Ce travail a été soutenu par une bourse de l&#39;Université de la Colombie-Britannique (à BV) et des subventions de Fibrose kystique Canada et du Canada Instituts de recherche en santé (DPS) à. Nous remercions Jacqueline Chung pour la préparation initiale de protocoles.

Une. La croissance de la culture (Jours 1 +2) <ol><li> Cultiver une culture de départ: 3 ml de Luria Bertani (LB) dans un tube pression supérieure de 15 ml, à 37 ° C pendant la nuit de la coiffe. Diluer la croissance durant la nuit jusqu&#39;à une DO 600 de 0,6. Ajouter 1 ml de cette dilution à 100 ml de bouillon LB dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml. Incuber à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute pendant 16 heures en phase stationnaire (SP), pour mieux approximatif, en culture par lot, les conditions d&#39;infection et pour garantir que les facteurs de virulence bactérienne sous le contrôle d&#39;stationnaires facteurs de signal de phase tels que rpoS et quorum détection, elles sont exprimées. Sinon, les bactéries cultivées à SP début ou milieu de la phase ou la fin-logarithmique peuvent être utilisés pour obtenir des informations sur la phase d&#39;adaptation bactérienne. </li><li> Après 16 heures de mesurer la DO à 600 et d&#39;assurer la culture a atteint SP par rapport à une courbe de croissance construite précédemment dans des conditions identiques. </li></ol> 2. Extraction des protéines (Jour 3) <ol><li&gt; Réfrigérer tous les médias et des solutions avance dans le réfrigérateur pendant la nuit. Toutes les mesures doivent être réalisées avec des tubes dans un seau à glace. Prérefroidissement une micro et une centrifugeuse Beckman Coulter haute performance (ou équivalent) à 4 ° C et le rotor intérieur (rotor = JA-20, centrifugeuse J2 =-SH). </li><li> Préparer une solution fraîche 0,1 M phénylméthanesulfonyle fluorure (PMSF, 174,19 g / mol) dans de l&#39;acétone en dissolvant 0,0174 g de PMSF (PMSF &#39;ATTENTION&#39; est toxique et corrosif, l&#39;utilisation des écrans faciaux et des gants) dans 1 ml d&#39;acétone (acétone &#39;ATTENTION&#39; est toxique et inflammable, utiliser des écrans faciaux et des gants). </li><li> Préparer une solution de PBS / EDTA / PMSF: 0,1 ml de PMSF 0,1 M, 0,1 ml d&#39;EDTA 0,5 M, et 9,8 ml de PBS. Vérifiez la DO de la culture h 16 est à peu près où il devrait être dans SP. </li><li> Prendre 35 ml de la culture bactérienne et le transfert à un tube de centrifugeuse Oakridge et centrifuger la culture à 4500 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant à un conteneur de déchets etajouter 35 ml de PBS refroidi et remettre le culot. Centrifuger à 4500 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de PBS froid. Transfert à stériles Eppendorf de 2 ml et centrifuger 1 min en haut dans le centrifuger à 14 000 g à 4 ° C. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de solution de PBS / EDTA / PMSF, remettre le culot et le transfert à un 2 ml à vis tube à bouchon (avec joint torique) contenant ~ 0,5 ml de perles de verre (pré-stérilisés). Ajouter le culot remis en suspension dans le tube contenant les perles de verre et les perles bash à 4 ° C pendant 1 minute dans la chambre froide. Pour ce faire, 3x, mettre l&#39;échantillon sur la glace après chaque coup. </li><li> Centrifuger à 14 000 g pendant 1 min dans la microcentrifugeuse. Enlever le surnageant et le mettre dans un 5 ml tube en polystyrène stérile. </li><li> Pour augmenter le rendement, ajouter 1 ml de PBS / EDTA / solution de PMSF à même tube contient encore des perles de verre. Bash bourrelet du tube à 4 ° C pendant 1 min. Ne ce 2x mettre l&#39;échantillon sur af glaceter bash. Centrifugeuse à 14 000 g pendant une minute à la centrifugeuse et enlever le surnageant et ajouter au surnageant de l&#39;étape 2.8. Utiliser une seringue de 1 ml et un filtre de 0,20 um le surnageant à partir du tube en polystyrène stérile à un nouveau tube de Eppendorf de 2 ml. </li><li> A ce stade, les échantillons doivent être analysés pour déterminer la quantité de protéines, en utilisant la protéine kit et des aliquotes de 200 ug extraction Pierce MicroBCA doit être congelé à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;échantillon (Jour 4) <ol><li> Préparer 25 ml réhydratation solution stock (8 M d&#39;urée, 2% de