Les auteurs remercient l&#39;Institut de Wake Forest de médecine régénérative pour leur aide dans le développement de ce protocole. Nous reconnaissons le soutien par des subventions de l&#39;organisme de bienfaisance Great Ormond Street Hospital, la Fondation Eugenio Litta (Genève, Suisse), le Conseil de recherches médicales, le Collège royal des chirurgiens de l&#39;Angleterre, Médical Charité des Sparks enfants, le Foreign Office du Royaume-Uni / USA cellules souches collaboration du Fonds de recherche Mittal Prix et. Nous tenons également à remercier la Fondation Royal Society / Wolfson pour le génie tissulaire subvention laboratoire de la rénovation obtenu pour la chirurgie pédiatrique Département de l&#39;Institut de la santé des enfants. PDC et SE sont pris en charge par la Fondation pour le Great Ormond Street Hospital Children.

Une. Isolement de Rat Intestin <ol><li> Préparer une solution à 1 L d&#39;une solution saline tamponnée au phosphate (Sigma, Royaume-Uni) avec 1% d&#39;antibiotique / antimycotique (Sigma, Royaume-Uni) (PBS / AA). Monter la pompe péristaltique (Masterflex L / S vitesse variable) avec deux tubes. Run 70% d&#39;éthanol (EtOH) à travers les tubes de la pompe péristaltique pendant 15 min à vitesse maximale, suivie par du PBS / AA pendant 15 autres minutes. </li><li> Euthanasier adultes Sprague-Dawley rats pesant environ 250-350 g par inhalation de CO 2 et la dislocation cervicale conformément aux directives locales d&#39;animaux et homologations (au Royaume-Uni, les lignes directrices du Home Office en vertu de la loi de 1986 animaux (Scientific Procedures)). </li><li> Autoclave les instruments chirurgicaux avant utilisation. Vaporisez et essuyez l&#39;abdomen de l&#39;animal en utilisant EtOH à 70%. </li><li> Effectuer une incision laparotomie Xifo-pubienne sur l&#39;abdomen pour assurer un champ opératoire clair. </li><li> Éviscérer l&#39;intestin grêle sur le côté droit de l&#39;animal sur une serviette en papier pulvérisé avec EtOH à 70%. Take soins de façon continue à mouiller l&#39;intestin avec du PBS / AA de manière à éviter la déshydratation du tissu et la dénaturation de la matrice extracellulaire (ECM). </li><li> Localiser l&#39;artère mésentérique supérieure (AMS) provenant d&#39;un angle de 90 ° par rapport à l&#39;aorte vers l&#39;intestin. Utiliser une canule G 27 pour entrer dans le SMA à partir de l&#39;aorte et rapidement retirer l&#39;aiguille pour éviter de déchirer la paroi de la cuve. Avancer le tube en plastique de la canule dans la SMA et fixer à l&#39;aide de sutures Vicryl (5/0). </li><li> Confirmez canule par injection de 1 ml de PBS / AA. Utiliser des ciseaux à ressort pour inciser la aorte proximale et distale par rapport à la SMA de manière à libérer la canule. </li><li> Pour éviter les fuites de matières fécales en disséquant le gros intestin, de placer une (Silk 5/0) suture noeud sur l&#39;extrémité proximale de la jonction iléo-caecale et une à l&#39;extrémité distale du côlon sigmoïde. Ensuite, couper l&#39;iléon terminal et du côlon entre les deux noeuds et enlever le gros intestin. </li><li> Couper l&#39;intestin à la jéjuno-duodénal jonction unee libérer l&#39;intestin de toutes les connexions du tissu conjonctif qu&#39;elle pourrait avoir avec l&#39;abdomen. </li><li> Transfert de l&#39;intestin grêle dans une boîte de Pétri avec du PBS / AA. Cathétériser la partie proximale de l&#39;intestin avec une pipette Pasteur en plastique (LSL laboratoire Consommables) et le fixer en place avec des sutures. Couper la pipette afin qu&#39;il s&#39;adapte le Luer-Lok d&#39;une seringue de 60 ml (BD Plastipak). Rincer la lumière intestinale 2x avec 60 ml de PBS / AA pour éliminer les matières fécales et les