Ces études ont été financées, en partie, par des subventions de la Fondation Alternative recherche et développement (107 588), l&#39;Institut national de la santé (1U54CA136465-04S1), et le Programme de recherche sur le cancer du sein en Californie (201B-0141). Nous remercions les Drs. Andrew Wilber et R. Scott McIvor pour le don généreux de leur <pkt2 lubig=""> transponson et PK / Hubic-SB11 plasmides de transposase. Nous tenons à remercier John Tamaresis, Ph.D. pour obtenir des conseils sur les méthodes statistiques, Timothy Brown pour effectuer cytométrie de flux, Georgette Henrich pour obtenir des conseils sur les migrations des essais, et Nancy Bellagamba pour faciliter la collecte de spécimens THR. </pkt2>

Têtes fémorales ont été prélevés chez des patients subissant une chirurgie élective THR dans le département de chirurgie orthopédique à l&#39;École de médecine de l&#39;Université Stanford. Tous les tissus ont été recueillies dans dépersonnalisées spécimens conformément à la réglementation de l&#39;Office Université Stanford recherches sur l&#39;observation. 1. Sélection d&#39;une ligne (s) de cellules du cancer du sein <ol><li> Obtenir ou transfecter la lignée cellulaire de cancer du sein souhaitée (s) avec une construction de rapporteur de la luciférase-GFP. Les expériences suivantes ont été effectuées en utilisant le MDA-MB-231 et MCF-7 du cancer du sein lignées cellulaires conçus pour l&#39;expression stable de la luciférase de luciole (USLC) et le renforcement de la protéine fluorescente verte (EGFP) par transfection avec la Belle au Bois Dormant transposon plasmide pKT2 / Lubig et le plasmide pK transposase / Hubic-SB11 45,46. REMARQUE: Les lignées de cellules transfectées sont désignés comme MDA-MB-231-Fluc-EGFP, et MCF-7-Fluc-EGFP. </li></ol> 2. Isoler tissus Fragments de têtes fémorales <ol><li> Après la chirurgie THR, recueillir la tête fémorale au rebut dans un récipient stérile remplie de sérum physiologique. Transférer le spécimen dans le laboratoire et de traiter dans un délai de 1-3 heures de la chirurgie. Remarque: se il ya un retard dans le traitement, le spécimen à 4 ° C. </li><li> Préparer une zone de travail en plaçant les éléments suivants sur un tapis absorbant dans une hotte à flux laminaire de culture de tissu: gants stériles, rongeur chirurgicale, pinces, bécher avec 70% d&#39;isopropanol à rincer les instruments, et les navires de culture de tissus tel que stipulé ci-dessous pour chaque type d&#39;expérience . </li><li> Le port d&#39;un gant chirurgical stérile pour maintenir la tête du fémur tour dans une main, utilisez le rongeur dans l&#39;autre main pour extraire des fragments d&#39;os trabéculaire de taille désirée (~ 2-5 mm) de l&#39;arbre supérieure exposée du fémur. Transfert des fragments d&#39;os dans le récipient de culture (par exemple, 6, 12, ou 24 puits plaque de culture tissulaire ou de la chambre de migration), en fonction du type de prolifération, colonisation ou migration expérience, telle que décrite dans les étapes 3, 4 ou 5. REMARQUE: des fragments de tissus osseux doit être récolté comme décrit ci-dessus après avoir terminé les étapes initiales pour chaque prolifération, la colonisation ou la migration test spécifique. Fragments varieront en taille comme le montre la figure 2. Les fragments peuvent être pesés avant ou après des expériences dans le but de normalisation. </li></ol> 3. Les cellules du cancer du sein Co-culture adjacentes à Fragments d&#39;os pour mesurer sein prolifération cellulaire en utilisant BLI <ol><li> Avant l&#39;expérience, préparer une suspension contenant 2 x 10 5 cellules du cancer du sein / 50 ul, et préparer des bouchons de cire osseuse pour l&#39;immobilisation de fragments d&#39;os en culture. Couper une pointe de micropipette P200 en 3 morceaux et utiliser l&#39;extrémité étroite de la plus grande pièce d&#39;une manière &quot;cookie cutter&quot; pour couper des petits (~ 35 mg) morceaux de cire osseuse. Utiliser l&#39;extrémité large de la plus petite pièce pour éjecter les bouchons de cire osseuse dans une boîte de Pétripour le