Ce protocole démontrera comment les cellules souches pluripotentes induites différenciées peuvent être ensemencées sur un organe sur puce pour générer une barrière céphalo-cérébrale entièrement humaine, personnalisée et microfluidique, qui peut être utilisée pour prédire la perméabilité des médicaments du système nerveux central et étudier les troubles neurologiques. À l’aide d’un organe sur puce disponible dans le commerce, nous démontrerons comment n’importe quel laboratoire biologiquement orienté peut utiliser cette technologie pour générer une barrière céphalo-cérébrale personnalisée et microfluidique sur puce. L’accumulation de preuves suggère que BBB joue un rôle dans la maladie neurologique en générant des puces BBB personnalisées dérivées d’iPSCs de personnes atteintes d’une maladie neurologique génétique.
Il sera possible d’étudier le rôle du BBB dans la santé et la maladie. Cette méthode peut également être utile pour les sociétés pharmaceutiques, qui peuvent utiliser cette plate-forme BBB humaine pour dépister la pénétrabilité des médicaments neurologiques candidats dans le cerveau humain. L’application des technologies d’orgue sur puce exige habituellement des qualifications spécialisées d’ingénierie.
L’utilisation de plates-formes disponibles dans le commerce permet l’application de cette technologie dans n’importe quel laboratoire biologiquement orienté. Pour commencer, apportez le plat contenant les croustilles préparées à l’armoire de biosécurité. À l’aide d’une pipette P200, lavez doucement les deux canaux en ajoutant 200 microlitres de milieu de différenciation neuronale dans l’entrée et en tirant le liquide de la sortie.
En évitant tout contact avec les ports, aspirez soigneusement les gouttelettes de médias excédentaires de la surface de la puce. Agiter doucement la suspension cellulaire pour assurer une suspension cellulaire homogène. Pour ensemencer les cellules progénitrices neurales dérivées de l’iPSC dans le canal supérieur pour générer le côté cérébral, ajoutez une pointe P200 contenant 30 à 100 microlitres de suspension cellulaire à la concentration d’une fois 10 à six cellules par millilitre à l’entrée supérieure du canal, et relâchez doucement la pointe de la pipette.
Prenez une pipette P200 vide, déprimez le piston, insérez dans la sortie du canal supérieur et tirez soigneusement la suspension à cellule unique à travers la pointe. Transférez la puce au microscope pour vérifier la densité d’ensemencement et la distribution homogène des cellules dans le canal supérieur. Après avoir confirmé la densité cellulaire à 20% de couverture, placez immédiatement les copeaux dans l’incubateur pendant deux heures à 37 degrés Celsius.
Après cela, laver les cellules qui ne se fixent pas en ajoutant un milieu de différenciation neurale fraîche dans l’entrée et en tirant le liquide via pipette de la sortie. Gardez les cellules dans des conditions statiques à 37 degrés Celsius avec un remplacement moyen de différenciation neuronale quotidienne. Une fois que les INPC ont attaché ou un jour suivant l’ensemencement, apportez le plat contenant les croustilles préparées à l’armoire de biosécurité.
Laver délicatement le canal inférieur avec 200 microlitres de milieu cellulaire endothélial. En évitant tout contact avec les ports, aspirez soigneusement les gouttelettes d’excès de milieu cellulaire endothélial à partir de la surface de la puce, en vous assurant de laisser le milieu dans les deux canaux. Agiter doucement la suspension cellulaire pour assurer une suspension cellulaire homogène.
À l’aide d’une pipette P200, dessiner de 30 à 100 microlitres de la suspension cellulaire endothéliale microvasculaire cérébrale dérivée de l’iPSC à la concentration de 14 à 20 fois 10 à six cellules par millilitre, et placer la pointe dans l’entrée du canal inférieur. L’étape la plus critique pour atteindre les propriétés fonctionnelles de barrière est l’ensemencement des cellules endothéliales microvasculaires de cerveau. Il est crucial de semer des cellules à la bonne densité pour éviter la formation de bulles pour vérifier la distribution homogène dans la puce de l’organe.
Déprimez le piston sur une pipette P200 avec une pointe vide, insérez dans la sortie du canal inférieur, et relâchez lentement le piston pipette pour tirer soigneusement la suspension à cellule unique à travers le canal inférieur. Aspirer l’excès de suspension cellulaire de la surface de la puce. Évitez tout contact direct avec les ports d’entrée et de sortie pour vous assurer qu’aucune suspension cellulaire n’est aspirée hors des canaux.
Transférer la puce au microscope pour vérifier la densité d’ensemencement. Le canal inférieur est rempli de cellules sans lacunes observables entre les deux. Après avoir confirmé la densité cellulaire correcte, ensemencer les cellules dans les copeaux restants.