débris. </li></ol> 2. Decellularization Méthodologie <ol><li> Connectez la canule vasculaire à un robinet à trois voies. Cela facilitera la manipulation, minimiser la tension sur l&#39;arbre vasculaire et permettre l&#39;élimination des bulles de la tubulure. </li><li> Commencez à courir de l&#39;eau déminéralisée (résistivité 18,2 MQ / cm) à travers la pompe à rouleaux à vitesse variable Masterflex L / S à 0,6 ml / h. Assurez-vous qu&#39;aucun des bulles sont présentes dans les tubes avant de connecter avec la lumière de l&#39;intestin robinet. Des bulles peuvent être présents dans la lumière de l&#39;étape1,9, ce qui peut compromettre le processus de décellularisation. Varier la vitesse de la pompe et à manipuler le tissu avec une pince avec soin pour assurer la sortie des bulles à partir de l&#39;extrémité distale. Ne branchez pas la canule vasculaire jusqu&#39;à ce que ce processus est terminé depuis vitesses élevées peuvent endommager l&#39;arbre vasculaire. </li><li> Appareil pour transférer de la chambre froide, étant donné que l&#39;étape suivante de décellularisation est effectuée à 4 ° C. La basse température permet l&#39;élimination des cellules tout en minimisant la décomposition des tissus. Placez la boîte de Petri dans un récipient qui permettra de recueillir la solution de débordement. Perfuser les deux la lumière intestinale et l&#39;arbre vasculaire avec de l&#39;eau déminéralisée (résistivité de 18,2 MQ / cm) pendant 24 heures à 0,6 ml / h. Pendant la première heure de vérifier l&#39;appareil régulièrement pour s&#39;assurer que toutes les connexions sont sécurisées, la fuite est minime et sans bulles sont présentes dans l&#39;intestin. </li><li> Après 24 h de traitement avec de l&#39;eau désionisée, Appareil de décellularisation déplacer en dehors de la chambre froide que le reste de la procédure sonteffectuée dans la température ambiante (RT). </li><li> Peser le désoxycholate de sodium (Sigma, Royaume-Uni) pour préparer 300 ml d&#39;une solution à 4% dans de l&#39;eau désionisée. Peser le désoxycholate de sodium sous une hotte d&#39;aspiration, comme il s&#39;agit d&#39;un irritant oculaire et orale. Mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex jusqu&#39;à ce que la solution est claire. La solution peut être conservée à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 1 mois. </li><li> Changer la solution déminéralisée au désoxycholate de sodium, vérifier les connexions, enlever les bulles et perfuser à 0,6 ml / h pendant 4 heures. </li><li> Suite à l&#39;désoxycholate de sodium de l&#39;étape de lavage avec du PBS / AA pendant 30 min afin d&#39;éviter une interaction entre le désoxycholate de sodium et de DNase-I. </li><li> Peser la désoxyribonucléase I (DNase-I, Sigma) et de préparer 250 ml d&#39;une solution 2,000 M 1 kU en chlorure de sodium, pH 7,4. Mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex jusqu&#39;à ce que la solution est claire. Cette solution doit être préparée immédiatement avant l&#39;utilisation et ne peut pas être stockée. </li><li> Perfuser avec de la DNase I pendant 3 heures à la température ambiante à une vitesse de 0,6 ml / h. </li><li> Après l&#39;étape de DNase I, transférer leéchafaudage dans une hotte de culture de tissu et de changer les plaques et les instruments. Il est suggéré d&#39;utiliser une technique aseptique. </li><li> Laver avec du PBS / AA pendant 30 minutes pour s&#39;assurer que tous les restes des solutions de décellularisation sont supprimés. Placez l&#39;échafaud dans une nouvelle boîte de Pétri et transférer à un agent de réticulation UV (Spectroline, États-Unis). Exécutez deux cycles de stérilisation. Conserver dans 5% de PBS / AA et changer la solution tous les 3 jours. </li></ol>

