Ce travail a été soutenu par le NIH / NHLBI subvention R01 HL082689 à Scott I. Simon et Anthony G. Passerini.

1. Culture cellulaire et de préparation des supports <ol><li> Couper 3-pouces substrats circulaires à partir d&#39;un 100 x 20 mm boîte de culture de tissus (BD Falcon) en utilisant un tour. Stériliser substrats par immersion dans l&#39;éthanol à 70%. Placer dans une boîte de Pétri et les enrober de 4 ml collagène de type I (100 pg / ml) pendant 1 h à température ambiante, puis rincer avec 4 ml de PBS 1 x. </li><li> Suspendre les cellules endothéliales aortiques humaines (HAEC, le passage 4-6) à 6.5x10 5 cellules / ml et des semences en appliquant 1 ml directement sur ​​le substrat. Placer dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur et permettent aux cellules d&#39;adhérer au substrat pendant 1 heure. </li><li> Ajouter 9 ml de croissance de l&#39;endothélium moyen-2 (EGM-2) complétée avec 1x antibiotiques antimycosiques solution aux cellules. Changer les médias tous les 2 jours jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent 90% de confluence. </li><li> Maintenir cellules THP-1 en milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS et 1x antibiotiques antimycosiques solution. Au passage des cellules quand elles atteignent une densité de 10 6 cellules / ml. </li></ol> 2. Protocole Shearing portable Les cellules sont conditionnés dans une mesure cône-plaque de dispositif de cisaillement cellulaire (CDD). Indications sur l&#39;appareil et les spécifications de conception sont documentées dans le tableau 1 et figure 4. <ol><li> Préparer la CDD. Stériliser le boîtier de la chambre avec de l&#39;éthanol et rincer avec du PBS stérile. Chauffer le boîtier à 37 ° C et le niveau de sorte que le cône est perpendiculaire à la monocouche de cellules. Assembler le substrat avec les cellules à partir du fond du boîtier et définir le cône à la hauteur désirée. </li><li> Utilisation Leibovitz-15 (L-15) un milieu supplémenté avec BulletKit endothéliale que le milieu de cisaillement pour maintenir le pH approprié en l&#39;absence de CO 2. Pour stimuler l&#39;inflammation, ajouter facteur de nécrose tumorale α-(TNF-α, 0,5 ng / ml) dans le milieu de cisaillement et d&#39;injecter 6 ml dans le dispositif par l&#39;intermédiaire d&#39;une seringue reliée à un orifice d&#39;entrée, en prenant soin de ne pas introduire de l&#39;airbulles dans la chambre. </li><li> Cellules de cisaillement à une contrainte de cisaillement de forte magnitude constante (HSS, 15 dyne / cm 2) ou une contrainte de cisaillement oscillatoire (OSS, 0 ± 5 dynes / cm 2, 1 Hz) pendant 4 heures. Le SS désiré est obtenu en faisant tourner le cône au-dessus des cellules, qui est contrôlée avec précision avec un moteur micro-pas à pas, comme décrit précédemment 6 Le SS mur à la surface (τ w) est approchée par.: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> où μ est la viscosité du milieu, ω est la vitesse angulaire du cône, et α est l&#39;angle de cône (0,5 °). L&#39;alignement du substrat avec une membrane est ajustée à l&#39;intérieur 0,05 ° par nivellement de précision et la hauteur d&#39;écartement fixé à 20 ± 10 um moyen d&#39;une jauge de profondeur pour minimiser la variation circonférentielle et radiale dans τ w. Le dispositif a été validé pour garantir les caractéristiques d&#39;écoulement laminaire. Retirer caunes de l&#39;appareil et se préparer pour l&#39;analyse de l&#39;adhésion des monocytes. </li></ol> 3. Fabrication de PDMS Microfluidique Chambre <ol><li> Obtenir moule maître pour le numéro de canal désiré microfluidique et la hauteur de canal en fonction de l&#39;application. Les caractéristiques de la conception spécifique utilisé dans ce protocole sont détaillées dans le tableau 1. La méthode pour créer ceux-ci est déjà bien documenté dans la littérature 1. En bref, le réseau de canaux a été conçu en utilisant le logiciel de CAO (Autodesk Inventor) et imprimé à 5000 dpi sur un transparent. Photorésist négatif (SU8) est filée sur une plaquette de silicium jusqu&#39;à une épaisseur de 100 microns. La transparence est recouverte et exposée à la lumière UV. Non-polymérisé de photorésist est éliminé pour générer le maître réplique positif. </li><li> Pour faire une solution PDMS mélange à base de silicone avec du silicone agent de durcissement 10:1 en poids dans un bateau peser et mélanger avec une pipette 5 ml sérologique. Veillez à ne pas racler les paroisBateau de la pesée de ne pas ajouter flocons de plastique à la solution. </li><li> Placer la galette maître dans un plat 100x15mm Petri et versez la solution PDMS dans le plat. </li><li> Couvrir le plat et le placer dans un récipient vide pendant 15 minutes pour éliminer les bulles. Après 15 minutes de prendre la boîte de Petri et enlever les bulles excès par soufflage d&#39;air doucement sur la surface. </li><li> Placez la boîte de Petri dans un four pendant 1 heure à 70 ° C. Retirer le plat et découpez les chambres microfluidiques à l&#39;aide d&#39;une lame tranchante. </li></ol> 4. Assemblée des périphériques sur Microscope <ol><li> Tournez sur la source de lumière pour microscope inversé et mis en chauffe à 37 ° C. Fixer le tube à une seringue de 10 ml et remplir d&#39;eau distillée de sorte qu&#39;il n&#39;y ait pas de bulles. Placez la seringue dans le pousse-seringue et le débit ensemble pour induire un SS de paroi de 1 dyne / cm 2. La contrainte de cisaillement de paroi (τ w) générés le long de la ligne médiane du canal est approchée en utilisant la normeéquation pour une chambre d&#39;écoulement à plaques parallèles: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="L&#39;équation 2" /> où μ est la viscosité du milieu, Q est le débit volumétrique, h est la hauteur du canal, et w est la largeur de canal note:. depuis les canaux sont de largeur finie de la réelle τ w varie avec w en fonction du canal rapport d&#39;aspect, et les mesures sont évités à 25% plus proche des parois latérales. 