Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire Kucenas pour des discussions utiles et Quorum Technologies, Inc. pour un superbe support technique. Le travail a été financé par le Fonds UVa pour l&#39;excellence en science et technologie (FEST) (SK).

1. Préparation et montage des embryons de poisson zèbre pour l&#39;ablation et l&#39;imagerie en direct <ol><li> Préparer un stock de 0,8% agarose bas point de fusion dans l&#39;eau oeuf. Aliquote en 13X tubes de culture jetables de 100 mm et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Poisson zèbre adulte Cross contenant des transgènes intégrés de façon stable à étiqueter fluorescence neurones moteurs et types de cellules gliales d&#39;intérêt. Recueillir embryons de poisson zèbre en eau d&#39;œuf et placer dans un incubateur 28,5 ° C pour la bonne mise en scène plus tard 3. </li><li> A environ 24 fécondation post h (HPF), éliminer l&#39;eau de l&#39;oeuf et ajouter 0,002% 1-phényl 2-thiourée (PTU) dans l&#39;eau de l&#39;œuf. Retour embryons dans l&#39;incubateur. </li><li> Entre 24 et 96 HPF, les embryons doivent être examinés pour détecter la présence de transgènes souhaités sur un microscope à dissection fluorescent. Placez embryons sélectionnés dans l&#39;eau d&#39;œuf PTU frais et revenir à l&#39;incubateur. </li><li> Lorsque les larves ont atteint 6 jours après la fécondation (DPF) (ou l&#39;âge désiré), retirez-les de l&#39;incubateur, Sélectionnez quelques larves pour le montage, et de les transférer dans un plat plus petit. </li><li> Retirer l&#39;eau de la vaisselle et remplacez-les immédiatement avec environ 0,02% Tricane dans l&#39;eau d&#39;œuf PTU. Permettre aux larves de s&#39;asseoir dans anesthésique environ 5 min. </li><li> Placer une aliquote de 0,8% agarose bas point de fusion dans un bécher avec de l&#39;eau du robinet et micro-ondes pendant 30 secondes ou jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est fondu. Laisser le bécher refroidir jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose dans le tube de culture se sent tiède au toucher (pas trop chaude). </li><li> Sélectionnez une larve d&#39;anesthésie et de le transférer à un seul ou à plusieurs puits mm plat à fond de verre 35. Éliminer toute l&#39;eau qui a été transféré à la larve, puis couvrir immédiatement la larve avec suffisamment d&#39;agarose chaude pour remplir la partie à fond de verre du plat mais pas créer un grand dôme. </li><li> Comme durcit le agarose, utilisez une aiguille à dissection pour positionner la larve de son côté au fond du plat, puis inclinez la larve légèrement sur son dos. Il est impératif pour les blessures et l&#39;imagerie ultérieure, quila larve monté être en contact avec le verre sur le fond de la boîte. Utilisez l&#39;aiguille à dissection pour maintenir la larve dans cette position jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est solidifié et la larve est immobilisé. </li><li> Une fois que l&#39;agarose est complètement durci, une pipette lentement l&#39;eau Tricane assez (ce peut être le même Tricane utilisé pour l&#39;anesthésie) dans le plat pour couvrir complètement l&#39;agarose et les larves. </li></ol> 2. Calibration laser et d&#39;essais <ol><li> Mettez tous les instruments confocale de microscope, des diodes lasers appropriés pour transgènes de poisson zèbre passionnants, et l&#39;azote pompé par laser à colorant. Assurez-vous que le faisceau &quot;blanc&quot; splitter est en place, l&#39;atténuateur laser est complètement ouvert, et le nm cellule de colorant de coumarine 435 est en place. Sur l&#39;ordinateur, ouvrez le logiciel d&#39;imagerie. </li><li> Déplacer un 1.2NA objectif à immersion dans l&#39;eau 63x en place et appliquer une petite goutte