Financement pour le développement de la pipette d&#39;extraction a été fourni en partie par une recherche interne et de subvention de développement accordé à DRP.

1. Lysis échantillon <ol><li> Les échantillons doivent être sous forme liquide. Si l&#39;échantillon est solide, par exemple l&#39;alimentation ou dans les selles, l&#39;échantillon doit être mis en suspension dans un milieu liquide comme l&#39;eau ou du tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Mélanger 500 ml de l&#39;échantillon avec 500 uL de thiocyanate de guanidine 6M (pH 6,5) dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Enfoncer l&#39;ampoule d&#39;une pipette d&#39;extraction, expulsant l&#39;air ambiant. </li><li> Tirez l&#39;ensemble de 1 ml d&#39;échantillon dans la pipette d&#39;extraction, sur le matériau absorbant, en permettant l&#39;ampoule à s&#39;élargir lentement. </li><li> Inverser l&#39;outil d&#39;extraction tels que les perles absorbantes et de vidange d&#39;échantillon dans l&#39;ampoule. </li><li> Broyer les perles absorbantes avec l&#39;échantillon dans le bulbe en faisant attention de ne pas expulser l&#39;échantillon de la pipette d&#39;extraction. </li></ol> 2. Extraction des acides nucléiques (figure 1, partie A) <ol><li> Inverser la pipette d&#39;extraction (l&#39;ouverture à la baisse) et d&#39;expulser l&#39;échantillon dans le tube de 1,5 ml d&#39;origine. </li> &lt;li&gt; Tirez l&#39;ensemble de 1 ml d&#39;échantillon dans la pipette d&#39;extraction, passant au-dessus du sorbant, à un rythme modéré, en veillant à garder le sorbant dans le cou de la pipette d&#39;extraction. </li><li> Expulser l&#39;ensemble de l&#39;échantillon dans le tube de 1,5 ml en appuyant sur l&#39;ampoule. </li><li> Répétez les étapes 2.2 et 2.3, en passant de l&#39;échantillon au cours des quatre fois plus absorbants pour un total de 5 passes. </li><li> Après le cinquième passage sur le sorbant, expulser l&#39;ensemble 1 ml d&#39;échantillon dans 4 ml de tampon d&#39;extraction de protéines (dans un tube conique de 15 mL), fermer le tube, et mettre de côté pour une utilisation ultérieure. </li><li> Laver les acides nucléiques isolés en faisant passer 1 ml d&#39;éthanol à 95% au cours des trois absorbants fois, en revenant de l&#39;éthanol à son tube d&#39;origine lors du passage final. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.6 en utilisant un second 1 mL, lavage à l&#39;éthanol 95%. </li><li> Appuyez sur et relâchez la poire pendant 5 minutes, en passant de l&#39;air ambiant à travers la pipette d&#39;extraction pour sécher les acides nucléiques ou lit de sorbant. Essuyer éthanol résiduelle de la pointe de l&#39;u d&#39;extraction de pipettechanter une Kimwipe. </li><li> Récupérer les acides nucléiques en passant 250 uL de Tris 10 mM (pH 6,8) au cours des cinq absorbants fois. Le tampon Tris peut être remplacé par n&#39;importe quel autre solution aqueuse appropriée telle que du PBS. La solution qui en résulte contient des acides nucléiques extraits. </li></ol> 3. Extraction des protéines (figure 1, partie B) <ol><li> Mélanger l&#39;échantillon et le tube de tampon d&#39;extraction des protéines de l&#39;étape 2.5 par l&#39;inversion et de passer environ deux à trois millilitres de cet échantillon 5 ml sur le sorbant d&#39;une pipette nouvelle extraction. </li><li> Expulser l&#39;ensemble de l&#39;échantillon dans le même tube conique de 15 ml en veillant à garder le sorbant dans le cou de la pipette d&#39;extraction. </li><li> Répétez les étapes 3.1 et 3.2, en passant de l&#39;échantillon au cours des 15 absorbants fois. </li><li> Laver le sorbant et la protéine liée par passage 1 ml d&#39;éthanol à 95% sur le lit de sorbant trois fois, l&#39;éjection d&#39;éthanol dans son tube d&#39;origine. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.4 en utilisant un second 1 mL, lavage à l&#39;éthanol 95%. </li><html><li> Appuyez sur et relâchez la poire pendant 5 minutes, en passant de l&#39;air ambiant à travers la pipette d&#39;extraction pour sécher la protéine / lit de sorbant. Essuyer éthanol résiduelle de la pointe de la pipette d&#39;extraction en utilisant un Kimwipe. </li><li> Récupérer la protéine en passant 250 l de PBS au cours des cinq absorbants fois. Le tampon peut être remplacé par n&#39;importe quel autre solution aqueuse appropriée telle que 10 mM de Tris (pH 6,8). La solution résultante contient de la teneur en protéines de l&#39;échantillon. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="Figure 1A" /> Figure 1. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. contenu &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5.