CHAPS, 2% IPG Buffer, 0,002% de bleu de bromophénol) et entreposer dans 2,5 ml aliquotes à -20 ° C. Ajouter 7 mg dithiothréitol (DTT, 154,2 g / mol) juste avant de les utiliser à une aliquote de solution de réhydratation des stocks de 2,5 ml. </li><li> Processus décongelé des échantillons de l&#39;étape 2.10 en utilisant un 2-D Clean up kit avec remise en suspension finale dans 450 pi de solution de réhydratation des stocks préparés à l&#39;étape 3.1. </li></ol> 4. PremièreDimension Isoélectrofocalisation (IEF) (Jour 4) Toutes les étapes de cette section utilisent le système IEF Ettan IGPhor. <ol><li> Mettre en place les IPG premières bandes de dimension: distributeurs de bande propres avec une solution de nettoyage de la bande, puis laver avec de l&#39;eau Milli-Q, laisser à l&#39;envers pour sécher. Assigner chaque échantillon à un numéro de support de bande de gel. </li><li> Charger l&#39;échantillon provenant de l&#39;étape de réhydratation dans la seconde zone plus grande de l&#39;extrémité (-). Utilisez une pince pour tirer propres bandes de gel sur l&#39;emballage. Sortez couche protectrice de bandes de gel. Ligne bandes côté rugueux vers le bas dans un mouvement lent glissement d&#39;obtenir les bandes humides le long du chemin de (-) à la fin (+) fin. </li><li> Mettez du papier buvard humide avec de l&#39;eau stérilisée au-dessus de l&#39;électrode et dans les bandes de gel pour prévenir l&#39;épuisement professionnel. Rincer pinces entre-deux tours avec de l&#39;eau purifiée et de l&#39;éthanol. Retirez toutes les bulles, superposer finement avec de l&#39;huile minérale pour éviter des déplacements secs. Aligner les supports de bande de gel sur la machine. </li><li> Exécutez 12 h à 20 ° C pour rehydration, 1 heure à 200 V, 1 heure à 500 V, 1 h à 1 000 V, 0,5 heure à 4000 V, 12 h à 8 000 V, 24 heures cale à 300 V et peut être retirée à ce moment. </li><li> Après IEF est terminé, il est recommandé d&#39;effectuer la deuxième dimension électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS, à moins que la bande IPG sont en cours de congélation à -80 ° C en Saran Wrap enduit avec de l&#39;huile minérale pour une analyse ultérieure. En variante, afin d&#39;éviter le point de stries en raison de l&#39;accès de DTT, il est possible d&#39;inclure une seconde étape d&#39;équilibrage de l&#39;IPG strips avant la seconde dimension avec un tampon qui contient de l&#39;iodoacétamide. </li></ol> 5. Deuxième dimension SDS-polyacrylamide gel d&#39;électrophorèse (Jour 5) Toutes les étapes de cette section utilisent l&#39;appareil d&#39;électrophorèse Ettan DALTsix. <ol><li> Pour assembler l&#39;appareil gel en poudre, nettoyer soigneusement tous les composants et veiller à ce que le gel poudre est de niveau et la fixation caoutchouc gris est lubrifié avec du gel de silicone. Mettez le bât blesse noirber arrêt triangulaire sur le fond. Ensuite, placer alternativement le séparateur et les plaques de verre avec la plaque de verre inférieure de face. Assurez-vous que les séparateurs sont à l&#39;arrière et l&#39;avant. Remplir l&#39;espace restant avec les charges (environ 5 feuilles) de sorte que le sommet est plat. Mettez le panneau avant sur la pointe rouge à l&#39;extérieur. Utilisez des pinces pour serrer chaque côté et serrer les vis du bas. </li><li> Préparation du gel: Ajouter 297,3 ml de Duracryl, («ATTENTION» Duracryl est l&#39;utilisation toxique écrans faciaux et des gants), 147 ml de tampon Tris 1,5 M pH 8,8, et 143,3 ml d&#39;eau Milli-Q dans un ballon avec pointe à vide contenant un barre d&#39;agitation. Mettre le couvercle sur le dessus et une solution mélanger à vitesse modérée avec le vide pendant 20 min. Le vide est utilisé pour dégazer la solution. Prendre un nouveau 10% de la solution de persulfate d&#39;ammonium (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g d&#39;APS à 2 ml d&#39;eau Milli-Q. </li><li> Ajouter le mélange de gel à la poudre de gel: Lorsque le vide est fait d&#39;ajouter 6 ml de 10% de dodécylsulfate de sodium (SDS, 228,38 g / mol)sur le côté de la fiole pour éviter de mettre plus de bulles dans la solution. Ajouter APS, remuer, ajouter 0,25 ml de N, N, N &#39;, N&#39;-tétraméthyléthylènediamine (TEMED, 116,20 g / mol) («ATTENTION» TEMED est inflammable utilisation des écrans faciaux