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	<li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty.">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li><li>Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. 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E., Price, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers.">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).</li><li>Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Lungs+for+in+Vivo+Implantation.">Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li><li>Ott, H. C., Clippinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model.">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li><li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Y&#252;cesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration.">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les étapes les plus difficiles dans la mise en place de cette expérience impliquent la perforation de la SMA et la mise en place et le maintien de la stérilité. Canulation du SMA chez les rongeurs, sans rupture de la paroi peut être très difficile en raison de la taille et la position du navire. En variante, une suture peut être placée autour de l&#39;aorte proximale avant l&#39;origine SMA, suivie par une canulation de l&#39;aorte elle-même de manière distale, de diriger la canule en matière plastique dans le SMA. Pendant decellularization une combinaison de placement de la canule pauvres et des débits élevés peut entraîner la perte de l&#39;accès vasculaire. La stérilité est un problème majeur en raison de la quantité de la flore bactérienne présente dans l&#39;intestin grêle. Lavage avec du PBS / AA après la récolte est très important, et aucun signe de matières fécales ou de débris doit être retiré de la lumière. Placer une partie de l&#39;échafaudage dans un tube Falcon avec du DMEM dans l&#39;incubateur après la stérilisation UV doit être un indicateur si la stérilité a été atteint. Dans le casde la colonisation bactérienne, les médias vont changer le pH avec sa couleur passant du rouge au jaune. Pour régler ce problème, d&#39;autres cycles UV sont invités ainsi que le lavage avec du PBS contenant une forte concentration de l&#39;antibiotique / antifongique. Une modification possible d&#39;obtenir un échafaudage avec un accès à la fois vasculaire et veineuse serait de cathétériser la veine cave inférieure (IVC), ainsi que le SMA. Decellularization sur les côtés veineux et vasculaires devrait être tentée par intermittence pour les trois solutions. Decellularization continu peut éclater les capillaires en ayant une pression positive sur les deux côtés. Au fil des années il ya eu un certain nombre d&#39;efforts dans intestinale TE utilisant différentes combinaisons de cellules échafaudage in vitro et in vivo 6,9,12. La majorité des travaux a été effectuée à l&#39;aide non-tissé 95% PGA 5% échafaudages tubulaires PLGA revêtus de collagène de type I 6,7,13,22. Suite à l&#39;ensemencement avec intestinaleunités épithéliales organoïdes (UO) et une période d&#39;implantation dans l&#39;omentum de souris, ils forment avec les kystes muscle sur le côté extérieur et de l&#39;épithélium à l&#39;intérieur qui peut ensuite être tubularized. Cependant, la porosité et la simplicité dans la conception de ces échafaudages ne permet pas à la génération de grands morceaux de boyaux artificiels dans un environnement in vitro, telle que celle d&#39;un bioréacteur. En outre, l&#39;absence d&#39;un réseau vasculaire innée qui peut être connecté au destinataire limite davantage l&#39;utilisation de cet échafaudage pour l&#39;application clinique. Outre les expériences avec les échafaudages PGA-PLGA, les autres groupes ont utilisé des échafaudages de collagène ou de SIS, qui tous deux ne se répliquent pas la complexité de l&#39;appareil intestinal. SIS en particulier, est la seule méthodologie publiée précédent de l&#39;ingénierie tissulaire intestinal et a été utilisé dans plus de 150 paramètres médicaux, ce qui démontre la capacité des échafaudages décellularisées pour fournir une stabilité mécanique et de promouvoir la croissance des cellules tout en plombment à aucune réponse immunogène. Cependant, le manque de l&#39;architecture micro-macro et appropriée, a conduit à des résultats médiocres dans son «utilisation à des fins TE intestinales 9-11,23. Les avantages de la méthode de decellularization nous avons décrits comprennent la préservation des caractéristiques microscopiques tels que l&#39;architecture crypte-villosité luminale qui représentent un environnement approprié pour le repeuplement par la niche de cellules souches intestinales. Dans l&#39;aspect macroscopique, la présence d&#39;un réseau vasculaire hiérarchique va permettre la fixation au destinataire, en permettant la fourniture de substances nutritives et de l&#39;oxygène à toutes les couches de l&#39;intestin TE-21. De plus, le maintien de composants de la MEC telles que le collagène, l&#39;élastine et glyocosaminoglycans a un rôle important non seulement pour les caractéristiques mécaniques, mais aussi à diriger la prolifération et la différenciation cellulaire. Plus important, la capacité de la méthode de décellularisation à être étendu dans un grandtissus r tout en conservant les mêmes caractéristiques est un élément important pour la traduction clinique de TE. La mise au point d&#39;une matrice intestinale naturelle avec un réseau vasculaire permet de créer des segments plus larges de l&#39;intestin artificielle qui peut être relié à l&#39;hôte.