1,7 </li><li> Placez PDMS chambre dans l&#39;eau et utiliser une micropipette 100 pi pour éliminer l&#39;air à partir des canaux individuels. Fixer l&#39;adaptateur à vide à la chambre de faire en sorte que la vanne est mise hors service. </li><li> Placez boîte de Pétri avec monocouche OAB sur l&#39;objectif. Placez la chambre PDMS sur la boîte de Pétri et mettez sur la monocouche OAB, tout en assurant qu&#39;aucune bulle d&#39;air se forment entre l&#39;appareil et la monocouche. Tournez la vanne de sorte que le vide est en marche et la chambre est fermement attaché. </li&gt; <li> Couper 19 aiguille de calibre émousser telle qu&#39;il n&#39;y a qu&#39;un 5 mm de gauche métallique. Remplissez le réservoir en plastique avec un tampon et de mettre en PDMS chambre d&#39;entrée. Répétez l&#39;opération pour un nombre approprié de canaux qui seront utilisés. Fixer le tube de pompes à seringues pour PDMS exits de canal. </li></ol> 5. Essai d&#39;adhérence des monocytes sous contrainte de cisaillement <ol><li> Suspendre cellules THP-1 à 2x10 6 cellules / ml dans du HBSS + Ca 2 + / Mg 2 + HSA + 0,1%. Activer cellules THP-1 par l&#39;incubation avec le facteur-1 dérivé stromal (SDF-1, 50 pg / ml) pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Activer la pompe à seringue pour établir un flux, puis ajouter 50 ul de la suspension cellulaire au réservoir sans introduire de bulles d&#39;air. Une fois le débit est pleinement développé, commencez d&#39;acquisition de données. </li><li> Course à 5 min à un débit approprié, ajout d&#39;un tampon dans le réservoir si la solution est faible. Continuer coule dans les canaux mémoire tampon pour laver toutes les cellules non liées dans le flux. </li></ol> 6. Acquisition et analyse des données <ol><li> Acquérir des séquences d&#39;images numériques à 3 images / s pendant 2 min à la suite d&#39;écoulement entièrement développé le long de l&#39;axe longitudinal du canal à 3 endroits dans le canal, en prenant soin de ne pas enregistrer immédiatement après l&#39;entrée ou avant des orifices de sortie ou dans les 25% plus proche du côté murs. </li><li> Comptez le nombre de cellules arrêtées par champ en identifiant leur phase brillante apparition dans le même plan focal que la monocouche. </li><li> Arrestation cellule ferme est définie par le mouvement &lt;diamètre des cellules ½ en 10 s. Les données moyennes de plus de 3 champs aléatoires / canal et de quantifier l&#39;aide du logiciel ImageJ. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Bien que l&#39;endothélium vasculaire est uniformément exposée à des agonistes qui contribuent à l&#39;inflammation systémique, l&#39;athérosclérose est une maladie focale qui se développe préférentiellement sur ​​les sites de perturbation de débit dans les artères, impliquant l&#39;hétérogénéité spatiale de la fonction endothéliale. 8 </sup&gt; circulants médiateurs inflammatoires tels que le TNF-α sont élevés dans le sérum humain en situation de stress métabolique et en corrélation avec la fonction endothéliale altérée. 9, 10 TNF-α induit une réponse bien caractérisé en CE qui inclut la régulation positive de molécules d&#39;adhésion cellulaire (CAM ; par exemple de VCAM-1, ICAM-1, E-sélectine) et des chimiokines qui recrutent les monocytes de la circulation, une caractéristique de la lésion athéroscléreuse début 11 Hémodynamique est un régulateur important de phénotype inflammatoire endothéliale 12 niveau élevé de stress de cisaillement ampleur (HSS..; p.ex. 15 dynes / cm 2) ou des contraintes de cisaillement pulsatile (PSS; par exemple 15 ± 5 dynes / cm 2) associé à des sites de résistance à l&#39;athérosclérose dans les artères réguler à la baisse du TNF-α-réponses induites. A l&#39;inverse, faible niveau de stress de cisaillement grandeur (LSS; par exemple 2 dynes / cm 2) ou de cisaillement oscillatoire (OSS; par exemple, 0 ± 5 dynes / cm 2), les caractéristiques des sites sensibles in vivo, exacerbent cytokine l&#39;inflammation induite par. 13, 14 microfluidiques Nos appareils PDMS fournir une plateforme pour la réalisation d&#39;études mécanistiques de tester des hypothèses liées à la superposition de stress métabolique avec des facteurs hydrodynamiques dans la régulation de la fonction endothéliale et de la pathologie. L&#39;utilité et la polyvalence de l&#39;approche est largement illustré par les résultats représentatifs suivants. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. La contrainte de cisaillement module différentiellement adhérence THP-1 de cellules au TNF-alpha enflammées monocouches endothéliales. Ces données ont été acquises en utilisant le protocole détaillé ci-dessus décrit et documenté dans la vidéo. Monocouches OAB ont été simultanément exposés à une faible dose de la cytokine inflammatoire TNF-α (0,5 ng / ml, ~ CE 50 pour VCAM-1 up-régulation) et soit HSS (15 dynes / cm 2) ou OSS (0 ± 5 dynes / cm 2, 1 Hz) dans un CDD personnalisé pendant 4 heures comme descrilit dans le protocole détaillé. THP-1 arrestation cellules a été quantifiée dans un écoulement de cisaillement dans une chambre d&#39;écoulement PDMS. Cette lignée cellulaire qui imite le phénotype des monocytes humains a été choisi pour sa reproductibilité et sa facilité d&#39;utilisation. HSS atténué la réponse inflammatoire par rapport à l&#39;OSS, ayant entraîné un arrêt des cellules THP-1 a diminué. Les données ont été analysées par Student-test et sont représentées en moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. Adapté avec la permission de DeVerse et al. 5 Les données suivantes démontrent la polyvalence de notre approche en utilisant des exemples de notre travail publié. Départs à partir du protocole ci-dessus sont indiquées le cas échéant. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. La modulation de cytokine induite par l&#39;expression de VCAM-1 et le recrutement des monocytes dans un gradient de contrainte de cisaillement. A) monocouches OAB ont été stimulées par le TNF-α (0,3 ng / ml) pendant 4 heures sous flow dans un VMMC conçue sur la base de la théorie d&#39;écoulement de Hele-Shaw. 15 A diminution linéaire de grandeur SS le long de la ligne médiane du canal a été obtenue en concevant les parois latérales de la chambre de manière à coïncider avec les lignes de courant d&#39;un flux à deux dimensions et la stagnation de mise en forme l&#39;extrémité du canal pour correspondre aux lignes d&#39;iso-potentiels. La contrainte de cisaillement de paroi (τ w) générés le long de la ligne centrale de ce canal à une distance axiale de l&#39;entrée (x) est donnée par: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="L&#39;équation 3" /> où μ est la viscosité du milieu, Q est le débit volumétrique, h est la hauteur du canal, w 1 est la largeur de canal d&#39;entrée, et L est la longueur totale du canal. Q est choisi pour générer un gradient de grandeur SS de 16 dynes / cm 2 à l&#39;entrée à 0 au point de stagnation &quot;a&quot; juste en amont de l&#39;outlet. B) à C) l&#39;expression de VCAM-1 a été mesurée in situ par immunofluorescence en utilisant des anticorps conjugués à des points quantiques et présenté comme intensité de la fluorescence pourcentage médian (MFI) de contrôle statique non stimulé. SS n&#39;a pas de moduler le niveau basal de VCAM-1, qui est faible en non stimulées OAB (triangles gris). Toutefois, l&#39;expression de VCAM-1 a augmenté par rapport au TNF-α à des amplitudes LSS, avec un pic à ~ 2 dynes/cm2 et le retour à la ligne de base du TNF-α ou au-dessous des magnitudes de cisaillement&gt; 5 dynes / cm 2 (carrés noirs). D) monocytes (10 6 / ml) ont été perfusés à 2 dynes/cm2 pendant 5 min dans des canaux d&#39;écoulement parallèles sur des monocouches préconditionnés comme dans A). Le recrutement des monocytes à l&#39;endothélium quantitativement corrélée à la VCAM-1 &#39;expression d&#39;une magnitude contrainte de cisaillement donné. Notamment, la capacité de sonder l&#39;expression de VCAM-1 et le recrutement des monocytes avec une résolution spatiale fine dans un monolayer ont révélé des changements significatifs au cours d&#39;une gamme étroite de grandeur SS qui ne seraient pas appréciés en appliquant seulement quelques valeurs discrètes de cisaillement dans des expériences séparées. Les données ont été analysées par ANOVA mesures répétées et les différences évaluées par post-test de Newman-Keuls, * P &lt;0,05 à partir de TNF-α dans des conditions statiques. Les données sont la moyenne ± SEM de 3-6 expériences indépendantes. Adapté avec la permission de Tsou et al. 2 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Lipoprotéines riches en triglycérides (TGRL) moduler l&#39;inflammation induite par les cytokines en proportion à des niveaux de triglycérides sériques et donateurs de VCAM-1 expression. Monocouches OAB ont été stimulées par le TNF-α (0,3 ng / ml) pendant 4 heures en même temps que TGRL (10 mg / dl ApoB) isolés à partir des sujets humains après un repas riche en graisses en culture statique. A) l&#39;expression de VCAM-1 a été mesurée séparément dans suspendue CE par cytométrie en fluxet l&#39;adhésion des monocytes quantifiée en utilisant un VMMC tel que décrit dans le protocole détaillé. Les données sont présentées comme variation en% par le TNF-α. Arrestation des monocytes varié en proportion directe de l&#39;endothélium expression de VCAM-1, qui a augmenté directement avec le niveau de triglycérides de sérum de donneur. B) L&#39;arrestation des monocytes pour un sous-ensemble de pro-inflammatoires donneurs a été abrogée en la présence d&#39;un VCAM-1 anticorps bloquant. La signification a été déterminée par jumelé t de Student-test, des moyens ± SEM de 3-5 expériences indépendantes. Adapté avec la permission de Wang et al. 4