de milieu d&#39;immersion pour objectifs d&#39;eau sur l&#39;objectif. Un objectif 63x permet une bonne précision de l&#39;ablation laser et l&#39;eau iMMERSION permet une plus grande distance de travail, ce qui est nécessaire lorsque l&#39;on travaille avec DPF poisson zèbre larves 6-7. </li><li> Obtenir une lame de verre avec un côté miroir à utiliser pour la calibration du laser. Placer la lame, côté miroir vers le bas, sur la scène du microscope. </li><li> Utilisation de l&#39;oculaire sous fond clair illumination, trouver et mettre l&#39;accent sur une égratignure ou gravure dans le miroir. Le fond clair sera brillait sur la lame de verre, mais seulement passer à travers l&#39;objectif dans des endroits où la glace a été rayés ou gravé loin, provoquant le miroir pour regarder noir à travers l&#39;oculaire, et les gravures pour ressembler à des taches ou des lignes de lumière. </li><li> Voir et concentrer les eaux-fortes sur l&#39;écran de l&#39;ordinateur en utilisant un logiciel d&#39;imagerie. Ouvrez la fenêtre qui contrôle la calibration du laser et les paramètres d&#39;alimentation. Définir le nombre d&#39;impulsions à &quot;1&quot; et la plaque d&#39;atténuation de la transmission &quot;3&quot;%. Le nombre d&#39;impulsions correspond au nombre de fois que le laser se déclenche à l&#39;intérieur de chaque région d&#39;intérêt (ROI) et le% de transmission représente la puissance du laser. Assurez-vous que le paramètre de calibrage correct est sélectionné pour le 1.2NA objectif à immersion dans l&#39;eau 63x. </li><li> Sélectionnez l&#39;outil Ellipse de la barre d&#39;outils principale, puis cliquez sur l&#39;image sur l&#39;écran de l&#39;ordinateur pour créer un seul ROI circulaire. Pour ce faire, 3 fois jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y 4 ROI circulaire espacés de manière aléatoire sur l&#39;image. </li><li> Certains systèmes peuvent comporter un dispositif de sécurité qui ne permettra pas le laser à feu si le trajet de la lumière pour les oculaires est ouvert. Si c&#39;est le cas, fermez manuellement le chemin de lumière pour les oculaires en ce moment. </li><li> Mettez le feu au laser. Cela va créer 4 petites gravures sur place, 1 dans chaque ROI circulaire. Si le laser ne se déclenche pas, vérifiez que le laser est allumé et connecté correctement et que le trajet de la lumière pour les oculaires est fermé. Si les tirs laser, mais pas de gravure est vu, vérifiez que le &quot;blanc&quot; diviseur de faisceau est en place. Si tout est en place, d&#39;augmenter la puissance du laser et «FRAP» jusqu&#39;à ce que l&#39;eau-forte are visible. Si une puissance laser de réglage supérieur à 10 est nécessaire pour graver le verre, ce qui peut indiquer la cartouche plasma laser doit être remplacé. </li><li> Si les taches apparaissent gravés centré dans la ROI sélectionnée, aucun étalonnage n&#39;est nécessaire (passer à 2.12). Si les taches ne sont pas centrés, le paramètre de calibrage doit être mis à jour. </li><li> Pour calibrer, cliquez sur la mise à jour la configuration de calibrage. Le laser se déclenche et une image apparaît contenant un seul point gravé. Si le point n&#39;apparaît pas, annuler le calibrage, augmenter la puissance du laser, et démarrer le calibrage à nouveau. </li><li> Cliquez dans le centre de la tache. Le laser se déclenche à nouveau, et un autre point apparaît. Cliquez sur ce point, et répéter ce processus jusqu&#39;à ce que l&#39;étalonnage est terminé et 9 points apparaissent dans un mode grille. Répétez les étapes 2.6 à 2.9 pour vérifier que l&#39;étalonnage a réussi. </li><li> Retirez la lame de verre de la platine du microscope et nettoyer l&#39;objectif. Ouvrez le trajet de la lumière à l&#39;UCOlars, et