À notre connaissance, ce protocole est le premier à produire des matrices décellularisées à partir du muscle squelettique fœtal, offrant une nouvelle approche pour étudier les myopathies qui commencent à se développer in utero. Ce protocole génère des mesures spécifiques au développement et aux tissus qui peuvent être utilisées pour étudier le comportement des cellules musculaires et les interactions avec la matrice extracellulaire dans un environnement contrôlé. LAMA2-CMD est une dystrophie musculaire congénitale qui commence à se manifester à la naissance.
Ce modèle peut aider à démêler les mécanismes de modèle impliqués dans son apparition et conduire à de nouvelles thérapies cibles. Ce protocole peut être adapté à différents tissus et modèles de maladies. Différents niveaux de complexité peuvent être atteints en fonction des types de matrice et de cellules, démontrant la polyvalence du système.
Il s’agit d’un protocole très simple. La partie la plus difficile est la collecte et la manipulation des échantillons. Mais, avec de la pratique, les compétences techniques peuvent facilement être améliorées.
Commencez par transférer un fœtus euthanasié à la fois dans une boîte de Pétri contenant du PBS glacé. Après avoir excisé la peau et les membres, coupez la face ventrale de la cage thoracique. Retirez le sternum et les organes sous-jacents.
Placez le côté dorsal du fœtus vers le haut et retirez la partie cervicale de la colonne vertébrale. Ensuite, excisez les dépôts de graisse dorsale et le tissu conjonctif du muscle profond du dos. Maintenant, ancrez la cage thoracique à l’aide d’une pince chirurgicale.
Avec un microscalpel, grattez soigneusement pour détacher les muscles profonds du dos des tissus environnants. Stockez les tissus dans du PBS dans une plaque de culture cellulaire de 12 puits à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Pendant une période plus longue, conservez le tissu dans un tube à microcentrifugation vide à moins 80 degrés Celsius.
Le premier jour, utilisez des masses musculaires epaxiales entières. Ajouter trois millilitres de tampon hypotonique contenant 1% de pénicilline et de streptomycine à chaque puits d’une plaque de 12 puits. Ajouter un fragment de tissu musculaire à chaque puits et incuber pendant une nuit pendant 18 heures avec agitation.
Le deuxième jour, retirez le tampon à l’aide d’une pipette à pointe fine. Maintenant, lavez les échantillons trois fois avec trois millilitres de PBS avec une agitation d’une heure à chaque fois. Après avoir jeté le PBS, incuber les échantillons dans trois millilitres de solution détergente SDS à 0,05% pendant 24 heures avec agitation.
Le troisième jour, utilisez une pipette à pointe fine pour retirer le détergent SDS et lavez les fragments trois fois avec trois millilitres de tampon de lavage hypotonique avec une agitation de 20 minutes à chaque fois. Remplacez la solution des puits par deux millilitres de solution de DNase et incuber les fragments de tissu à 37 degrés Celsius pendant trois heures avec agitation. Après avoir retiré la solution de DNase, laver les fragments trois fois avec trois millilitres de PBS avec une agitation de 20 minutes à chaque fois, en laissant le dernier lavage pendant la nuit.
Dans une fiole T-25 ensemencée de cellules C2C12 sous-confluentes, ajouter 500 microlitres de trypsine et remettre en suspension dans un millilitre de milieu complet. Mélanger 10 microlitres de la suspension avec 10 microlitres de colorant bleu trypan et charger dans un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules et estimer la viabilité. Dans une hotte à flux laminaire, placer les matrices décellularisées, ou dECM, dans une boîte de Petri contenant du PBS avec 1% de pénicilline et de streptomycine.
À l’aide d’un microscalpel et d’une pince à épiler, séparez les matrices en petits morceaux. Transférer les fragments dans les puits d’une plaque de 96 puits, en plaçant trois à quatre morceaux par puits. Ajouter 200 microlitres de milieu de culture complet préchauffé dans chaque puits et incuber la plaque pendant deux heures à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Jeter le milieu dans la plaque du puits et ajouter 200 microlitres de milieu de culture complet contenant 50 000 cellules C2C12 viables dans chaque puits. Incuber la plaque de puits pendant deux jours. Transférer les dECM avec les cellules dans une plaque de 48 puits contenant 400 microlitres de milieu de culture complet.
Aspirer soigneusement le milieu tous les deux jours pour éviter le détachement de la matrice et reconstituer avec le milieu frais jusqu’au huitième jour. Pour la différenciation, remplacer le milieu de culture complet par un milieu de différenciation et incuber pendant quatre jours jusqu’au 12ème jour. Le tissu musculaire était rougeâtre immédiatement après l’isolement et est devenu blanc en raison de la lyse cellulaire après incubation dans un tampon hypotonique.
SDS rend les muscles transparents. Après le traitement par DNase, une dECM plus petite et transparente a été obtenue. La quantification de l’ADN révèle une diminution de près de 100% des dECM par rapport au tissu natif.
Les dECM et le tissu natif présentaient une coloration tubulaire similaire pour la laminine alpha deux et la protéine laminine. L’analyse Western blot du tissu natif a révélé deux bandes pour la sous-unité laminine alpha deux, tandis que trois bandes plus petites ont été détectées dans la dECM. Pour les laminines totales, les échantillons dECM ont montré une fragmentation des protéines par rapport au tissu natif.
La fibronectine et le collagène I étaient présents dans l’espace interstitiel entre les cellules du tissu natif et les dECM. Des bandes de fibronectine similaires étaient présentes dans les deux échantillons, ce qui indique qu’elle n’est pas affectée par la décellularisation. Moins de bandes de collagène I ont été observées dans les dECM.
Pour le collagène IV, les deux échantillons présentaient une coloration tubulaire similaire. Cependant, le poids moléculaire des bandes dECM était plus faible. Les cellules C2C12 ont colonisé et proliféré dans les dECM et fusionné en myotubes multinucléés.
Ceux-ci exprimaient la protéine de chaîne lourde en myosine après quatre jours d’incubation dans un milieu de différenciation. Une coloration intracellulaire et péricellulaire a été observée pour la laminine alpha à deux chaînes, les laminines totales et la fibronectine. Les échafaudages squelettiques de souris fœtales décellularisés peuvent être utilisés pour cultiver des cellules dans des systèmes de co-culture, ce qui les rapproche de la situation in vivo et contribue ainsi à la compréhension des maladies musculaires.