<ol>
	<li>Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+mimetics+based+on+microfluidics+for+imaging+the+leukocyte--endothelial+inflammatory+response.">Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response.</a> Lab Chip. 7, 448-456 (2007).</li><li>Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+inflammation+by+human+aortic+endothelial+cells+in+a+linear+gradient+of+shear+stress.">Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress.</a> Microcirculation. 15, 311-323 (2008).</li><li>Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride-rich+lipoproteins+prime+aortic+endothelium+for+an+enhanced+inflammatory+response+to+tumor+necrosis+factor-alpha.">Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha.</a> Circ. Res. 100, 381-390 (2007).</li><li>Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+inflammation+correlates+with+subject+triglycerides+and+waist+size+after+a+high-fat+meal.">Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).</li><li>Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+modulates+rage-mediated+inflammation+in+a+model+of+diabetes-induced+metabolic+stress.">Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).</li><li>Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endothelial+phenotypes+evoked+by+arterial+waveforms+derived+from+atherosclerosis-susceptible+and+-resistant+regions+of+human+vasculature.">Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).</li><li>Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+adhesion+of+vascular+and+valvular+endothelial+cells+in+microfluidic+channels.">Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).</li><li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+associated+with+regional+athero-susceptibility+and+adaptation+to+disturbed+blood+flow+in+vivo.">Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo.</a> Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).</li><li>Burdge, G. C., Calder, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+response+during+the+postprandial+period:+A+potential+causal+process+in+vascular+disease.">Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease.</a> Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).</li><li>Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+metabolic+disorders.">Inflammation and metabolic disorders.</a> Nature. 444, 860-867 (2006).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+atherosclerosis.">Inflammation in atherosclerosis.</a> Nature. 420, 868-874 (2002).</li><li>Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+shear+stress+and+atherosclerosis:+A+matter+of+site+specificity.">Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity.</a> Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).</li><li>Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+increases+icam-1+and+decreases+vcam-1+and+e-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-[alpha]+in+endothelial+cells.">Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).</li><li>Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells.">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).</li><li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber.">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).</li><li>Helmke, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+cytoskeletal+mechanics+by+hemodynamic+forces.">Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces.</a> Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).</li><li>Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd11c/cd18+expression+is+upregulated+on+blood+monocytes+during+hypertriglyceridemia+and+enhances+adhesion+to+vascular+cell+adhesion+molecule-1.">Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).</li><li>Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+cd11c++monocytes+in+atherogenesis+associated+with+hypercholesterolemia.">Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia.</a> Circulation. 119, 2708-2717 (2009).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous décrivons l&#39;utilisation de dispositifs microfluidiques en PDMS pour l&#39;évaluation sur la puce du phénotype inflammatoire endothéliale par le biais de l&#39;imagerie en temps réel de l&#39;expression CAM et l&#39;adhésion des monocytes. Un avantage majeur de notre approche réside dans la capacité à quantifier les résultats associés à une dysfonction endothéliale dans les cellules exposées à des médiateurs inflammatoires tels que les lipides alimentaires et des cytokines dans des conditions hyd...