et des gants) et remuer. </li><li> Verser le mélange de gel dans le gel à travers un entonnoir de coulée inséré à l&#39;arrière de l&#39;appareil. Verser jusqu&#39;à un pouce en dessous de la plaque de court. Ajouter 1,5 ml de butanol saturé d&#39;eau à la surface du gel et envelopper le dessus avec une pellicule pour éviter la déshydratation. Attendez pendant 1 heure pour assurer la pleine polymérisation. </li><li> Vérification du gel: Lorsque le gel est fait (consultez le ballon), démonter le lanceur de gel par un évier. Vérifier l&#39;intégrité du gel pendant le rinçage des plaques de verre avec de l&#39;eau chaude, ne pas laisser l&#39;eau entrer dans la plaque. Verser le butanol et rincer le haut de gel deux fois avec de l&#39;eau pour se débarrasser de butanol. Remplissez le haut avec de l&#39;eau à nouveau et laisser reposer si les gels ne sont pas utilisés immédiatement. </li><li> Préparation des bandes: Préparer une solution de tampon d&#39;équilibrage à partir de lacongélateur (6 M d&#39;urée, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,9% de SDS, 0,002% de bleu de bromophénol). Cela peut être préalablement préparé et stocké dans des aliquotes de 10 ml à -20 ° C. Dissoudre 0,1 g de DTT à 10 ml d&#39;une solution de tampon d&#39;équilibrage. Un tube peut être utilisé pour deux bandes IPG. Placez les gels de la face de la bande vers le bas sur le tampon et laisser reposer pendant 30 min. Rappelez-vous ce qui est fin, qui. </li><li> Préparation de l&#39;unité d&#39;électrophorèse (d&#39;un appareil de séparation 2-D): Ajouter 4,5 L de 1x électrophorèse tampon (25 mM Tris Base [121,1 g / mol], 192 mM de glycine [288,38 g / mol], et 0,1% p / v de SDS [288,38 g / mol]) à la cuve en cours d&#39;exécution. Ce tampon peut être utilisé pour un maximum de 3x. Mettez l&#39;appareil d&#39;électrophorèse sur. Vérifier le niveau d&#39;eau dans la machine de refroidissement par eau et remplissez-le avec de l&#39;eau si elle est faible. Allumez la machine, appuyez sur mode pour vérifier la température désignée, qui doit être de 10 ° C. </li><li> Assurez 1 L de tampon 2x course et 1 L de 1x de tampon de migration et de les stocker à 4 ° C. Préparer une solution d&#39;agarose-étanchéité: poids 0,25 g de agarose et le dissoudre dans 50 ml de tampon de 1x en cours d&#39;exécution. Pulse pendant 15 secondes chacun. </li><li> Mise en place de l&#39;unité d&#39;électrophorèse: Utilisez une pince à épiler à prendre sur chaque bande et retirer le tampon en excès des deux côtés de serviette en papier propre. NE PAS toucher les bandes. Verser l&#39;eau sur le dessus du gel et la ligne du haut de gel avec un tampon de 1x courante. Utilisez des pinces propres et placer les bandes sur le dessus de la plaque longue, avec le côté gel face à vous. Ajouter tampon 1x pour les bandes à lubrifier. bandes de diapositives plus loin en utilisant des bandes en plastique. Retirez toutes les bulles entre la bande et le gel. </li><li> Ajouter la solution d&#39;agarose-étanche à la partie supérieure de la bande pour le sceller. Répéter pour le reste des bandes. Placez les plaques de verre contenant les gels en gel berceau et inférieure dans le réservoir de gel. S&#39;assurer que le niveau de tampon 1x dans la chambre extérieure est sur la ligne de fond désigné avant de mettre la chambre supérieure sur. </li><li> Placez le cadre pour chambre tampon supérieur sur les plaques de verre et de s&#39;assurer qu&#39;il est d&#39;autant way descendre en appuyant sur le bas vers le bas. Utilisez un entonnoir et ajouter le tampon de migration 2x dans la chambre supérieure à la ligne médiane. Utilisez un entonnoir et ajouter tampon de course 1x à la chambre extérieure jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne la ligne du haut. Placer le couvercle sur le dessus et allumer l&#39;appareil d&#39;électrophorèse et le bloc d&#39;alimentation. </li><li> Exécutez la nuit à 52 V, 96 mA, 5 W. Vérifiez si le courant va en recherchant des bulles sur le fil d&#39;argent vers le haut. Exécutez le gel jusqu&#39;à ce que la ligne éditoriale est de 1 cm du fond. </li><li> Les protéines peuvent également être analysées à l&#39;aide du matériel et des réactifs d&#39;autres sociétés telles BIORAD ou Hoefer, selon les instructions du fabricant. </li></ol> 6. Argent