stockage. </li><li> Placez un morceau de cire d&#39;os à la position de 12 heures de chaque puits et appuyez doucement avec un index stériles gantées. </li><li> Introduire à la pipette 50 ul de suspension cellulaire contenant 1 x 10 5 cellules de cancer du sein dans un milieu DMEM-10% SVF + Pen-Strep au centre de chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits. (Variante, des cellules de semences dans un motif dispersé si désiré.) Placer la plaque dans une culture de tissu C incubateur à 37 ° pendant 45 min à promouvoir l&#39;attachement des cellules. </li><li> Placez une fragment d&#39;os sur une morceau de cire osseuse pour chaque puits expérimental et appliquer une légère pression avec le rongeur pour le fixer. Réaliser des expériences en triple telle que trois fragments d&#39;os d&#39;un spécimen THR données sont placées dans les trois premiers puits, tandis que les trois derniers puits contiennent la cire osseuse seulement comme témoins. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une pipette de 5 ml, doucement et lentement fournir 5 ml de DMEM-10% FBS sur le côté de chaque puits afin d&#39;éviter de déloger les cellules mammaires ou des fragments d&#39;os. Placer la plaque dans un 3776; C culture tissulaire incubateur pour 20-24 h. </li><li> Pour effectuer l&#39;imagerie par bioluminescence (BLI) retirer la plaque de l&#39;incubateur et ajouter le substrat de luciférine (pour obtenir une concentration de 300 ug / ml) dans chaque puits. Image la plaque immédiatement sur une plateforme d&#39;imagerie IVIS utilisant les paramètres suivants: f-stop de 1, petite binning, temps d&#39;exposition de 1 sec, le niveau D. mesurer l&#39;intensité du signal de chaque ainsi que l&#39;éclat moyenne (photons / seconde centimètres / carré / stéradian). </li><li> Utilisez le logiciel d&#39;imagerie pour définir des régions d&#39;intérêt (ROI) pour quantifier le rayonnement moyenne pour tous les puits expérimentaux et de contrôle. valeurs de radiance moyenne à l&#39;exportation vers une feuille Excel pour effectuer des statistiques et de générer des graphiques. </li></ol> 4. Les cellules du cancer du sein Co-culture ensemencées directement sur Fragments d&#39;os pour l&#39;étude de la colonisation et du numéro de cellulaire <ol><li> Utiliser des pinces pour placer des fragments d&#39;os directement dans les puits vides d&#39;une plaque de culture tissulaire à 24 puits (1 fragment / puits). </li><li> Pépinette un 50 ul de suspension cellulaire gouttelette de DMEM-FBS à 10% contenant 1 X 3 à 6 octobre cellules de cancer du sein directement au-dessus de chaque fragment d&#39;os. Placer la plaque dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 45 min à promouvoir l&#39;attachement des cellules. Ajouter doucement 2.1 ml de DMEM-10% de FBS dans le côté de chaque puits de telle sorte que le fragment est entièrement immergé dans le milieu. Incuber la plaque dans un 37 ° C incubateur pour culture de tissus de 20 à 24 h. </li><li> Après incubation, utiliser une pince pour transférer chaque fragment de tissu osseux à une plaque à 24 puits fraîche contenant 1 ml de DMEM-10% de FBS dans chaque puits. Pour effectuer BLI, suivez les étapes 3.6 à 3.7 ci-dessus. En outre, les fragments peuvent être visualisés à l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence, ou rincés pour obtenir la population de la moelle osseuse pour l&#39;analyse des chiffres et des propriétés cellulaires de cancer du sein comme décrit dans l&#39;étape 6. </li><li> Pour préparer les fragments intacts pour l&#39;évaluation qualitative par microscopie à fluorescence suivant BLI, pipette 5 pi de solution d&#39;étiquetage de bisphosphonate fluorescent (prépréparée selon les instructions du fabricant) dans chaque puits pour étiqueter les spicules minéralisées des fragments d&#39;os. Incuber la plaque dans l&#39;incubateur de culture tissulaire pendant 24 heures. </li><li> À la suite de 24 h de culture dans la solution de marquage de bisphosphonate fluorescent, utiliser une pince pour transférer les fragments de plaques de culture de tissu contenant du milieu dépourvu