remplacer le diviseur de faisceau &quot;blanc&quot; avec le &quot;100% ILL&quot; séparateur de faisceaux. </li></ol> 3. section du nerf par ablation laser et Time-lapse imagerie confocale de comportements de cellules gliales <ol><li> Retirez le stade utilisé pour maintenir la lame de verre et de le remplacer par un stade approprié pour la tenue de 35 mm de verre plats fond. Continuer à utiliser le 1.2NA objectif à immersion dans l&#39;eau 63x. </li><li> Appliquez une petite goutte de milieu immersion dans l&#39;eau à l&#39;objectif, et placez le plat avec larve monté sur la scène. Stabiliser le plat avec clips. </li><li> Utilisation de l&#39;oculaire grand champ et illumination, la larve se concentrer et de localiser les nerfs moteurs. Analyser les nerfs hemisegments 10-20 et sélectionnez un nerf moteur pour transsection. </li><li> Mettre en place un live-view du nerf sur l&#39;écran de l&#39;ordinateur en utilisant un logiciel d&#39;imagerie. Sélectionner Z-avions et d&#39;acquérir une image des axones et les cellules gliales du nerf blessé. </li><li> Préparer les paramètres d&#39;imagerie time-lapse dans le logiciel d&#39;imagerie pour capturerZ-projections de tous les types de cellules dans des intervalles de 5-30 min, selon l&#39;expérience. Il est préférable de créer tous les réglages nécessaires pour le time-lapse avant de procéder à l&#39;ablation, donc il n&#39;y a pas de retard dans le démarrage du time-lapse une fois la blessure est terminée. </li><li> Retirez le &quot;100% ILL&quot; diviseur de faisceau et le remplacer par le &quot;vide&quot;. Fermer le parcours lumineux vers les oculaires. </li><li> Retour à la vue en direct du nerf. Utilisez le canal fluorescent approprié pour afficher les axones qui sera sectionné. </li><li> Utilisation de l&#39;outil ellipse, créez un mince ROI elliptique dans la région pour subir une ablation, puis créer ROI inférieur à l&#39;intérieur de la région sélectionnée. </li><li> Dans la fenêtre qui contrôle les paramètres du laser, régler le nombre d&#39;impulsions à &quot;2&quot; et la plaque d&#39;atténuation de la transmission &quot;18&quot; de l&#39;%. Mettez le feu au laser à l&#39;intérieur de la ROI sélectionnée. Si les restes de fluorescence dans le ROI, augmentent la puissance du laser, attendez environ 10 secondes, et tirer à nouveau le laser. Continuez jusqu&#39;à ce que vous atteignez une valeur qui provoque fluorescCE à disparaître dans le ROI. </li><li> Attendre 10 secondes ou plus et vérifier la zone ayant subi une ablation de nouveau pour la fluorescence. Méfiez-vous qu&#39;un retour sur investissement peut d&#39;abord sembler une ablation, quand il est réellement photobleached. Si les rendements de fluorescence, d&#39;augmenter la puissance du laser et tirer à nouveau le laser. Répétez cette opération jusqu&#39;à ce floraison disparaît dans le ROI et ne revient pas dans les 10 secondes. Il est préférable de commencer avec une puissance laser moindre et augmenter la puissance nécessaire. La puissance du laser nécessaire peut varier selon les différents systèmes de microscopie, à l&#39;âge de colorant de coumarine, spécimen de montage, l&#39;âge des larves, et l&#39;épaisseur du tissu. Une fois une puissance de laser idéal a été établi, ce niveau de puissance peut être utilisée à nouveau sur les nerfs ultérieures dans la même expérience. </li><li> Une fois que l&#39;ablation est terminée, commencer imagerie time-lapse. </li><li> Lorsque le time-lapse est terminée, utilisez un logiciel d&#39;imagerie pour compiler les données et créer une couleur composite Z-projections pour chaque point de temps. Créer un film QuickTime pour analyser le comportementsimultané de axones et les cellules gliales. </li></ol>