coloration des gels pour Gel visualisation (Jour 5-6) <ol><li> Préparer une solution d&#39;une solution (800 ml d&#39;éthanol, 200 ml d&#39;acide acétique et 1,000 ml d&#39;eau Milli-Q dans une hotte dans un seau en plastique). Solution est bonne pour 6 gels. Mettez toutes les machines hors tension et retirer la totalité de la section médiane de l&#39;unité d&#39;électrophorèse et d&#39;unité centralell il dans l&#39;évier. Mettre également à la barre blanche dans l&#39;évier. Tirez sur le plateau supérieur contenant le tampon 2x en cours. </li><li> Démonter l&#39;appareil et retirer les gels à partir des plaques de verre dans la solution de correctifs 1. Les gels peuvent être identifiés en coupant les coins quand ils sont retirés des plaques de verre, le nombre de coins coupés correspondant à l&#39;ordre de gel dans le lanceur. </li><li> Placer le récipient avec la solution de correction et les gels sur un balancier pendant au moins 1 h à une nuit à 4 ° C. </li><li> Transférer les gels de fixer Solution 2 (20 ml de glutaraldéhyde à 50%, 600 ml d&#39;éthanol, 5 g de tétrathionate de potassium (302,46 g / mol), 136 g d&#39;acétate de sodium (82,03 g / mol), et de l&#39;eau Milli-Q à 2000 ml) et les déposer sur une bascule pendant 1 heure. </li><li> Laver les gels 4x pendant 15 min chacun dans de l&#39;eau Milli-Q. </li><li> Colorer les gels dans la solution de nitrate d&#39;argent (4 g de nitrate d&#39;argent (169,87 g / mol), 500 ul de formaldehyde, et de l&#39;eau Milli-Q à 2000 ml) pendant 30 min ou jusqu&#39;à 48 h. </li><li> Laver gel pour 1min dans de l&#39;eau Milli-Q. </li><li> Transférer à la solution de révélateur (60 g de carbonate de sodium (105,99 g / mol), 300 ul de formaldehyde, 15 mg de thiosulfate de sodium (158,11 g / mol), et de l&#39;eau Milli-Q à 2000 ml) pendant 5 à 30 min jusqu&#39;à ce que l&#39; gel est coloré. </li><li> Mettre les gels dans la solution d&#39;arrêt (100 g de Tris-Base (121,14 g / mol), 40 ml d&#39;acide acétique et de l&#39;eau Milli-Q à 2000 ml) pendant 10 min. </li><li> Pour le stockage, le transfert des gels à la solution de glycérol (40 ml du glycérol ou 400 ml si le stockage à long terme est nécessaire, et 1600 ml d&#39;eau Milli-Q) pendant 10 min, puis les sécher à l&#39;aide d&#39;un sèche-gel. </li><li> Gels peuvent être visualisées après coloration à l&#39;aide de systèmes d&#39;imagerie comme un scanner / densitomètre, photographié en utilisant transilluminateur lumière ou Gel imageur. Logiciel d&#39;analyse de l&#39;image, comme PDQuest analyse 2-D de BIORAD peut ensuite être utilisé pour obtenir des informations quantitatives et qualitatives de protéines dans un échantillon. </li></ol> 7. Gel coloration à l&#39;argent pour l&#39;analyse de spectrométrie de masse </p&gt; <ol><li> Fixer les gels dans 50% de méthanol, et de l&#39;acide acétique à 5% pendant 1 heure. </li><li> Laver à 50% de méthanol pendant au moins 10 min à une nuit. </li><li> Laver à l&#39;eau distillée 3x pendant 10 min. </li><li> Sensibiliser avec du thiosulfate de 0,02% de sodium (158,11 g / mol) 2x pendant 15 min. </li><li> Laver pendant 3x dans REFRIGERE 3x de l&#39;eau distillée pendant 10 min. </li><li> Immerger gel dans REFRIGERE solution de nitrate d&#39;argent à 1% (169,87 g / mol) pendant au moins 20 min à 1 h à 4 ° C </li><li> Laver 2x pendant 1 min à l&#39;eau distillée. Changer plateau / seau. </li><li> Développer dans 0,04% de formaldéhyde dans 2% de carbonate de sodium anhydre (105.99 g / mol) et jeter quand il devient jaune très rapide; avoir trois lots et être prêt à changer toutes les 5 min. </li><li> Laver dans de l&#39;acide acétique à 5% puis stocker dans de l&#39;acide acétique à 1%. </li><li> Rincer tubes de 1,5 ml Eppendorf (pour tenir obtenir place découpes) avec de l&#39;éthanol de qualité USP et sécher à l&#39;air avant de l&#39;utiliser. </li><li> Pinces propres, lames de rasoir et des surfaces avec 100% de méthanol. </li><li> Des gants et des surfaces de pulvérisation avec de l&#39;éthanol. </li><li> taches d&#39;accise dans une hotte à flux ou de la zone de l&#39;air pur. Les spots peuvent également être excisées en utilisant un couteau de place automatisé. </li><li> Mettez-les dans des tubes Eppendorf et bateau sur la glace ou de conserver dans le réfrigérateur. </li></ol>