de rouge de phénol et vue l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence configuré pour imager la GFP (485 nm) et l&#39;étiquette de bisphosphonate (680 nm). </li></ol> 5. Mesurer la migration des cellules de cancer du sein à des fragments de tissu osseux et de culture Fragment d&#39;os surnageants <ol><li> Migration vers le tissu osseux surnageant de culture. REMARQUE: réaliser des expériences en triple telle que trois fragments d&#39;un spécimen THR données sont utilisés pour générer trois surnageants. Pour chaque expérience, la migration est comparée dans trois puits contenant surnageants osseuses contre trois puits contenant du milieu de commande seulement. <ol><li> Générer tis osseusepoursuivre surnageants en plaçant des fragments d&#39;os dans les puits d&#39;une plaque à 12 puits contenant 2,2 ml de DMEM-10% de FBS par puits. Culture dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 24 heures. Retirer le milieu à 24 h et le remplacer par 2,2 ml frais DMEM-10% de FBS. Traiter les puits témoins contenant du DMEM-FBS à 10% de la même manière. NOTE: Le milieu est changé à 24 h pour éliminer les facteurs sécrétés en réponse à un traumatisme des tissus résultant d&#39;une chirurgie. Parce que les surnageants de tissu osseux sont générés dans un milieu contenant du FBS-puits contenant FBS, un milieu contenant seulement sont inclus pour contrôler la contribution de FBS à la migration de cellules de cancer du sein. </li><li> A 48 heures, de recueillir 0,9 ml de chaque / moyen et pipette de contrôle surnageant dans les puits d&#39;une plaque réceptrice. Les insertions seront ensuite placés dans ces puits. Incuber la plaque du récepteur dans le tissu incubateur de culture tout en ensemençant les inserts. Remarque: Le surnageant restant (~ 1 ml après évaporation) peuvent être collectées pour l&#39;analyse des sécrétome factors 44 si vous le souhaitez. </li><li> Pour ensemencer les inserts Transwell, placez-les dans une norme, vide de 24 puits plaque de culture de tissus. Introduire à la pipette 350 ul de suspension cellulaire contenant 1 x 10 5 cellules de cancer du sein dans du DMEM-FBS à 10% sur la surface de la membrane interne, supérieure, de chaque insert comme représenté sur la figure 1A. Placer la plaque à 24 puits contenant les inserts ensemencées dans les 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 45 min pour favoriser la fixation. </li><li> Une fois que les cellules ont attaché aux inserts, utiliser une pince pour transférer les inserts à la plaque de récepteur selon les instructions du fabricant. Angle chaque insert lorsque vous les placez dans le récepteur et pour prévenir la formation de bulles entre la membrane d&#39;insertion et le récepteur ainsi surnageant. Incuber la plaque du récepteur avec des inserts pendant 20 heures dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire. REMARQUE: Vérifiez la partie inférieure de la plaque réceptrice de bulles entre la membrane d&#39;insertion et le récepteur ainsi supernatant. Si des bulles sont visibles, enlever les inserts spécifiques et de les placer à nouveau dans le récepteur ainsi jusqu&#39;à ce qu&#39;aucune bulle sont présents. </li><li> Après 20 heures d&#39;utilisation des forceps pour retirer les inserts de la plaque du récepteur. En utilisant les procédures décrites dans les étapes 3.6 à 3.7 à l&#39;image BLI effectuer les cellules qui ont migré dans et fixés au fond des puits de la plaque de réception. </li></ol></li><li> La migration vers les fragments de tissu osseux. REMARQUE: réaliser des expériences en triple telle que trois fragments d&#39;un spécimen THR données sont placés dans trois inserts séparés, et trois perles de verre sont placés dans trois inserts séparés comme témoins. <ol><li> Préparer la plaque réceptrice par pipetage de 0,9 ml de DMEM-FBS à 10% dans chaque puits. Placez-le dans le tissu incubateur de culture tout en préparant les inserts. </li><li> Pour ensemencer les inserts, les inverser sur la surface d&#39;une boîte de tube de centrifugeuse en plastique muni d&#39;un couvercle. Pipeter 50 uL d&#39;une