Pour fixer les cellules sur la membrane poreuse, qui est située au-dessus du canal inférieur, inverser chaque puce, et les laisser reposer dans un berceau à copeaux. Placez un petit réservoir contenant du DPBS stérile à l’intérieur du plat de 150 millimètres pour fournir de l’humidité aux cellules. Incuber les copeaux à 37 degrés Celsius pendant environ trois heures ou jusqu’à ce que les cellules du chenal inférieur se soient fixées.
Une fois que les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales dérivées de l’iPSC se sont attachées, retournez les puces à une position verticale pour permettre l’attachement cellulaire à la partie inférieure du canal inférieur. 48 heures après l’ensemencement des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales dérivées de l’iPSC, équilibrent la température du milieu cellulaire endothélial en se réchauffant dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant une heure. Puis, dégazer le milieu par incubation sous un système de filtration aspirateur pendant 15 minutes.
Ensuite, assainir l’extérieur de l’emballage du module portable et les plateaux avec 70% d’éthanol, essuyer, et les transférer à l’armoire de biosécurité. Ouvrez l’emballage et placez les modules dans le plateau Orientez-les avec les réservoirs vers l’arrière du plateau. Pipette trois millilitres du média chaud pré-équilibré à chaque réservoir d’entrée.
Ajouter le milieu de culture cellulaire endothéliale au réservoir d’entrée du canal inférieur et au milieu de différenciation neuronale au réservoir d’entrée du canal supérieur du canal supérieur. Ensuite, pipette 300 microlitres des supports chauds prééquilibrés à chaque réservoir de sortie, directement au-dessus de chaque port de sortie. Placez jusqu’à six modules portables sur chaque plateau.
Apportez les plateaux à l’incubateur, et glissez complètement dans le module de culture avec la poignée de plateau faisant face vers l’extérieur. Sélectionnez et exécutez le cycle principal sur le module culture. Fermez la porte de l’incubateur et laissez le module culture amorcer les modules portables pendant environ une minute.
Le cycle d’amorçage est terminé lorsque la barre d’état se lit prête. Retirez le plateau du module culture et apportez-le à l’armoire de biosécurité. Inspectez le dessous de chaque module portatif dans l’armoire de biosécurité pour vérifier que les modules portatifs ont été amorcés avec succès.
Recherchez la présence de petites gouttelettes dans les quatre ports. Si un module portable n’affiche pas de gouttelettes, réexécuter le cycle principal sur ces modules. Si un média a coulait sur le plateau, ce qui se produit plus souvent par les ports de sortie, nettoyez le plateau avec 70% d’éthanol.
Ensuite, lavez doucement les deux canaux de chaque puce avec un milieu de culture chaud et équilibré spécifique aux cellules pour éliminer les bulles possibles dans le canal, et placez de petites gouttelettes de médias sur le dessus de chaque entrée et port de sortie. Insérez les puces avec des supports dans les modules portables, et placez jusqu’à six sur chaque plateau. Insérez les plateaux dans le module culture.
Programmez les conditions appropriées de culture des copeaux d’organes, comme le débit et l’étirement, sur le module de culture. Dès que le cycle de régulation est terminé, ce qui prend environ deux heures, les conditions programmées commencent. Après cela, le module de culture commence à couler aux conditions prédéfinies de culture de puce d’organe.
L’immunocytochimie sur la puce de barrière de sang-cerveau iPSC-basée sept jours après ensemencement montre les sphères d’EZ différenciées en une population mixte de cellules neurales dans le canal supérieur de côté de cerveau, y compris les astrocytes bêta-positifs de S100, les cellules progénitrices neurales nestin-positives, aussi bien que les astrocytes GFAP-positifs, et les neurones tubulin-positifs de bêta III. Les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales dérivées de l’IPSC ensemencées dans le canal latéral inférieur du sang ont exprimé GLUT-1 et PECAM-1. L’évaluation de la perméabilité de puce de barrière de sang-cerveau démontre que la puce d’organe ensemencée avec les cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires de cerveau iPSC-dérivées et les sphères d’EZ ont eu une barrière serrée comparée aux puces d’organe ensemencées avec les cellules endothéliales microvasculaires cerveau iPSC-dérivées seules.
Les copeaux d’organes ensemencés avec des sphères EZ seuls n’affichaient aucune propriété de barrière. Du traitement de surface initial du canal à la commutation moyenne chaque jour, évitez la formation de bulles dans le canal. Tout au long de l’étape du protocole dans laquelle le réaccératrice d’activation de surface, la matrice extracellulaire ou le milieu contenant des cellules doit être insérée par les canaux, il est extrêmement important de vérifier soigneusement qu’aucune bulle n’est trouvée.
L’analyse de perméabilité peut être effectuée pour évaluer la pénétrabilité du cerveau humain des médicaments candidats. Cette approche peut servir à tester des thérapeutiques potentielles. L’application de la puce BBB basée sur l’iPSC permet d’étudier le rôle du BBB dans diverses maladies neurologiques.
À l’avenir, une telle plate-forme pourrait être utile pour les applications prédictives et personnalisées de médecine.