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Biol. 424, 35-42 (2008).</li><li>von der Haar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protein+extraction+for+quantitative+proteomics+of+yeasts.">Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts.</a> PLoS One. 2, e1078 (2007).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li><li>Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+low-abundance+proteins+using+multidimensional+chromatography+and+isotope-coded+affinity+tags.">Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags.</a> J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li><li>Velapati&#241;o, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+proteins+from+Burkholderia+pseudomallei+isolated+during+primary+and+relapsing+melioidosis.">Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis.</a> Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).</li><li>Chung, J. W., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+and+characterization+of+bacterial+factors+associated+with+Burkholderia+cenocepacia+survival+in+a+murine+host.">Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host.</a> Microbiology. 153, 206-214 (2007).</li><li>Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Public+health+assessment+of+potential+biological+terrorism+agents.">Public health assessment of potential biological terrorism agents.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).</li><li>Thon, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteomic+analysis+of+protein+changes+during+platelet+storage+requires+complementary+proteomic+approaches.">Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches.</a> Transfusion. 48, 425-435 (2008).</li><li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+New+and+Emerging+Proteomic+Techniques.">In New and Emerging Proteomic Techniques.</a> Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).</li><li>Lopez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+silver+stain+and+SYPRO+Ruby+Protein+Gel+Stain+with+respect+to+protein+detection+in+two-dimensional+gels+and+identification+by+peptide+mass+profiling.">A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling.</a> Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Procédé de préparation de protéines a été décrite qui peut extraire la majorité des protéines Burkholderia avec une bonne reproductibilité. Ceci est démontré par l&#39;obtention du même profil de protéine à partir de deux préparations indépendantes réalisées en différents jours en utilisant la même culture bactérienne cultivée dans un bouillon LB ou de YEM comme représenté sur la figure 1. Extraction était efficace pour les bactéries cultivées dans un milieu liquide,...