<table border="1"><tbody><tr><td> Point </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 100 x 20mm boîtes de Pétri </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Éthanol à 95% </td><td> EMD Chemicals </td><td> EX0290-1 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Collagène de type I Rat Tail dérivé </td><td> Gibco </td><td> A10483-01 </td></tr><tr><td> L&#39;homme les cellules endothéliales aortiques </td><td> Genlantis </td><td> PH30405A </td></tr><tr><td> Antibiotiques antimycosique Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> BulletKit endothéliale </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Endothéliales basales médias-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> 10 Seringues ml </td><td> BD Falcon </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Tubes en polyuréthane </td><td> Tygon </td><td> ABW0001 </td></tr><tr><td> Leibovitz-15 avec les médias </td><td> Gibco </td><td> 11415-069 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 base d&#39;élastomère de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Durcisseur silicone élastomère </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> SU8 Wafer Maître Photoresist </td><td> UC Davis Pan Lab </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Eclipse TE200 microscope inversé </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE200 </td></tr><tr><td> Pousse-seringue </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD2000 </td></tr><tr><td> 19 aiguille hypodermique jauge </td><td> Kendall </td><td> 8881 </td></tr><tr><td> THP-1 lignée de cellules monocytaires </td><td> ATCC </td><td> TIB-202 </td></tr><tr><td> HBSS (Hanks solution saline tamponnée) avec le Ca 2 + / Mg 2 + </td><td&gt; Gibco </td><td> 14025-092 </td></tr><tr><td> Facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> Stromale facteur dérivé - 1 (SDF-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 350-NS-010 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040-CV </td></tr><tr><td> Albumine sérique humaine (HSA) </td><td> ZLB Behring </td><td> NDC 0053-7680-32 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques.

