Ce protocole est la passerelle vers la matrice extracellulaire. Sa complexité et sa structure jusqu’à l’échelle submicronique. Le principal avantage de cette méthode est donc qu’elle permet d’obtenir une matrice extracellulaire qui conserve son intégrité structurelle ouvrant ainsi la voie à l’analyse biochimique et anatomique.
Alejandro Mayorca Gilani, Raphael Reuten et Maria Rafaeva, actuellement dans mon laboratoire et Chris Madsen et qui était dans mon laboratoire et a continué le travail à l’Université de Lund, feront la démonstration de la procédure. Commencez par raser le thorax, l’abdomen et le dos de la souris euthanasiée avec une tondeuse à cheveux. Désinfectez la zone avec de l’éthanol à 70%.
Épinglez ensuite la souris à un plateau en polystyrène, en étendant ses quatre membres postérieurs d’extrémité, ainsi que sa tête et sa queue. Placez-le sous le microscope de microchirurgie. À l’aide d’un ciseau à motif droit Mayo, faites une incision cutanée allant de la région sous-mandibulaire au bas-ventre et disséquez par voie sous-cutanée pour exposer la paroi thoracique et le péritoine.
Utilisez ensuite des ciseaux microchirurgicaux pour couper les muscles pectoraux majeurs et pectoraux mineurs le long du sixième espace intercostal des deux côtés de la paroi thoracique. Coupez le sternum le long des incisions précédentes avec des ciseaux à motif droit. Complétez ensuite une sternotomie en coupant le sternum le long de son long axe.
Élevez et épinglez les deux côtés de la paroi thoracique pour exposer le complexe cardiopulmonaire. Utilisez des micro-pinces à pointe ronde pour exciser le thymus et le tissu adipeux environnant en les retirant délicatement de leurs attaches. Et coupez l’œsophage avec des micro-ciseaux.
Séparer les veines brachiocéphales et l’artère brachiocéphale à l’aide de micro-pinces pointues. Ensuite, séparez les artères carotide commune gauche et sous-clavière gauche du tissu sous-jacent pour faciliter la ligature et la cautérisation. Utilisez un porte-micro-aiguilles et des micro-pinces pointues et une suture de neuf oh pour placer des points de suture au-dessus de l’émergence des artères carotides communes gauches et sous-clavières gauches brachiocéphales, cautériser les veines brachiocéphales.
À l’aide de micro-ciseaux, ouvrez une entrée en sectionnant le ligament. Introduisez un cathéter de calibre 27 dans la trachée et poussez délicatement jusqu’à ce que la trachée se ramifie dans les bronches, en prenant soin de ne pas perturber les bronches. À l’aide d’une suture six O, placez trois points de suture autour de la trachée pour fixer le cathéter.
Sectionnez la souris à la hauteur de la 12ème vertèbre thoracique, l’aorte descendante court antérieurement à la colonne vertébrale et doit être sectionnée ici avec la colonne vertébrale. Cathétériser rétrogradement l’aorte et pousser le cathéter jusqu’à ce qu’il atteigne l’arc aortique. À l’aide d’une suture, placez quatre points de suture autour de l’aorte, en commençant cinq millimètres sous la pointe du cathéter.
Connectez la souris à un système de pompe à l’aide de tubes en silicone et de connecteurs inférieurs. Perfuser avec de l’eau désionisée à 200 microlitres par minute pendant 15 minutes. Ensuite, changez l’agent de perfusion à 0,5% DOC, dilué dans de l’eau désionisée et perfusez pendant la nuit.
Le lendemain, changez l’agent de perfusion à 0,1% SDS dilué dans de l’eau désionisée et perfusez pendant huit heures. Ensuite, perfuser avec de l’eau désionisée pendant 24 heures pour laver la FDS et le DOC. Réséquez le cœur et les poumons décellularisés en sectionnant ses attaches au thorax.