L&#39;ingénierie tissulaire (TE) fournit une alternative thérapeutique à la greffe d&#39;organes, en contournant les problèmes d&#39;immunosuppression et la pénurie d&#39;organes. TE a récemment eu des applications réussies dans la clinique, avec le remplacement d&#39;organes comme la vessie 1, 2 urètre et de la trachée, à la fois chez les adultes et les enfants de 5 3,4. Construction d&#39;un organe de l&#39;ingénierie tissulaire implique la combinaison d&#39;un échafaudage avec les cellules appropriées. Un échafaudage peut être préparé en utilisant d&#39;origine naturelle (par exemple, le collagène) et (par exemple l&#39;acide poly-L-glycolique; PLGA) de synthèse des matériaux, ou être obtenue par la décellularisation d&#39;organes et de tissus natifs. Les échafaudages qui ont été utilisés jusqu&#39;à présent pour intestinal TE ont principalement été soit décellularisé (petite sous-muqueuse intestinale) ou synthétiques (poly-L-acide glycolique et de l&#39;acide poly-lactique) 13.6. Ces biomatériaux sont très simples à la fois macro-et micro-architecture, quipeut ne pas être idéal si l&#39;intestin de l&#39;ingénierie tissulaire doit être traduit cliniquement. Un biomatériau optimale pour l&#39;intestin doit avoir un arbre vasculaire innée qui peut être relié à l&#39;approvisionnement en sang de l&#39;hôte, une paroi tubulaire à plusieurs niveaux avec des propriétés différentes pour tenir compte des couches de la paroi intestinale et un axe de villosités-crypt sur la face luminale à l&#39;aide de repopulation par des cellules souches épithéliales. Decellularization est une nouvelle méthodologie qui produit des échafaudages en éliminant les cellules des organes entiers, tout en conservant leur architecture d&#39;origine 14. Ceci est préférable pour des échafaudages déjà existant, car ils ne se répliquent pas seulement la structure de l&#39;organe, mais contiennent également des signaux chimiques incorporés à l&#39;intérieur de la matrice extracellulaire (ECM) que l&#39;aide de la prolifération cellulaire et la différenciation. En 2008, une trachée cadavérique a été décellularisée 14, ensemencée avec les propres cellules du patient, et transplanté à remplacer les bronche gauche chez un jeune homme <sup&gt; 3. Depuis lors, un certain nombre de groupes ont rapporté la production d&#39;échafaudages décellularisées pour le coeur 15, 16,17 foie, du poumon et de 18 à 20 dans les petites et les gros animaux. Nous avons également adapté la même méthodologie pour produire un petit échafaudage décellularisée intestinale 21. L&#39;objectif de la méthode décrite ici est de produire des matrices intestinaux décellularisées qui maintiennent les caractéristiques macroscopiques du tissu d&#39;origine tels que l&#39;approvisionnement en sang, ainsi que l&#39;architecture microscopique de l&#39;axe des villosités-crypt dans la lumière intestinale. Nous croyons que cette méthode pourrait finalement être adoptée pour d&#39;autres organes pour améliorer l&#39;efficacité de decellularization.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% in H20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Oral and eye irritant; use protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix

L&#39;ingénierie tissulaire réussie implique la combinaison d&#39;échafaudages avec des cellules appropriées in vitro ou in vivo. Les échafaudages peuvent être synthétiques, d&#39;origine naturelle ou provenant de tissus / organes. Ces derniers sont obtenus en utilisant une technique appelée décellularisation. Decellularization peut impliquer une combinaison de méthodes enzymatiques physiques, chimiques, et. Le but de cette technique est d&#39;enlever toutes les traces cellulaires tout en conservant l&#39;architecture micro-macro et du tissu d&#39;origine. L&#39;ingénierie tissulaire intestinale a jusqu&#39;à présent utilisé des échafaudages relativement simples qui ne reproduisent pas l&#39;architecture complexe de l&#39;organe d&#39;origine. L&#39;objectif de cet article est de décrire une technique de decellularization efficace pour intestin grêle de rat. L&#39;isolement de l&#39;intestin grêle, de manière à assurer le maintien d&#39;une liaison vasculaire est décrit. La combinaison de solutions chimiques et enzymatiques pour éliminer les cellules whilst la préservation de l&#39;axe des villosités-crypt dans l&#39;aspect luminal de l&#39;échafaudage est également fixée. Enfin, l&#39;évaluation des échafaudages produits pour les caractéristiques appropriées est discutée.

Lors de décellularisation réussie (figure 1), l&#39;échafaudage doit avoir un aspect macroscopique similaire à celle de l&#39;intestin d&#39;origine, mais avec des parois translucides (Figure 2A). La préservation de la macro-architecture devrait également être évident par la perméabilité de l&#39;arbre vasculaire. Lorsque le colorant est injecté à travers la canule SMA, il convient de distribuer de façon uniforme tout au long de l&#39;échafaudage et atteindre l&#39;arbre capillaire (Figure 2B). L&#39;échafaudage doit être exempt de matières nucléaires et cytoplasmiques, quelque chose qui peut être évaluée à l&#39;aide d&#39;un kit de quantification de l&#39;ADN et l&#39;analyse histologique simple. Hématoxyline et éosine (H &amp; E) doivent démontrer l&#39;absence de matières nucléaires et cytoplasmiques tout en préservant les petites couches intestinales (figure 3A). En particulier, le maintien des villosités et cryptes sur le côté luminal devrait être évident suivant la microscopie électronique à balayage (figure 4). Aconservation des composants de la matrice extracellulaire telles que le collagène, l&#39;élastine et les glycosaminoglycanes doit également être prévu. Par exemple, la coloration au trichrome de Masson d&#39;étalage intact le tissu conjonctif dans l&#39;échafaudage (figure 3B). <img alt="Figure 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> Figure 1. . Dispositif expérimental Chronologie de la procédure de decellularization; PBS / AA: tampon phosphate salin avec NaDeoxy antibiotique antifongique,: désoxycholate de sodium, RT: température ambiante, DNase I: déoxyribonucléase-je. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> Figure 2. Échafaudages macroscopiquementc caractéristiques. aspect macroscopique de la intestin grêle de rat suivante decellularization succès (A). Injection de Rosso Ponceau teindre par la SMA démontre un réseau vasculaire intact (B); SMA: l&#39;artère mésentérique supérieure <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> Figure 3. . Histologie H &amp; E (A) et MT (B) coloration indiquent une absence de matériau cellulaire à la préservation de l&#39;architecture du tissu conjonctif, H &amp; E: hématoxyline et l&#39;éosine, MT: trichrome de Masson. Barre d&#39;échelle:. 100 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . </p&gt; <img alt="Figure 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> Figure 4. . Microscopie électronique microscopie électronique à balayage indique l&#39;architecture des villosités-crypt conservé dans la lumière de l&#39;échafaudage; barre d&#39;échelle:. 100 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

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A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

L&#39;article décrit une méthode pour la production d&#39;une matrice acellulaire à partir d&#39;intestin de rat. La dérivation des échafaudages intestinale est important pour de futures applications en génie tissulaire, biologie des cellules souches et le dépistage des drogues.

