajouter trois millilitres de solution de digestion des tissus adipeux fraîchement préparée par gramme de tissu adipeux au tube.
Après 20 minutes à 37 degrés Celsius et 200 rotations par minute, ajouter cinq millilitres de 0,5%BSA dans PBS, et placer le digeste adipeux sur la glace. Triturer la solution plusieurs fois avec une pipette sérologique de 10 millilitres, et utiliser un piston pour passer la solution à travers une passoire de 100 micromètres. Séparez les fractions tissulaires par centrifugation et utilisez une pipette pour jeter la fraction flottante des adipocytes.
Resuspendez la pastille vasculaire stromal de cellules de fraction dans un millilitre de sérum d’ammonium-chlorure-potassium, ou ACK, tampon de lyse, arrêtant la réaction de lyse avec 10 millilitres du sérum foetal de veau de 2%, ou FCS, dans PBS après quelques secondes. Ensuite, recueillir les globules blancs isolés par centrifugation, et resuspendre la pastille dans 250 microlitres de 2%FCS dans PBS pour le comptage. Récolter le foie dans un tube conique de PBS sur la glace avant d’utiliser des timbres de seringue pour dissocier mécaniquement le tissu dans une boîte de Pétri à quatre degrés Celsius.
Transférer les fragments de tissu hépatique disséqué dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de solution de digestion du foie chaud, et rincer la boîte de Petri avec trois millilitres de solution de digestion du foie frais. Après 20 minutes à 37 degrés Celsius et 200 rotations par minute, arrêter la digestion avec 20 millilitres de HBSS, et triturer le lisier tissulaire plusieurs fois avec une pipette sérologique de 10 millilitres. Utilisez un piston pour passer la solution tissulaire à travers une passoire de 100 micromètres, et de recueillir les cellules du foie par centrifugation.
Resuspendez la pastille en 20 millilitres de HBSS frais, et retirez la matrice d’hépatocyte par centrifugation. Recueillir le supernatant pour centrifugation, en réutilisant la pastille en 10 millilitres de 33% faible densité de densité gradient solution moyenne dans HBSS. Séparez les cellules immunitaires hépatiques par centrifugation de gradient de densité, et résuspendez la pastille de leucocyte dans un millilitre de tampon de lyse d’ACK.
Après quatre minutes à température ambiante, arrêter la lyse avec 10 millilitres de HBSS, et filtrer les cellules à travers une passoire pore de 30 micromètres dans un tube de 15 millilitres pour centrifugation. Ensuite, resuspendez la pastille en 250 microlitres de 2% FCS en PBS pour le comptage. Pour l’analyse cytométrique d’écoulement des populations isolées de leucocytes, ajoutez jusqu’à trois fois 10 aux six cellules dans 100 microlitres de 2%FCS dans PBS du tissu d’intérêt dans le tri individuel de cellules fluorescence-activées par fluorescence, ou FACS, tubes.
Ajouter 10 microlitres d’anticorps anti-CD16/CD32 à chaque tube pour bloquer toute liaison non spécifique pendant 10 minutes sur la glace, suivie d’une coloration avec le volume approprié de mélange d’anticorps et d’un microlitre de colorant de viabilité par échantillon pour permettre la discrimination des cellules vivantes et mortes. Après 20 minutes à quatre degrés Celsius protégés de la lumière, lavez les échantillons deux fois avec deux millilitres de 2%FCS plus PBS par lavage, et centrifugeuse à 300 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, resuspendez la pastille en PBS frais plus FCS.
Pour analyser les cellules par cytométrie d’écoulement, utilisez un échantillon de contrôle négatif non taché pour régler la dispersion avant et latérale, et ajuster les tensions du cytomètre d’écoulement pour détecter la population viable de leucocytes et exclure les débris. Ensuite, exécutez des échantillons de contrôle tachés simples pour une compensation multicolore avant d’exécuter les échantillons expérimentaux, en recueillant au moins cinq fois 10 aux quatre événements par tube. Ensuite, exportez les fichiers de données FCS pour analyse, et définissez la stratégie de gating pour les leucocytes CD45-positifs pour permettre l’identification des populations ultérieures de cellules immunitaires d’intérêt.
Ici, une stratégie de gating représentative pour des sous-populations de cellules T comprenant la discrimination de doublet et la coloration de viabilité dans la graisse périgonadale de murine est montrée. Les leucocytes CD45 positifs sont d’abord fermés pour le CD4 et le CD8, puis pour le ligand CD44 et CD62 pour discriminer entre les cellules T naïves, de mémoire centrale, de mémoire effectrice et d’effecteur. Les cellules CD44-positives sont alors davantage caractérisées avec CD127, récepteur de lectine-comme de cellules tueuses G1, et mort programmée-1.
Ici, la stratégie de gating pour analyser des cellules B, des granulocytes, des cellules tueuses normales, des macrophages, et des cellules dendritiques est montrée. Un pourcentage plus élevé de cellules CD4-positives et CD8-positives de mémoire d’effecteur peut être détectée chez les souris à régime à haute teneur en graisses logées dans des conditions non-SPF, tandis que les cellules T cd4-positives naïves intrahépatiques et CD8-positives se sont trouvées pour être considérablement inférieures dans ces animaux comparées aux souris de régime à haute teneur en graisses de FPS à la semaine sept. La stéatose grave, y compris une augmentation des grandes gouttelettes de lipide ayant pour résultat la stéatose macrovesicular, l’inflammation lobulaire, la montgolfière hépatocellulaire, et la structure lobulaire détruite se trouve dans les souris exposées à l’alimentation à haute teneur en graisses tandis que seulement quelques souris de FPS affichent une accumulation légère de graisse dans le foie.
En outre, le pourcentage de cellules tueuses naturelles est plus élevé dans le tissu adipeux périgonadal des souris exposées à l’alimentation riche en graisses, tandis que les souris FPS à régime riche en graisses ont démontré des pourcentages plus élevés de cellules dendritiques. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de garder les cellules sur la glace et dans l’obscurité, sauf indication contraire. Vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la façon de bien préparer les suspensions à cellules simples et comment isoler les tissus adipeux murins et hépatiques pour les expériences de cytométrie du flux.
