Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la tuberculose telles que le rôle des réponses immunitaires adaptatives et la pathogénie de cette maladie multifactorielle. Le principal avantage de cette méthode de base de l’acide nucléique est que les charges bactériennes et les niveaux d’expression des gènes peuvent être mesurés à partir du même individu. Pour commencer cette procédure, culture M.marinum sur une plaque 7H10 tel que décrit dans le protocole texte.
Transférez 10 millilitres de milieu 7H9 contenant l’enrichissement d’ADC, le polysorbate 80, et le glycérol à un flacon de culture cellulaire. Ensuite, utilisez une boucle stérile d’inoculation microliter pour transférer aseptiquement une boucle de la masse bactérienne M.marinum dans le flacon. Laissez le bouchon lâche ou utilisez un bouchon de filtre pour permettre un échange de gaz et une culture suffisants à 29 degrés Celsius dans l’obscurité sans trembler pendant trois à quatre jours jusqu’à ce que l’OD600 atteigne environ 0,7.
Diluer et continuer à culturer les bactéries comme décrit dans le texte. Pour commencer à préparer la solution bactérienne pour l’infection, transférer un millilitre de la culture dans un tube frais. Centrifugeuse à 10 000 g pendant trois minutes.
Retirez le supernatant et réutilisez la pastille en un millilitre de PBS stérile. À l’aide d’un PBS stérile avec un millilitre de 0,3 milligramme par millilitre de rouge phénol comme traceur, diluer la suspension pour atteindre la concentration bactérienne désirée. Après cela, utilisez une seringue d’un millilitre pour tirer lentement la suspension à travers une aiguille de calibre 27 trois fois.
Effectuez cette étape juste avant l’utilisation pour chaque aliquot. Tout d’abord, pipette une gouttelette de cinq microlitres de la solution bactérienne diluée sur un morceau de film de paraffine. Ensuite, tirez la gouttelette dans une aiguille d’insuline de calibre 30.
Utilisez un poisson de cinq à huit mois pour cette expérience avec l’un étant un poisson de type sauvage et l’autre étant un poisson mutant chiffon. Placez ces poissons côté ventral vers le haut dans les fentes d’un morceau de plastique mousseux humide. Injecter l’aiguille d’insuline entre les nageoires pelviennes à un angle de 45 degrés.
Gardez l’aiguille ouverte vers le haut pour vous assurer que toute l’ouverture est à l’intérieur de la cavité abdominale. Ensuite, injectez lentement la solution bactérienne. Après cela, retirez soigneusement l’aiguille et transférez immédiatement le poisson dans un réservoir de récupération rempli d’eau de réservoir frais.
Prélevez des échantillons de l’aliquot bactérien utilisé toutes les 15 minutes sur des plaques de 7H10. Incuber ces échantillons à 29 degrés Celsius pendant cinq jours pour vérifier la dose d’infection. Vérifiez régulièrement le bien-être des poissons, en vous assurant d’euthanasier tous les poissons présentant des symptômes d’infection en les incubant dans l’eau avec plus de 0,02 % de l’ester éthylique à 3 acides aminobenzoïques.
Après avoir euthanasié le poisson, insérez une épingle postérieure aux rayons branchiostegal. Insérez une deuxième broche à travers la queue pour clouer le poisson sur la plate-forme. À l’aide d’un scalpel, ouvrir toute la cavité abdominale.
Ensuite, utilisez une petite cuillère et des pinces à épiler pointues pour recueillir les organes internes à partir du cœur et de travailler le long de la colonne vertébrale vers la queue pour détacher tous les organes internes en un seul bloc. Utilisez des pinces à épiler pour détacher le filet d’intestin du cloaque et transférer les organes dans un tube d’homogénéisation de 1,5 millilitre contenant une demi-douzaine de perles de céramique de 2,8 millimètres. Placez immédiatement le tube sur de la glace sèche pour congeler l’échantillon.
Conserver l’échantillon à 80 degrés Celsius négatif jusqu’à ce qu’il soit prêt à homogénéiser. Après avoir extrait l’ADN et l’ARN, mesurez les charges mycobactériennes par PCR quantitatif tel que décrit dans le protocole de texte. Dans cette étude, le poisson zèbre adulte est infecté par M.marinum par injection intraperitoneal.
Une dose élevée d’infection est considérée comme conduire à une maladie progressive dans laquelle la charge mycobactérienne continue d’augmenter jusqu’à ce que la charge moyenne atteint environ cinq millions de bactéries finalement tuer le poisson. Une faible dose d’autre part conduit au développement d’un spectre de la maladie similaire à celui observé dans la tuberculose humaine avec des infections progressives, latentes, réactivées et stérilisées. Dans ce cas, la charge continue d’augmenter pendant quatre semaines, après quoi la maladie atteint un état stable dans la majorité des poissons.
Ces données révèlent que le nombre initial de mycobactéries utilisées pour infecter les poissons est un déterminant essentiel pour l’issue de l’infection. On voit que le poisson zèbre mutant du chiffon est incapable de limiter suffisamment la croissance des mycobactéries, ce qui entraîne des charges bactériennes plus élevées et une morbidité accrue. Ceci démontre clairement l’importance de l’immunité adaptative en contrôlant l’infection mycobactérienne.
Les niveaux d’interleukine-4 sont significativement plus élevés dans le groupe sauvage de type révélant que la réponse adaptative est exigée pour l’introduction efficace de l’interleukin-4, mais dispensable pour l’introduction du gamma d’interféron après infection mycobactérienne. Ce protocole permet la collecte de l’ADN et de l’ARN à partir du même échantillon, ce qui permet de combiner la charge mycobactérienne de l’échantillon avec les données d’expression génétique de l’hôte et des bactéries. Cette technique peut être combinée avec l’administration de médicaments ou de vaccins candidats pour évaluer leur effet sur les charges mycobactériennes et les réponses immunitaires.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de suivre les directives locales pour la sécurité personnelle et l’élimination des déchets lorsque vous travaillez avec un agent pathogène de niveau de biosécurité deux. Cette technique permet d’étudier à la fois la tuberculose active et latente avec des mycobactéries dormantes chez le poisson zèbre qui est un modèle in vivo non mammifère éthique.