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les étapes les plus critiques de ce modèle expérimental sont: 1) les larves correctement le montage de blessure et après l&#39;imagerie in vivo et 2) l&#39;étalonnage du laser et de sélectionner les paramètres d&#39;alimentation correctes afin de créer une section du nerf propre qui entraîne des dommages extra-tissulaire minimale . Pour aider à assurer un axotomy succès pour l&#39;imagerie in vivo et l&#39;analyse ultérieure, monter larves multiple soit dans des plats à fond de verre indiv...

Le poisson zèbre ont été largement utilisées pour étudier le développement du système nerveux en raison de leur transparence optique et la facilité de la transgénèse, qui, lorsqu&#39;il est couplé, pour permettre l&#39;imagerie spectaculaire des comportements cellulaires dynamiques dans un embryon vivant. En outre, parce que le poisson-zèbre et les mammifères partagent presque tous les gènes nécessaires à la formation du système nerveux, l&#39;information cellulaire et moléculaire collectées dans cet organisme modèle est directement rattachables à d&#39;autres espèces de vertébrés. Même si incroyablement puissant pour les études du développement neural, le poisson zèbre et ses attributs uniques ont le potentiel pour élucider aussi les mécanismes qui maintiennent et reconstruire le système nerveux après une blessure. Les larves de poisson zèbre maintenir leur translucidité dans les stades larvaires fin et la pigmentation peut être effectivement bloqué soit avec l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs pharmacologiques de la production de mélanine ou des mutants génétiques qui manquent cellules pigmentaires. Ainsi, en utilisant cet organisme modèle pour étudier les blessures et Regeneration chez les animaux âgés est possible et offre l&#39;opportunité unique d&#39;étudier directement les mécanismes cellulaires et moléculaires qui reconstruire le système nerveux. Dans ce manuscrit, nous décrivons comment blesser de manière efficace et reproductible nerfs dans les PNS de larves de poisson zèbre. Ce paradigme de la blessure elle-même prête à étudier non seulement la dégénérescence, mais aussi les réponses de la glie périphérique et les cellules immunitaires ainsi que les interactions entre ces populations au cours de la régénération. Le PNS est un réseau complexe de nerfs moteurs et sensoriels qui est nécessaire pour transmettre des informations entre le système nerveux central (SNC) et la peau, les organes et les muscles du corps, permettant un organisme d&#39;interagir avec son environnement et survivre. Le long de ces nerfs, la glie périphérique, y compris les cellules myélinisation et non myélinisants Schwann et gliales perineurial, ainsi que les tissus conjonctifs, enferment les axones et en définitive constituer le nerf mature. Blessure de ces nerfs initie un processus kurnommée Wallerian dégénérescence 10. Ce mécanisme de fragmentation axonale, le recrutement immunitaire, déblaiement des décombres et la régénération est très stéréotypé et génétiquement réglementé 1. Des études antérieures chez les mammifères ont décrit les rôles des cellules de Schwann au cours de la dégénérescence nerveuse et la régénération 1, 2, 6, 8. Dans ces études de tissu fixe ou culture de cellules, les cellules de Schwann non seulement recrutés macrophages au site de la lésion afin d&#39;aider à déblaiement des décombres, mais aussi aidé à la myéline se phagocytose. Bien que ces études ont été incroyablement instructif, nous n&#39;avons jamais avant réponses gliales visualisés à une lésion axonale périphérique in vivo en temps réel, et pas d&#39;autres études ont examiné la relation entre les différentes classes de la glie périphérique lors de ces événements. Récemment, plusieurs laboratoires ont étudié la dégénérescence Wallerian utilisant le poisson zèbre et les blessures de l&#39;axone laser à médiation similaire à ce que nous décrivons ici <sup&gt; 4, 5, 7, 9. Dans certaines de ces études, les axones sensoriels superficiels ont été axotomisés chez les jeunes larves en utilisant un custom built, à deux photons microscope confocal 4, 5, 9. Dans une autre étude, qui est très semblable à la nôtre, les axones les plus profondes au sein du nerf moteur ventral ont été recoupées dans des larves âgées de 5 jours en utilisant un système d&#39;ablation laser disponibles dans le commerce 7. Dans ces deux expériences set-ups, l&#39;accent était mis sur la dégénérescence Wallerian et les axones et les cellules immunitaires ont été imagées. Pour développer ces études, nous décrivons blessant axones moteurs dans les larves plus âgées avec plus matures, les nerfs myélinisés et analyse la réponse de tous les glie nerf périphérique associée au cours de la dégénérescence et de régénération. Pour ce faire, nous transect nerfs moteurs à 6 et après la fécondation de 7 jours (DPF) de larves et de visualiser les réponses des populations gliales individuelles ainsi que d&#39;enquêter sur les interactions entre ces populations le long des axones blessés. Utilisation double et triple tralignes nsgenic que la glie périphérique de l&#39;étiquette, y compris les cellules de Schwann et gliales perineurial, ainsi que d&#39;un marqueur pour les axones, nous utilisons un système d&#39;ablation laser disponibles dans le commerce consistant en un atome d&#39;azote pompé par laser à colorant (longueur d&#39;onde 435 nm) attaché à un système confocal à disque rotatif pour créer transections axone. Cela permet expérimental de visualiser en direct, le poisson-zèbre larvaire, blesser voies axonales moteurs périphériques spécifiques et l&#39;image time-lapse les réponses des populations gliales distinctes d&#39;une blessure axonale et leur relation à l&#39;autre. Ce protocole peut être plus adapté pour créer des blessures nerveuses chez le poisson zèbre d&#39;âges différents, avec différentes lignées transgéniques ou des mutants génétiques pour aborder différentes questions scientifiques.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