suspension cellulaire de gouttelettes de DMEM-FBS à 10% contenant 1 x 10 5 cellules de cancer du sein; directly sur la surface extérieure, en bas de chaque membrane de l&#39;insert (qui est orientée vers le haut sur les inserts inversées). Couvrir la boîte de tube de centrifugeuse avec le couvercle entrouverte et de le transférer à l&#39;incubateur à 37 ° C de tissu pendant 45 min à promouvoir l&#39;attachement des cellules. </li><li> Transférer la boîte du tube de centrifugeuse pour la hotte de culture de tissus, et d&#39;utiliser une pince pour tourner les inserts ensemencées côté droit et les transférer dans les puits de la plaque réceptrice. Pipette 0,450 ml de DMEM-FBS à 10% dans chaque cupule d&#39;insertion. En utilisant des pinces, transférer un fragment de tissu osseux (~ 3 mm) dans chaque coupelle d&#39;insertion préparé. Eventuellement, utiliser des perles de verre de contrôles négatifs dans des puits supplémentaires. Placer la plaque dans un incubateur de culture de tissu pendant 20 heures. </li><li> Pour mesurer la migration, préparer une plaque de culture de tissu à 24 puits standard contenant 1 ml de DMEM-FBS à 10% par puits. Retirer la plaque du récepteur de l&#39;incubateur et utiliser des pinces pour transférer les fragments d&#39;os et perles de chaque insert dans des puits séparés de la plaque standard. Ajouter luciférinesubstrat (pour obtenir une concentration finale de 300 ug / ml) dans chaque puits et BLI effectuer en utilisant les procédures décrites dans les étapes 3.6 à 3.7. </li></ol></li></ol> 6. Les analyses pré- et post-expérimentaux supplémentaires <ol><li> Analyse de moelle rouge. <ol><li> Transférer un fragment d&#39;os dans un tamis cellulaire de 70 pm placée au sommet d&#39;un tube conique de 50 ml. Utiliser une seringue de 10 ml avec une aiguille 25 G pour rincer énergiquement le fragment avec 10 ml de PBS pour obtenir une suspension de cellules de moelle osseuse dans le tube conique. Centrifuger la suspension de cellules pendant 3 minutes à 300 x g et 21 ° C, Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS ou tout autre solution souhaitée pour la cytométrie de flux. REMARQUE: Les volumes de remise en suspension varie en fonction de la taille du culot de cellules après centrifugation, et l&#39;application. </li><li> Pour les tests de viabilité ~ 75-300 volumes ul de PBS sont appropriées, et ces suspensions peuvent être analysées à l&#39;aide disponible dans le commerce fluorescence essais de viabilité en fonction selon les instructions du fabricant, à la pipette dans un hémocytomètre classique, et comptées en utilisant un microscope à fluorescence inversé. </li><li> Pour l&#39;analyse par cytométrie de flux ou tri basé sur la détection de cellules de cancer du sein positives à GFP, remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS contenant 2% de FBS, 2 mM d&#39;EDTA et 10 mM de HEPES de telle sorte que la concentration est de 1 x 10 6 cellules / ml. </li></ol></li><li> Coloration H &amp; E et immunohistochimie. <ol><li> Pour traiter les fragments pour hématoxyline &amp; éosine (H &amp; E) coloration et / ou immunohistochimie, placer les fragments de cassettes plastique étiquetés avec un crayon numéro 2, et plonger dans un récipient rempli de formol à 10% tamponnée pendant 24 heures. </li><li> tissus de procédé pour inclusion dans la paraffine, de sectionnement et de la coloration en utilisant des protocoles de routine qui comprennent une étape de décalcification pour tenir compte des spicules minéralisées dans chaque fragment. </li></ol></li></ol>

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Mehra et al. Ont déjà décrit la collecte et l&#39;analyse des échantillons d&#39;os post-mortem de patients métastatiques de cancer de la prostate récoltés au moment de l&#39;autopsie, révélant des tissus de haute qualité et de valider l&#39;utilisation des échantillons d&#39;os humains pour étudier le processus métastatique 47. Ici, nous avons décrit les protocoles pour la collecte, le traitement et l&#39;utilisation de fragments de tissus osseux humains obtenus à partir de têtes fé...