<ol>
	<li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries,+1984-2005.">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li><li>Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+Pipette.">Extraction Pipette.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample.">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli.">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li><li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea.">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li><li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain.">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li><li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages.">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes.">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Les outils, chimies et le protocole décrit dans ce rapport représentent le premier exemple connu d&#39;une électricité gratuite, système d&#39;extraction multi-macromolécule qui peut être utilisé dans le terrain, les points de soins applications. Les deux types de macromolécules peut être appliqué à un certain nombre de dispositifs de diagnostic en aval ou analytique. Par exemple, les acides nucléiques isolés sont de qualité PCR (figures 2 et 3) tandis que le composant protéine de l&#39;échantillon est immunoréactif (figure 4). L&#39;utilisation de ce système d&#39;extraction ou d&#39;une ressource dans austères des zones limitées du monde pourrait réduire considérablement le fardeau de la maladie sur les populations qui y vivent. Ce système d&#39;extraction pourrait aussi aider dans les programmes de surveillance des maladies à travers le monde en fournissant une méthode robuste et rapide et rentable pour le traitement des échantillons dans des endroits austères ou à distance. Un aspect important de la méthode d&#39;extraction décrite ci-dessus, c&#39;est queelle peut être modifiée par l&#39;utilisateur. Par exemple, dans les cas où la taille de l&#39;échantillon est plus ou moins que les 500 premiers μLs (étape 1.2), l&#39;utilisateur peut ajuster les volumes des réactifs en conséquence. Autrement dit, le rapport volumétrique des réactifs à la taille de l&#39;échantillon doit rester constante, tandis que les volumes en chiffres absolus peuvent être modifiés. En outre, les ajustements du nombre de passages sur le sorbant peut également être faite à la discrétion de l&#39;utilisateur. Par exemple, si un plus grand volume d&#39;échantillon est utilisé, en passant de l&#39;échantillon au cours des temps plus absorbants que celles énumérées (étapes 2.4 et 3.3) va augmenter la probabilité du type macromolécule (acide nucléique ou protéine) en contact avec le sorbant. L&#39;augmentation des passages devrait augmenter l&#39;efficacité de captage jusqu&#39;à saturation sorbant est atteint. Nous avons constaté que l&#39;outil d&#39;extraction et de la chimie associés ont quelques limitations, dont la plus importante de ce qui est que la chimie d&#39;extraction des protéines est inefficace pour la récupération de fortement glycosyléeprotéines. Dans le cas où le diagnostic aval cible une protéine glycosylée, ce système peut ne pas être idéal pour l&#39;identification. En outre, les limites supérieures et inférieures de l&#39;efficacité d&#39;extraction soit pour les acides nucléiques ou des protéines sont encore à déterminer, et d&#39;optimisation est en cours afin de maximiser l&#39;efficacité de récupération. Poursuite de l&#39;élaboration de l&#39;outil permettra de surmonter ces lacunes dans les connaissances actuelles.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Guanidine Thiocyanate </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> l&#39;éthanol </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> Le 2-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 109827-1L </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> Une-4503 </td></tr></tbody></table>

electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation

Pathogènes traditionnels et émergents, tels que Escherichia coli entérohémorragique (EHEC), Yersinia pestis, ou prion à base de maladies sont une préoccupation importante pour les gouvernements, les industries et professionnels de la santé à travers le monde. Par exemple, EHECs, combinées avec Shigella, sont responsables de la mort d&#39;environ 325 000 enfants chaque année et sont particulièrement répandues dans le monde en développement où le laboratoire basée sur l&#39;identification, commune aux États-Unis, n&#39;est pas disponible 1. Le développement et la distribution de faible coût, sur le terrain, les points de soins des outils pour aider à l&#39;identification rapide et / ou le diagnostic d&#39;agents pathogènes ou des marqueurs de maladies pourrait modifier radicalement progression de la maladie et le pronostic du patient. Nous avons développé un outil pour isoler des acides nucléiques et des protéines à partir d&#39;un échantillon par extraction en phase solide (SPE), sans électricité ni matériel de laboratoire associé 2. Les macromolécules isolées peuvent être utilisés pour diagnosticsis soit dans un laboratoire de l&#39;avant ou à l&#39;aide sur le terrain au point de plates-formes de soins. Surtout, cette méthode fournit pour la comparaison directe d&#39;acides nucléiques et de protéines de données à partir d&#39;un échantillon non-scission, offrant un niveau de confiance par le biais de corroboration de l&#39;analyse génomique et protéomique. Nos outil isolement utilise la norme industrielle en phase solide pour l&#39;isolement d&#39;acide nucléique, la technologie BOOM, qui isole les acides nucléiques à partir d&#39;une solution de sel chaotropique, généralement isothiocyanate de guanidine, en se liant à base de silice ou des filtres particules 3. CUBRC de chimie exclusive d&#39;extraction en phase solide est utilisé pour purifier la protéine à partir de solutions salines chaotropes, dans ce cas, les déchets ou les flux de-thru suite à l&#39;isolement d&#39;acide nucléique 4. En emballage bien caractérisé chimies dans une petite plate-forme, simple et peu coûteuse, nous avons généré un système portable pour l&#39;extraction des acides nucléiques et des protéines qui peut être effectuée en vertu d&#39;une variety de conditions. Les acides nucléiques isolés sont stables et peuvent être transportés à un poste où le pouvoir est disponible pour l&#39;amplification PCR alors que la teneur en protéines peuvent être immédiatement analysé par main levée ou d&#39;autres tests basés sur immunologique. L&#39;identification rapide des marqueurs de maladies dans le domaine pourrait modifier sensiblement les résultats du patient en dirigeant le bon déroulement du traitement à un stade précoce de la progression de la maladie. L&#39;outil et la méthode décrite conviennent pour une utilisation avec n&#39;importe quel agent infectieux et offrir à l&#39;utilisateur la redondance des analyses de type multi-macromolécule tout en réduisant leur fardeau logistique.

