Cette méthode fournit une stratégie efficace pour préparer des échafaudages fonctionnels pour la recherche de tumeur d’os. Decellularized la matrice extracelullar d’os, a montré la sérocompatibilité variable pour la survie et les activités des cellules d’osteosarcoma. Le principal avantage de cette technique est que la culture de cellules d’ostéosarcome dans la matrice os-dérivée montrent la morphologie fortement hétérogène semblable à une histopathologie clinique d’ostéosarcome.
La méthode fournit le modèle idéal pour étudier le développement, la progression des sensibilités de drogue des tumeurs d’os, telles que l’ostéosarcome, le sarcome d’Ewing, et les autres métastases malignes de tumeurs à l’os. Pour commencer, obtenir des souris BALB/c âgées de quatre à six semaines, après avoir euthanasié une souris à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, coupé le péroné frais, le tibia et le fémur d’un membre postérieur. À l’aide d’une pince à épiler, décoller le tissu épithélial, puis enlever autant de tissus mous que possible.
Rincez les os des jambes avec une solution stérile de 10 mM PBS deux fois pour enlever le sang dans un plat de six centimètres. Plonger les os dans un plat avec 75% d’éthanol pendant trois minutes, puis rincer avec PBS deux fois. Conservez les os propres dans un tube stérile de centrifugeuse de 50 millilitres avec un tube PBS stérile à 80 degrés Celsius.
Décongeler les os congelés à température ambiante, puis congeler à nouveau à 80 degrés Celsius pendant une heure. Soumettez les os à plus de deux cycles gel-dégel pour la lyse cellulaire et la dégradation des tissus. Ensuite, placez les os dans un tube stérile centrifugeuse de 50 millilitres rempli de 0,5 HCl normal et incubez pendant la nuit à température ambiante sur un shaker orbital avec des secousses douces pour assurer une couverture complète et même des os.
Après décalcification, décanter complètement la solution d’acide chlorhydrique et rincer complètement les os sous l’eau courante pendant une heure. Ensuite, utilisez de l’eau distillée pour laver les os deux fois pendant 15 minutes par lavage sur un shaker orbital. Décanter complètement la solution.
Pour extraire les lipides dans un os déminéralisé, placez les os dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres avec un mélange 1:1 de méthanol et de chloroforme. Envelopper le tube de papier d’aluminium pour éviter la lumière pour prévenir la décomposition du chloroforme. Et mettez le tube sur un shaker orbital pendant une heure.
Ensuite, utilisez des pinces à épiler pour transférer les os dans un autre tube de méthanol avec du papier d’aluminium pendant 30 minutes. Retirer complètement le méthanol et laver avec de l’eau distillée deux fois pendant 15 minutes sur un shaker orbital. Décanter l’eau finale de lavage et procéder dans un état stérile.
Rincer les os dans un plat de six centimètres avec du PBS stérile pendant trois minutes. Ajouter 40 millilitres de solution stérile de 0,05 % TE dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres et incuber les os pendant 23 heures dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Jetez la solution TE et rincez deux fois avec du PBS stérile complété par de l’ampicilline de 90 g/mL et de la kanamycine de 90 g/mL pendant 15 minutes chacun sur le shaker orbital.
Après avoir décanté complètement le lavage final, réapprovisionner à nouveau avec 40 millilitres de PBS stérile avec des antibiotiques. Lavez soigneusement pendant 24 heures à température ambiante avec des secousses douces pour obtenir une stérilisation efficace des espaces poreux. Ensuite, transférez les os dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres rempli de PBS stérile avec des antibiotiques.
La matrice extracellulaire osseuse préparée peut être stockée à quatre degrés Celsius pendant deux mois. Plonger bem dans 75% d’éthanol dans un plat et secouer doucement le plat à la main pendant 30 secondes. Rincez ensuite avec PBS pendant 30 secondes, deux fois.
Transférer le BEM sur une plaque de culture cellulaire propre de six puits. Ajouter deux millilitres de milieu de culture complet à chaque puits. Incuber le BEM pendant la nuit dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.
Obtenez des lignées cellulaires d’OS humaines dans 100 microlitres de PBS préchauffé contenant le phénol rouge indicateur. Utilisez une pipette pour suspendre les cellules OS avec une concentration approximative de 1 fois 10 à la 5ème. Une fois que le BEM est entièrement trempé dans le milieu, des épiphyses proximales ou distales, percer l’aiguille à la cavité médullaire de BEM et injecter des cellules OS dans BEM.
Incuber le modèle OS-BEM pendant au moins deux heures dans une atmosphère humidifiée de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius afin de s’assurer que les cellules injectées adhèrent fermement au BEM. Ensuite, sortez la plaque de l’incubateur. Ajouter un milieu de culture millilitre sur l’assiette, et le garder dans l’incubateur pendant la nuit pour enrober complètement la surface de la culture BEM.
Transférez doucement le modèle OS-BEM dans un nouveau puits d’une plaque de six puits avec une pince stérile, et redyez un milieu de culture frais millilitre. Culture du modèle pendant 14 jours dans l’incubateur. Pendant l’incubation de 14 jours, continuez à surveiller la couleur moyenne.
Si le milieu se transforme en orange, voire jaune, rafraîchissez immédiatement le milieu en jetant la moitié de l’ancien milieu et en ajoutant un nouveau milieu pour maintenir un environnement sain pour les cellules OS. Continuez à surveiller l’état des cellules sous le microscope à fluorescence inversé. Lorsque les cellules OS se dilatent à la plaque, transférez doucement le modèle OS-BEM dans un autre nouveau puits avec des pinces stériles.
Après 14 jours de culture, rincer doucement le modèle OS-BEM avec PBS pour enlever le milieu de culture. Puis transférer dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et ajouter 10% de formaline tamponnée à fixer pour l’identification histologique. Après déminéralisation et décellularisation, BEM semble translucide avec une résilience et une ténacité plus fortes par rapport à l’os de souris indigène.
Un peu de résidus musculaires dans l’espace de la cavité médullaire peut être clairement observé. La formation image de champ lumineux de l’os indigène et du BEM décellularisé, montre l’enlèvement complet des noyaux cellulaires. La structure poreuse naturelle dans l’arrangement de réseau de collagène est bien maintenue dans bem décellularisé.
En outre, la coloration immunohistochimique pour le collagène I et le collagène IV montre que les principaux composants de la matrice extracellulaire sont conservés dans le tibia de souris après la décellularisation. Pendant la culture de 14 jours, le périoste et l’endostée sont infiltrés par l’expansion des cellules d’OS. Les cellules d’OS sur le BEM décellularisé montrent la morphologie fortement hétérogène semblable aux dispositifs cytopathologiques d’une section d’OS.
L’analyse immunohistochimique après la culture dans le modèle BEM pendant 14 jours montre de grands avantages dans les cultures à long terme. En outre, les cellules d’OS et la culture de BEM, glycoprotéine fortement expresse de matrice d’os, qui est spécifique pour la matrice ostéoïde. Ce modèle tridimensionnel in vitro a été utilisé pour démontrer une hétérogénéité phénotypique et un mécanisme réglementaire de dédifferentiation de l’ostéosarcome avec succès.