Conservez le tissu dans un tube cryogénique stérile dans de l’eau désionisée avec 1% de streptomycine de pénicilline et 0,3 azoture de sodium micromolaire à quatre degrés Celsius. Pour effectuer une coloration immunologique, bloquez l’échantillon en l’incubant dans un tube cryogénique contenant 6% de sérum d’âne et 3% de BSA pendant la nuit. Ensuite, incuber avec un anticorps primaire dans du sérum d’âne à 3% dans le PBS pendant 24 heures.
Après l’incubation, lavez l’échantillon cinq fois dans du PBST pendant une heure par lavage. Incuber l’échantillon avec un anticorps secondaire conjugué par fluorescence dans du sérum d’âne à 3% dans le PBS pendant 24 heures. Répétez ensuite les lavages dans PBST.
Ajouter l’eau ionisée et conserver l’échantillon à quatre degrés Celsius de la lumière directe. Pour imager l’échantillon, placez-le dans un plat à fond de verre et humidifiez-le avec deux gouttelettes de solution de stockage. Définissez l’objectif et inspectez l’échantillon à l’aide de la lumière de fluorescence.
Passez au contrôle informatique, allumez les lasers et ajustez l’intensité du laser, l’ouverture du sténopé, la longueur d’onde des détecteurs, le gain, la résolution et le zoom. Définissez le nombre et la taille de l’étape pour la pile Z, puis commencez l’acquisition. Excisez un lobe pulmonaire d’une souris euthanasiée et placez-le dans un moule cryogénique de 10 x 10 x cinq millimètres.
Couvrez-le avec environ 500 milles de microlitres de composé OCT et congelez-le sur de la glace carbonique. Maintenez l’échantillon à cette température. Excisez un lobe pulmonaire décellularisé d’une souris traitée, placez-le dans un moule cryogénique avec la plus grande surface vers le bas et recouvrez-le de composé OCT.
Congelez l’échantillon sur de la glace carbonique et maintenez-le à cette température jusqu’à ce qu’il en soit autrement. L’échantillon peut être conservé pendant au moins 12 semaines. Utilisez un cryostat pour sectionner des blocs de tissus congelés en cinq sections micrométriques à moins 20 degrés Celsius.
Et placez les sections sur des lames de verre adhésif. Transférer les lames à température ambiante jusqu’à ce qu’elles sèchent à l’air. Immergez brièvement les diapositives dans PBS, suivies de 4% de paraformaldéhyde dans PBS pendant 15 minutes.
Laver une fois dans du PBS, puis deux fois dans de l’eau distillée pendant cinq minutes par lavage. Immergez les lames dans la solution d’hématoxyline de Myer pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les lames dans un pot Copeland sous de l’eau distillée courante pendant 10 minutes et immergez-les dans une solution d’éosine pendant sept minutes.
Tremper dans le xylène plusieurs fois. Appliquez quelques gouttes de support de montage DPX et placez un couvercle en verre. Laissez les lames sécher pendant la nuit sous une hotte chimique, puis scannez-les dans un scanner à diapositives.
Après avoir terminé avec succès le protocole, le cœur, les poumons et le tissu NX seront exempts de cellules. La décellularisation peut être validée par coloration à l’hématoxyline éosine des échafaudages ECM. Les échafaudages conservent les dimensions des organes frais et sa structure ECM insolable est intacte.
Les échafaudages ECM ont montré une perméabilité accrue et une pénétrabilité légère. L’utilisation de ce protocole avec un étage de microscope motorisé permet une imagerie en mosaïque tridimensionnelle d’échantillons de montage entiers à une résolution inférieure au micron. Il est essentiel d’éviter le flux vers les organes d’intérêt pour obtenir une décellurisation uniforme complète.
La dissection microchirurgicale et la ligature des vaisseaux doivent être efficaces. Et en même temps respecter les tissus cibles pour maintenir la structure VCM native. Suite à cette procédure, les échafaudages seront enrichis pour les protéines ECM structurelles et pourront être utilisés pour la spectrométrie de masse ou l’ingénierie tissulaire.
Cette technique ouvre la voie à la cartographie à haute résolution de la matrice extracellulaire.