Le système nerveux est souvent décrite comme une composante câblé du corps, même si elle est un système d&#39;organe considérablement fluide qui réagit à des stimuli externes, d&#39;une manière stéréotypée cohérente, tout en conservant une incroyable souplesse et la plasticité. Contrairement au système nerveux central (SNC), du système nerveux périphérique (SNP) est capable de réparations importantes, mais nous avons à peine commencé à comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ce phénomène. En utilisant le poisson zèbre comme un système modèle, nous avons l&#39;occasion sans précédent d&#39;études régénératrices conjoints avec l&#39;imagerie in vivo et les manipulations génétiques. Les nerfs périphériques sont constitués d&#39;axones entourés par des couches de cellules gliales et du tissu conjonctif. Les axones sont ensheathed par myélinisants ou non-myélinisation des cellules de Schwann, qui sont à leur tour enveloppé dans un fascicule d&#39;une gaine cellulaire appelée la perineurium. Suite à une blessure, les nerfs périphériques adultes ont la capacité remarquable à remove endommagé débris axonale et les objectifs re-innervent. Afin d&#39;étudier le rôle des cellules gliales tout périphérique dans PNS régénération, nous décrivons ici un essai de dissection transversale de l&#39;axone qui utilise un laser à colorant pompé l&#39;azote disponible dans le commerce à axotomize nerfs moteurs chez le poisson zèbre transgénique en direct. Nous décrivons plus loin les méthodes de coupler ces expériences à l&#39;imagerie time-lapse de nerfs blessés et de contrôle. Ce paradigme expérimental peut être utilisé non seulement pour évaluer le rôle que jouent les cellules gliales dans la régénération des nerfs, mais peut aussi être la plate-forme pour élucider les mécanismes moléculaires qui régissent la réparation du système nerveux.

L&#39;essai décrit ici peut être utilisé pour évaluer la réponse des cellules gliales et les autres populations de cellules nerveuses associées à des lésions axonales in vivo. Film 1 montre un exemple d&#39;une lésion du nerf créé en utilisant cette méthode et la réponse des cellules gliales voisines. Cette expérience a été réalisée dans Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) poisson zèbre, dans lequel les cellules gliales perineurial exprimer une membrane cible EGFP...

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Bien que le système nerveux périphérique (SNP) est capable de réparations importantes après une blessure, on en sait peu sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ce phénomène. L&#39;utilisation en direct, le poisson-zèbre transgénique et un essai de section du nerf reproductible, nous pouvons étudier les comportements des cellules gliales dynamiques au cours de la dégénérescence nerveuse et la régénération.

Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

motor-nerve-transection-time-lapse-imaging-glial-cell-behaviors-live

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JoVE Journal

Neuroscience

11.8K vues.  University of Virginia. Bien que le système nerveux périphérique (SNP) est capable de réparations importantes après une blessure, on en sait peu sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ce phénomène. L'utilisation en direct, le poisson-zèbre transgénique et un essai de section du nerf reproductible, nous pouvons étudier les comportements des cellules gliales dynamiques au cours de la dégénérescence nerveuse et la régénération.

Vidéo: Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Méthodes de manipulations expérimentales après section du nerf optique dans le SNC des mammifères

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

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Neurosciences

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon guidance, has not been fully elucidated. This is partly due to technical limitations of traditional axon guidance assays. To identify additional axon guidance cues influencing the oculomotor nerve, an ex vivo slice assay to image the oculomotor nerve in real-time as it grows towards the eye was developed. E10.5 IslMN-GFP embryos are used to generate ex vivo slices by embedding them in agarose, slicing on a vibratome, then growing them in a microscope stage-top incubator with time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. Control slices recapitulate the in vivo timing of outgrowth of axons from the nucleus to the orbit. Small molecule inhibitors or recombinant proteins can be added to the culture media to assess the role of different axon guidance pathways. This method has the advantages of maintaining more of the local microenvironment through which axons traverse, not axotomizing the growing axons, and assessing the axons at multiple points along their trajectory. It can also identify effects on specific subsets of axons. For example, inhibition of CXCR4 causes axons still within the midbrain to grow dorsally rather than ventrally, but axons that have already exited ventrally are not affected.

An ex vivo slice assay allows oculomotor nerve outgrowth to be imaged in real time. Slices are generated by embedding E10.5 IslMN:GFP embryos in agarose, slicing on a vibratome, and growing in a stage-top incubator. The role of axon guidance pathways is assessed by adding inhibitors to the culture media.

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth Ex Vivo

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analyse cinématique 3D pour l’évaluation fonctionnelle dans le modèle de rat de la blessure d’écrasement de nerf sciatique

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purification des fibroblastes et des cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...