Isolement d&#39;acide nucléique: des acides nucléiques isolés sont PCR amplifiable et libre de toute contamination de protéines. Exemple 1: Les acides nucléiques sont récupérés peut être utilisé dans des applications basées sur la PCR. Par exemple, la figure 2 montre l&#39;amplification de gènes de la toxine shiga associés à entérohémorragique E. coli O157: H7 EDL-933 (ATCC # 35150) à partir d&#39;une procédure d&#39;extraction d&#39;acide / protéine nucléique à l&#39;aide de la pipette d&#39;extraction. Les gènes de la toxine shiga stx 1 et stx 2 sont disponibles sur tempérée lambda-comme les bactériophages et défectueux dans ce bactériophage et autres entérohémorragique E. souches de E. sous le contrôle du promoteur P R 5 6 7 8. L&#39;activation de la réponse SOS dans E. coli conduit à prophage induction et / ou de la toxine de production 9. Nous avons utilisé une version modifiée de l&#39;essai multiplex PCR par Feng et al. 11 pour déterminer le stx 1 et stx 2 gènes à la fois dans la culture et des échantillons d&#39;eaux usées à pointes. Colonnes A et B dans la figure 2 montrent les résultats d&#39;une amplification par PCR d&#39;un échantillon de culture non transformées (voie A) et un échantillon de culture traitée (voie B). Ces résultats sont pratiquement identiques sens il n&#39;ya pas de perte de fidélité dans les acides nucléiques isolée ou transformés. Nous avons ensuite amplifié à pointes eaux d&#39;égout brutes (colonne D) ou des acides nucléiques isolés à partir des eaux usées à pointes (voies E &amp; F). Ces données indiquent que les acides nucléiques isolés abouti à une plus grande amplification par rapport aux acides nucléiques isolés non à partir d&#39;échantillons d&#39;eaux usées à pointes. Nous concluons donc que soit inhibiteurs de la PCR naturellement présents dans les eaux usées ont été enlevés lors de l&#39;isolement ou que les acides nucléiques ont été concentrées sur l&#39;isolement. Une combinaison de ces deux hypothèses est également possible. Spectroscopie dans l&#39;ultraviolet a ensuite été utilisé pour montrer que les acides nucléiques isolés étaient relativement libres oprotéines f contamination. La figure 3 montre les spectres UV de deux E. coli O157: H7 nucléique extractions acide, l&#39;isolement marqué a et b isolement, par rapport au spectre normalisé de la culture bactérienne, marqué pré-isolement. Le spectre UV des acides nucléiques isolés ressemble les spectres de purs des acides nucléiques, ayant un rapport calculé de l&#39;absorbance entre 260 nm et 280 nm qui approchent 1,8 10. Ces données montrent qu&#39;il ya très peu de protéine contaminante dans la fraction d&#39;acide nucléique récupéré en utilisant la technique décrite. L&#39;isolement des protéines: les protéines récupérées de l&#39;expérience d&#39;isolement d&#39;acide / protéine nucléique est immunoréactif et électrophorèse identique à la protéine pure. Exemple 2: La fraction de protéine isolée a été appliqué à l&#39;E. RapidChek coli O157 latérales des bandes d&#39;essai d&#39;écoulement (SDIX, Inc.) Contrôles montrent une identification positive dans tous les échantillons hébergeant E. coli<html> O157, avec ou sans induction STX (Figure 4, les voies B et C, respectivement). Les données de la figure 4 montrent aussi des résultats positifs pour les échantillons hébergeant E. coli O157 qui ont été traitées pour les acides nucléiques et de protéines, puis à l&#39;aide de la pipette d&#39;extraction. Ces données montrent que la protéine isolée à partir de chaque échantillon est immunoréactif déclenchant ainsi une réponse positive. Amplification par PCR (tel que décrit dans l&#39;exemple 1) a été effectuée sur les échantillons de protéines pour montrer que la fraction protéique isolée était dépourvue d&#39;acides nucléiques contaminants. Les résultats de ces expériences étaient tous négatifs par électrophorèse sur gel. Ainsi, nous concluons que la teneur en protéines de l&#39;échantillon a été séparé de contaminer les acides nucléiques. Ces résultats, pris dans son ensemble à celles décrites pour le spectacle étape d&#39;acide nucléique isolée que les acides nucléiques et en protéines sont isolés dans différentes étapes de fractionnement. t &quot;&gt; Exemple 3:. La protéine isolée est adapté pour l&#39;électrophorèse 10 Figure 5 représente une coomassie colorée gel d&#39;acrylamide 8% chargé avec de la BSA (Figure 5, les voies A et C) et de la BSA isolé de 6M isothiocyanate de guanidine en utilisant l&#39;extraction et la pipette associé protocole. La mobilité électrophorétique de la protéine isolée est identique à celle des échantillons de contrôle. Nous concluons donc que le processus d&#39;extraction ne modifie pas la structure covalente de la protéine isolée. <img alt="Figure 1a" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> Figure 1, Groupe A: Représentation d&#39;une procédure de type extraction d&#39;acide nucléique L&#39;échantillon est mélangé avec 6M de thiocyanate de guanidine dans le tube d&#39;échantillon et passé au cours des cinq absorbants fois.. Après le dernier passage, l&#39;échantillon est ajouté à la mémoire tampon d&#39;extraction de protéines. Les acides nucléiques sorbant et lié sont lavées deux fois avec de l&#39;éthanol. L&#39;échantillon est alors l&#39;air dRied et éluée à partir du sorbant. <img alt="Figure 1b" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> Figure 1, Groupe B: Représentation d&#39;une procédure d&#39;extraction des protéines typiques L&#39;échantillon mélangé avec du tampon de l&#39;isolement des protéines à partir de l&#39;étape 1, Figure 1, partie A est passé sur le sorbant d&#39;une pipette seconde extraction 15 fois.. Le reste de la procédure est identique à celle du protocole d&#39;extraction d&#39;acide nucléique. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> Figure 2:. Image négative d&#39;un bromure d&#39;éthidium gel d&#39;agarose coloré multiplexé toxine de Shiga 1 et 2 l&#39;expérience d&#39;amplification génique a été réalisée en utilisant des échantillons de culture (voies A et B) ou des échantillons d&#39;eaux usées brutes dopés avec E. coli O157: H7 (voies D, E et F). Les échantillons ont été soit directement ajoutés à un tube de réaction PCR (voies A et D) ou les échantillons ont été traités à l&#39;aide des procès d&#39;isolements et les acides nucléiques extraits ont été ajoutés au tube de réaction PCR (échantillons B, E et F). Le protocole de PCR est une modification de celle qui est décrite par Feng et al 11. Notre modification ciblée seulement ceux amplifié par le stx 1 (bande inférieure) et stx 2 (bande supérieure) paires d&#39;amorces, l&#39;abandon de toutes les paires d&#39;amorces d&#39;autres. Lane C est l&#39;échelle 1Ko de BioRad. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> Figure 3: résultats de spectroscopie UV de E. coli O157: H7 acides nucléiques isolés à l&#39;aide de la pipette d&#39;extraction ont rapporté les acides nucléiques isolés sont marqués d&#39;isolement b isolement a et.. Le spectre UV de l&#39;échantillon a également été testée avant l&#39;extraction des acides nucléiques et est étiqueté pré-isolement. Les spectres ont été obtenus en utilisant un spectrophotomètre Hitachi U3010 et un logiciel associé. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt; Figure 4:. Photo couleur de bandelettes de test RapidChek La teneur en protéines des échantillons utilisés dans la figure 2 a été isolé à l&#39;aide de la pipette d&#39;extraction et testés pour l&#39;immuno-réactivité par un test d&#39;écoulement latéral. Lanes AC sont des contrôles non traités, qui est, de culture cellulaire a été ajouté à la bandelette de test sans acide nucléique ou l&#39;extraction des protéines. Lane A est E. coli BL21 pLysS de3 comme un contrôle négatif, Lanes B et C montrent E. coli O157: H7 qui a été traitée (B), ou traitées à la mitomycine C pendant 4 heures (C). Lanes D à H montrent les résultats de l&#39;ajout de la protéine extraite des bandes latérales des essais de débit. Lanes D et E ont été sondés à l&#39;aide extrait de protéine de E. coli BL21 DE3 pLysS soit sans (D) ou à la mitomycine C traitement (E) comme témoins négatifs. Lanes FH montrent les résultats lors de l&#39;extraction des protéines de E. coli O157: H7 a été utilisé. Protéine a été extrait de non traitée (F), ou de 2 heures (G) ou 4 heures (H) mitomycine C cultures traitées.Les résultats positifs de produire une double ligne rouge. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> Figure 5:. Photographie d&#39;un teint de Coomassie SDS-PAGE BSA a été isolé de la solution en utilisant la pipette d&#39;extraction et de protocoles décrits. Colonnes A et C sont des files de contrôle de 250 pg / mL et 500 pg / mL, respectivement. Colonnes B et D représentent BSA récupéré à partir de solutions contenant les mêmes concentrations que leurs témoins respectifs.