Le genre Burkholderia comprend plus de 62 espèces, organismes Gram négatifs isolés à partir d&#39;une large gamme de niches, et elle est divisée en deux groupes principaux 1,2. Le premier groupe comprend des organismes phytotrophique humaine, animale et, et la plupart des études ont porté sur les espèces pathogènes de ce groupe en raison de leur importance clinique. Les membres les plus pathogènes sont B. pseudomallei et B. mallei (qui provoque melioidosis et morve respectivement) 3,4 et pathogènes opportunistes (les 17 espèces déterminées du complexe Burkholderia cepacia, BCC) 5, qui causent la maladie de la fibrose kystique (FK) et granulomatose chronique (CGD) 1. Le deuxième groupe, avec plus de 30 espèces non pathogènes, comprend bactéries associées aux plantes ou à l&#39;environnement, et sont considérés comme potentiellement bénéfique à l&#39;hôte 2. De nombreuses complications surgissent frinfection bactérienne om avec les éléments pathogènes du genre Burkholderia, tels que la transmission de l&#39;agent pathogène entre les patients, la propagation de la maladie et l&#39;échec du traitement en raison de la résistance intrinsèque ou acquise aux antibiotiques rend difficile à éliminer dans la plupart des cas, de 6 à 9. Par conséquent, acquérir une meilleure compréhension de la base pour l&#39;établissement d&#39;une infection bactérienne est essentiel pour le traitement des maladies causées par ces organismes. Afin de mieux comprendre la mise en place de l&#39;infection, des enquêtes approfondies sur les composants bactériens associés à la pathogenèse sont nécessaires. Les études portant sur ​​l&#39;analyse protéomique des organismes Burkholderia utilisant une approche protéomique décrits protéines qui ont été impliqués dans la pathogenèse bactérienne ainsi que des changements dans leur protéome Profils avec 10-16. méthodes d&#39;extraction des protéines à l&#39;aide de sonication et les cycles de gel-décongelés dans un tampon de lyse contenant une grande concentration de l&#39;urée, de la thio-urée en combinaison avec un détergent et ampholytes a été appliquée dans des études protéomiques Burkholderia 10-13. Bien que l&#39;urée est tout à fait efficace pour la dénaturation des protéines, on peut établir un équilibre en solution aqueuse avec de l&#39;isocyanate d&#39;ammonium, qui peut réagir avec les groupes d&#39;acides aminés, en formant ainsi des artefacts (réaction de carbamylation) 17. Par conséquent, il est recommandé d&#39;inclure des ampholytes porteurs, qui agissent comme piégeurs de cyanate et d&#39;éviter des températures supérieures à 37 ° C 17. En outre, pour éviter toute interférence chimique de tampon de lyse avec de la protéine quantification, le même tampon de lyse peut être utilisé pour générer la courbe d&#39;étalonnage de telle sorte que les échantillons et les standards ont le même fond 10. D&#39;autres méthodes impliquent l&#39;utilisation de tampons et détergents alcalins avec des périodes d&#39;incubation de chaleur 17,18, mais ces conditions pourraient induire des changements dans le protéome et certains détergents sont pas compatibles avec proteomics demande si des mesures ultérieures d&#39;élimination de détergent sont inclus 17,18. Après l&#39;extraction et la quantification adéquate, expression de la protéine globale de chaque protéine individuelle peut être étudiée en utilisant des approches protéomiques telles que deux dimensions (2-D) électrophorèse sur gel. Cette technique a été décrite par O&#39;Farell 19 et consiste en la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique dans la première dimension, et ensuite en fonction de leur poids moléculaire par électrophorèse sur gel d&#39;acrylamide dans la seconde dimension. En raison de sa sensibilité et de résolution, cette technique est un outil puissant pour l&#39;analyse et la détection des protéines provenant de sources biologiques complexes 19,20. Cette technique de séparation est actuellement disponible dans les approches de protéines centrée avec le grand avantage de résoudre isoformes de protéines causées par des modifications post-transcriptionnelles ou traitement protéolytique. Les changements quantitatifspeut être détectée en comparant l&#39;intensité de la tache correspondant après coloration du gel 20. Cependant, cette technique n&#39;est pas adaptée pour l&#39;identification de très grosses protéines, des protéines membranaires, des protéines extrêmement acides ou basiques et hydrophobes, et est une technique assez laborieux et prend du temps 20. De nouvelles approches de peptides centrée (à base de gel non) qui sont plus robustes et objective deviennent disponibles et peuvent être utilisés pour la comparaison quantitative par des méthodes stable de marquage isotopique différentielles telles que l&#39;étiquetage de la cystéine par affinité isotope codé marquage (ICAT) 21, et un groupe amino étiquetage par isotopes marquage pour la quantification relative et absolue (iTRAQ) 22. L&#39;utilisation d&#39;une technique de protéomique unique pourrait donner des informations insuffisantes, par conséquent l&#39;utilisation de deux approches protéomiques complémentaires est nécessaire pour la plupart des changements évaluer pleinement dans protéome. Néanmoins, l&#39;électrophorèse sur gel 2-D est largement utilisé et peut être appliquée de façon routinière pour la quanquantitatif expression de plusieurs protéines dans des organismes différents. Nous décrivons ici une extraction de protéines à cellules entières et les procédures d&#39;électrophorèse sur gel 2-D pour les espèces de Burkholderia qui ont été adaptés et optimisés à partir des 2-D Principes électrophorèse GE Healthcare et méthodes Manuel 80-6429-60AC 2004 ( <a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a> ). L&#39;extraction de la protéine a été effectuée en utilisant un batteur de billes avec des billes de verre en présence de PBS contenant 5 mM d&#39;EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique) et 1 mM de PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle). Cette procédure permet la quantification des protéines avec une dégradation minimale et est modifiable pour les approches protéomiques Comme indiqué précédemment 15,23,24. Électrophorèse sur gel 2-D a été effectuée en utilisant 24 cm de long immobilisées pH 4-7 gradient et les protéines ont été séparées en fonction de leur point isoélectrique. Ensuite, les protéines ont été séparées en fonction de leur Molecpoids culier par gel SDS-polyacrylamide. De plus, nous avons décrit un procédé de coloration à l&#39;argent pour la visualisation des protéines d&#39;accompagnement, et un procédé de coloration à l&#39;argent qui est compatible pour l&#39;analyse par spectrométrie de masse. Ensemble, ces procédures peuvent permettre l&#39;identification de protéines importantes d&#39;espèces Burkholderia qui pourraient être impliqués dans la pathogenèse.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7626</td>
 <td>Toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A18-1</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS Buffer</td>
 <td>Bioscience</td>
 <td>R028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP118-500 </td>
 <td>toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass beads (0.1 mm)</td>
 <td>BioSpec Products</td>
 <td>11079101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21009-342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroBCA protein extraction kit</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>23235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-681-375</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-D Clean-Up kit</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6484-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15505-050</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>17-1314-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>856126</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>176002-46</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Duracryl</td>
 <td>Proteomic Solutions</td>
 <td>80-0148</td>
 <td>Very toxic, carcinogen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP179-100</td>
 <td>Flammable, toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15524-010</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP166-500</td>
 <td>Acute toxicity, flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15510-027</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>HC1100-1GL</td>
 <td>Flammable, toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A491-212</td>
 <td>Flammable, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutaraldehyde</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>G151-1</td>
 <td>Very toxic, corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium tetrathionate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2926</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium acetate</td>
 <td>EM Science</td>
 <td>7510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver nitrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>209139</td>
 <td>Corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>252549</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium thiosulfate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S7026</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>EMD</td>
 <td>9230</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>808831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>800688</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A412-4</td>
 <td>Flammable, toxic, health hazard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium carbonate anhydrous</td>
 <td>EMD</td>
 <td>SX0400-3</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral oil</td>
 <td>ACROS</td>
 <td>415080010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JA-20 ultracentrifuge rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>334831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini Beadbeater</td>
 <td>Biospec Products</td>
 <td>3110BX</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6505-03</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6485-27</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