on-chip endothelial inflammatory phenotyping

Athérogénèse est potentialisée par des anomalies métaboliques qui contribuent à un état d&#39;inflammation systémique résultant dans la dysfonction endothéliale. Cependant, les premiers changements fonctionnels dans l&#39;endothélium qui signifient au niveau d&#39;un individu de risque ne sont pas directement évaluée en clinique pour aider à la stratégie de guide thérapeutique. En outre, la régulation de l&#39;inflammation par l&#39;hémodynamique locale contribue à la distribution spatiale non aléatoire de l&#39;athérosclérose, mais les mécanismes sont difficiles à délimiter in vivo. Nous décrivons une approche de laboratoire-sur-une-puce basée sur la perturbation métabolique de déterminer quantitativement les événements inflammatoires dans les cellules endothéliales humaines (CE) et des monocytes dans des conditions d&#39;écoulement précis. Les méthodes standard de lithographie douce sont utilisés pour microfabricate vasculaires mimétiques chambres microfluidiques VMMC), qui sont directement liés à la culture des monocouches de la CE. 1 Ces dispositifs ont l&#39;avantage d&#39;utiliser de petits volumes de réactifs, tout enfournir une plate-forme pour l&#39;imagerie directement les réactions inflammatoires à la membrane de CE exposé à un champ de cisaillement bien définie. Nous avons appliqué avec succès ces dispositifs pour étudier les cytokines, 2 lipidique-3, 4 et 5 RAGE-induite dans l&#39;inflammation humaine aortique CE (AHCE). Ici, nous documenter l&#39;utilisation de la VMMC à la cellule de dosage monocytaire (THP-1) de roulement et à l&#39;arrestation sur des monocouches de HAEC qui sont conditionnés selon des caractéristiques de cisaillement différentielles et activé par la cytokine inflammatoire TNF-α. Des études comme celles-ci fournissent une approche mécanistique dans atherosusceptibility sous facteurs de risque métaboliques.

Watch this Scientific Journal Video about On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping at JoVE.com

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Chambres d&#39;écoulement microfluidiques gravés par photolithographie et fabriqué à partir de PDMS sont appliqués à sonder les résultats fonctionnels associés à une dysfonction CE et de l&#39;inflammation. Dans une expérience représentative, la capacité de contrainte de cisaillement différentiel de moduler l&#39;adhésion cellulaire monocytaire à cytokine activé monocouches CE est démontrée.

On-Chip phénotypage endothélium inflammatoire

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

on-chip-endothelial-inflammatory-phenotyping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K vues.  University of California, Davis. Chambres d'écoulement microfluidiques gravés par photolithographie et fabriqué à partir de PDMS sont appliqués à sonder les résultats fonctionnels associés à une dysfonction CE et de l'inflammation. Dans une expérience représentative, la capacité de contrainte de cisaillement différentiel de moduler l'adhésion cellulaire monocytaire à cytokine activé monocouches CE est démontrée.

Vidéo: On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

Sur la puce isotachophorèse pour la séparation des ions et purification des acides nucléiques

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Recherche

Bio-ingénierie

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree sur puce microscopie tomographique Employant multi-angle d&#39;éclairage et de Pixel Super-résolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. The feasibility of using magnetic forces to capture and retain endothelial outgrowth cells (EOC) labeled with super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) has been shown previously. But this technique requires the development of a mechanically functional stent from a magnetic and biocompatible material followed by in-vitro and in-vivo testing to prove rapid endothelialization. We developed a weakly ferromagnetic stent from 2205 duplex stainless steel using computer aided design (CAD) and its design was further refined using finite element analysis (FEA). The final design of the stent exhibited a principal strain below the fracture limit of the material during mechanical crimping and expansion. One hundred stents were manufactured and a subset of them was used for mechanical testing, retained magnetic field measurements, in-vitro cell capture studies, and in-vivo implantation studies. Ten stents were tested for deployment to verify if they sustained crimping and expansion cycle without failure. Another 10 stents were magnetized using a strong neodymium magnet and their retained magnetic field was measured. The stents showed that the retained magnetism was sufficient to capture SPION-labeled EOC in our in-vitro studies. SPION-labeled EOC capture and retention was verified in large animal models by implanting 1 magnetized stent and 1 non-magnetized control stent in each of 4 pigs. The stented arteries were explanted after 7 days and analyzed histologically. The weakly magnetic stents developed in this study were capable of attracting and retaining SPION-labeled endothelial cells which can promote rapid healing.

Our goals were to design, manufacture and test ferromagnetic stents for endothelial cell capture. Ten stents were tested for fracture and 10 more stents were tested for retained magnetism. Finally, 10 stents were tested in-vitro and 8 more stents were implanted in 4 pigs to show cell capture and retention.

Ferromagnétique Bare Metal Stent pour endothéliale capture de cellules et de la conservation

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabrication et Validation d’un système d’orgue-on-chip avec électrodes intégrées à quantifier directement transendothéliale résistance électrique

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

Phénottypage à haute teneur en levures avec séquençage à base d’ARN à base de gouttelette

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

Bioimpression directe de sphéroïdes mammaires multicellulaires 3D sur les réseaux endothéliales

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells BOEC from Porcine Peripheral Blood

Caractérisation des cellules endothéliales de croissance sanguine (BOEC) à partir du sang périphérique porcin

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Un système microphysiologique pour étudier l’interaction leucocytaire-endothéliale pendant l’inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...