Une méthodologie décellularisation pour la production d&#39;un naturel acellulaire intestinale Matrice

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

29.1K vues.  University College London.  L'article décrit une méthode pour la production d'une matrice acellulaire à partir d'intestin de rat. La dérivation des échafaudages intestinale est important pour de futures applications en génie tissulaire, biologie des cellules souches et le dépistage des drogues. 

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Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Recherche

Bio-ingénierie

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and poor patency. Tissue engineering offers a novel solution to generate personalized grafts with a natural extracellular matrix containing the recipient&#39;s cells using the method of decellularization and recellularization. We show a detailed method for performing decellularization of the human saphenous vein and recellularization by perfusion of peripheral blood. The vein was decellularized by perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphate (TnBP) and 2,000 Kunitz units of deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 and TnBP were perfused at 35 mL/min for 4 h while DNase was perfused at 10 mL/min at 37 &#176;C for 4 h. The vein was washed in ultrapure water and PBS and then sterilized in 0.1% peracetic acid. It was washed again in PBS and preconditioned in endothelial medium. The vein was connected to a bioreactor and perfused with endothelial medium containing 50 IU/mL heparin for 1 h. Recellularization was performed by filling the bioreactor with fresh blood, diluted 1:1 in Steen solution, and adding endocrine gland-derived vascular endothelial growth factors (80 ng/mL), basic fibroblast growth factors (4 &#181;L/mL), and acetyl salicylic acid (5 &#181;g/mL). The bioreactor was then moved into an incubator and perfused for 48 h at 2 mL/min while maintaining glucose between 3 - 9 mmol/L. Later, the vein was washed with PBS, filled with endothelial medium and perfused for 96 h in the incubator. Treatment with Triton X-100, TnBP and DNase decellularized the saphenous vein in 5 cycles. The decellularized vein looked white in contrast to normal and recellularized veins (light red). The hematoxylin &#38; eosin (H&#38;E) staining showed the presence of nuclei only in normal but not in decellularized veins. In the recellularized vein, H&#38;E-staining showed the presence of cells on the luminal surface of the vein.

Here, we describe a protocol for the saphenous vein decellularization using detergents and recellularization by perfusion of the peripheral blood and the endothelial medium.

DÉCELLULARISATION et méthodologie de Recellularization pour les veines saphènes humaines

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

DÉCELLULARISATION du cœur humain à l’intérieur d’une poche sous pression dans une Orientation inversée

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

Isolement et DÉCELLULARISATION d’un pancréas entier porcin

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabrication d’un Hydrogel de dérivés de matrice extracellulaire rein Cortex

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3D pour étudier matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different techniques and varies in price, materials, and purpose. Many of these fabrication methods result in polydisperse populations with non-uniform activation thresholds. Additionally, controlling the droplet sizes typically requires stable perfluorocarbon liquids with high activation thresholds that are not practical in vivo. Producing uniform droplet sizes using low-boiling point gases would be beneficial for in vivo imaging and therapy experiments. This article describes a simple and economical method for the formation of size-filtered lipid-stabilized phase-shift nanodroplets with low-boiling point decafluorobutane (DFB). A common method of generating lipid microbubbles is described, in addition to a novel method of condensing them with high-pressure extrusion in a single step. This method is designed to save time, maximize efficiency, and generate larger volumes of microbubble and nanodroplet solutions for a wide variety of applications using common laboratory equipment found in many biological laboratories.

This protocol describes a method of generating large volumes of lipid encapsulated decafluorobutane microbubbles using probe-tip sonication and subsequently condensing them into phase-shift nanodroplets using high-pressure extrusion and mechanical filtration.

Production de nanogouttelettes de décafluorobutane à déphasage filtrées par membrane à partir de microbulles préformées

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

Fermentations contrôlées par la lumière pour la production de produits chimiques microbiens et de protéines

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Mise en place d’un dispositif microfluidique pour la production de bouchons combinatoires

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

Pleins feux sur l’auteur : Intégration des approches computationnelles et expérimentales en oncologie de précision

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

Dispositif microfluidique bicouche pour la production de bouchons combinatoires

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...