total protein extraction and 2-d gel electrophoresis methods for burkholderia species

L&#39;enquête sur les niveaux de protéines intracellulaires d&#39;espèces bactériennes est importante pour la compréhension des mécanismes pathogènes de maladies causées par ces organismes. Nous décrivons ici un procédé pour l&#39;extraction des protéines à partir de Burkholderia espèces sur la base de la lyse mécanique à l&#39;aide de billes de verre en présence d&#39;acide éthylène-diamine tétra-acétique et de fluorure de phénylméthylsulfonyle dans du tampon phosphate salin. Cette méthode peut être utilisée pour différentes espèces Burkholderia, pour différentes conditions de croissance, et il est probable adapté pour l&#39;utilisation dans des études de protéomique d&#39;autres bactéries. Après l&#39;extraction de la protéine, un (2-D) électrophorèse sur gel technique protéomique deux dimensions est décrit pour étudier les changements mondiaux dans les protéomes de ces organismes. Cette méthode consiste en la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique dans la première dimension, suivie d&#39;une séparation sur la base du poids moléculairepar électrophorèse sur gel d&#39;acrylamide dans la seconde dimension. Visualisation de protéines séparées est effectuée par coloration à l&#39;argent.

L&#39;analyse comparative des profils protéiques extraites de la même culture bactérienne à deux reprises a montré des tendances similaires bandes indiquant les extractions de protéines succès. Protéines de poids moléculaire extraits variaient de 10 à 150 kDa. Montre la figure 1 représentant de Coomassie gel de coloration bleue des extractions de protéines à cellules entières de multivorans Burkholderia (un membre de la BCC) isolats cliniques cultivées en LB ou levure / Manitol (...