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Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Un outil et chimiques sont décrits pour séquentiellement isoler des acides nucléiques suivie par les protéines d&#39;un échantillon sans la nécessité de l&#39;électricité. L&#39;outil se compose d&#39;un sorbant lieu au sein d&#39;une pipette de transfert, tandis que les chimies d&#39;isolement sont basées sur des principes d&#39;extraction en phase solide. Les macromolécules isolées peuvent être analysées par des tests immuno-base et basée sur la PCR.

Electricité-libre, l&#39;acide nucléique et séquentielle isolement des protéines

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

electricity-free-sequential-nucleic-acid-and-protein-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K vues.  CUBRC, Inc.. Un outil et chimiques sont décrits pour séquentiellement isoler des acides nucléiques suivie par les protéines d'un échantillon sans la nécessité de l'électricité. L'outil se compose d'un sorbant lieu au sein d'une pipette de transfert, tandis que les chimies d'isolement sont basées sur des principes d'extraction en phase solide. Les macromolécules isolées peuvent être analysées par des tests immuno-base et basée sur la PCR.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

D&#39;analyser et de structures d&#39;acides nucléiques avec 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Protein Isolation du développement embryonnaire Souris Coeur Région Valve

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Étiquetage spécifique de la séquence des acides nucléiques et des protéines avec Methyltransferases et le cofacteur Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Lecture simple de vrac numériques acide nucléique quantification dosages

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

L&#39;extraction d&#39;acide nucléique et efficace de l&#39;ARNr 16S bactérien pour Séquençage génique communautaire Caractérisation

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...