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Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Les membres du genre Burkholderia sont des agents pathogènes d&#39;importance clinique. Nous décrivons un procédé pour l&#39;extraction totale de la protéine bactérienne, en utilisant une rupture mécanique, et un gel d&#39;électrophorèse 2D pour l&#39;analyse protéomique ultérieure.

Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espèces

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

total-protein-extraction-2-d-gel-electrophoresis-methods-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

28.9K vues.  University of British Columbia.  Les membres du genre Burkholderia sont des agents pathogènes d'importance clinique. Nous décrivons un procédé pour l'extraction totale de la protéine bactérienne, en utilisant une rupture mécanique, et un gel d'électrophorèse 2D pour l'analyse protéomique ultérieure. 

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A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

Une procédure de 1,5 heure pour l&#39;identification des Enterococcus Espèces directement à partir d&#39;hémocultures

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Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
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A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Surveillance de l&#39;influenza aviaire aux ALE Cartes: méthodes de terrain, la biosécurité et les questions de transport Résolu

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A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocole Chelex simple pour l&#39;extraction d&#39;ADN à partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Procédures d&#39;identification des prions infectieux Après passage dans le système digestif d&#39;une espèce aviaire

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Création et optimisation d&#39;une installation à haut débit pour l&#39;étude<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infection comme un modèle pour la découverte de médicaments

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Protéomique profilage des macrophages par électrophorèse 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

amplification isotherme (LAMP) Essais de boucle médiation pour la détection des espèces spécifiques de<em&gt; Eimeria</em&gt; Qui infectent les poulets

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Méthodes alternatives In Vitro pour la détermination de l’intégrité structurale de la capside virale

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

Mesure automatique de Capsule de Polysaccharide cryptococcique espèces et corps cellulaire

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Dissection multi-signalisation Complexes protéiques par Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...