Le microenvironnement tumoral est largement reconnue comme un facteur déterminant du comportement des cellules cancéreuses lors de la progression du cancer du sein métastatique et réparties 1-3. Le but de la méthode présentée ici est de faciliter l&#39;étude des cellules de cancer du sein dans le microenvironnement du tissu osseux humain, le site le plus fréquent des métastases du cancer du sein 06/04. L&#39;os est constitué de compartiments minéralisées et moelle 7-9, qui abritent les deux cellules et les facteurs sécrétés impliqués dans la progression métastatique 10,11. Bien que largement utilisé dans des modèles murins in vivo faciliter les études systémiques du processus métastatique 12-15, interactions cellulaires dans le squelette ne sont pas facilement accessibles pour l&#39;observation et la perturbation directe. systèmes de modèle pour l&#39;étude et la culture de tissus osseux de la souris et des cellules de moelle de souris fournissent un meilleur accès et ont donné de nombreuses idées concernant la diaphonie et les mécanismes sous-jacents cellules du cancer du sein metastasis du squelette murin 16-22. Cependant, des études ont suggéré qu&#39;il pourrait y avoir des motifs spécifiques aux espèces de ostéotropisme pour le tissu osseux 23,24. Ces modèles pourraient refléter espèces spécifiques inhérents différences dans les propriétés du tissu osseux, les différences résultant de populations de moelle osseuse altérées chez des souris immunodéficientes 11, et / ou l&#39;âge relativement jeune de souris utilisés dans des expériences, qui sont tous des déterminants probables de l&#39;os microenvironnement. Approches in vitro pour étudier les cellules du cancer du sein dans l&#39;os co-cultures humaines ont généralement porté sur des types de cellules osseuses spécifiques tels que les ostéoblastes dérivées de la moelle ou de cellules stromales cultivées en monocouches ou dans des systèmes modèles en 3 dimensions modifiées 25-35. Bien que les modèles de culture cellulaires deux dimensions ont formé le pilier de approches in vitro pour la recherche sur le cancer, il est reconnu depuis longtemps que le comportement de la cellule est fondamentalement modifiée en monolayer systèmes de culture 18,36,37. Cela a conduit au développement de micro-environnements modifiés qui imitent la complexité des tissus vivants trois dimensions, y compris matriciel et modèles basés échafaudage sont constitués de matières naturelles, telles que le collagène, ou des polymères synthétiques ensemencées avec des types de cellules spécifiques pour créer des micro-environnements de tissu ressemblant 36-41. Les approches d&#39;ingénierie ont également inclus l&#39;utilisation de plates-formes de bioréacteurs pour contrôler et étudier le milieu hormonal du microenvironnement 18,19,41-43. Bien que les modèles et les bioréacteurs biomimétiques fournissent de nombreux éléments d&#39;un microenvironnement des tissus complexes dans un environnement contrôlé, et ont été appliquées avec succès pour faire progresser l&#39;étude des métastases du cancer du sein à l&#39;os 18,19,35,42,43, systèmes modèles d&#39;ingénierie ne intègrent généralement pas la gamme complète de types de cellules et de composants de la matrice extracellulaire présents dans l&#39;environnement de l&#39;os natif. Jusqu&#39;à récemment, le cancer du seincellules ne ont pas été étudiés dans le, intacte microenvironnement natif, trois dimensions des tissus osseux humains. Nous avons récemment rapporté le développement d&#39;un modèle de co-culture en utilisant des fragments de tissus osseux humains isolés à partir de prothèse totale de hanche (PTH) Chirurgie spécimens 44. Ces spécimens abritent les deux compartiments minéralisées et de moelle osseuse nécessaires pour étudier les mécanismes sous-jacents de micro-métastases dans la culture à court terme. Dans des travaux antérieurs, nous avons établi la preuve de principe pour l&#39;utilisation de l&#39;imagerie par bioluminescence (BLI) de surveiller la prolifération des cellules du cancer du sein exprimant la luciférase (MDA-MB-231-Fluc) co-cultivées avec des fragments d&#39;os 44. Ici, nous présentons détaillons protocoles expérimentaux pour étudier la prolifération des cellules du cancer du sein, de la colonisation et de la migration dans le contexte du microenvironnement natif utilisant des explants de tissus osseux humain. Nous présentons d&#39;abord un protocole de cellules de cancer du sein co-culture adjacents à des fragments d&#39;os pour mesurer seinla prolifération cellulaire en utilisant BLI. Dans cette section, des suspensions de cellules du sein sont ensemencées sous forme de taches de cellules dans des plaques à 6 puits adjacents à des fragments d&#39;os, qui sont immobilisées par des morceaux de cire osseuse. Les puits témoins contiennent de la cire d&#39;os, mais pas de fragment d&#39;os. Une fois les taches de cellules attachent, milieu est ajouté et la plaque est mise en culture pendant 24 heures, après quoi l&#39;intensité du signal bioluminescent (associée avec le nombre de cellules) est mesuré avec BLI. Dans l&#39;étape suivante, nous présentons des procédés pour les cellules cancéreuses du sein co-culture ensemencés directement sur les fragments d&#39;os à étudier la colonisation et la prolifération. Ici, les suspensions de cellules du sein sont déposés à la pipette directement sur les fragments de tissus osseux, qui sont suivis dans la culture par BLI et la microscopie de fluorescence au cours du temps pour suivre la colonisation et le nombre de cellules. Dans ce procédé, le compartiment de moelle peut être envoyé à partir des fragments d&#39;os à ne importe quel point dans le temps pour l&#39;analyse de cellules du cancer du sein colonisés par cytométrie en flux, ou des dosages de viabilité de la moelle osseuse. En outre, on describe deux approches différentes pour la mesure de la migration des cellules du cancer du sein. Dans la première méthode étapes sont décrites pour mesurer la migration vers les tissus osseux surnageants de culture. Dans ce protocole, les cellules de cancer du sein sont ensemencées sur les surfaces supérieures intérieures, d&#39;insérer des membranes Transwell avec une taille de pores de 8 um (comme représenté sur la figure 1A). Les inserts sont ensuite placés dans une plaque de réception avec des puits contenant des tissus osseux surnageant ou le milieu de contrôle. Au cours d&#39;une période d&#39;incubation de 20 h, un petit nombre de cellules cancéreuses du sein migrent à travers les membranes d&#39;insertion vers le bas dans les puits de culture de tissus inférieurs où ils se fixent pour la détection par BLI. Dans la seconde méthode de migration des cellules de cancer du sein sont ensemencées sur les surfaces extérieures inférieures, de membranes d&#39;insert Transwell. des fragments de tissu osseux sont placées dans les cupules d&#39;insertion et les cellules de cancer du sein migrent à travers les membranes à coloniser les fragments d&#39;os (comme représenté sur la figure 1B), quisont ensuite imagé en utilisant BLI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

L&#39;os est le site le plus courant de métastase de cancer du sein. Même se il est largement admis que le comportement cellulaire influences microenvironnement de cancer, on en sait peu sur les propriétés et comportements de cellules de cancer du sein dans le microenvironnement natif du tissu osseux humain. Nous avons développé des approches pour suivre, de quantifier et de moduler les cellules cancéreuses du sein humain dans le microenvironnement de fragments humains en culture de tissus osseux isolés à partir de têtes fémorales rebut suivants arthroplasties totales de la hanche. En utilisant des cellules de cancer du sein d&#39;ingénierie pour la luciférase et améliorés protéine fluorescente (EGFP) expression vert, nous sommes en mesure de quantifier de façon reproductible les schémas de migration et de prolifération utilisant l&#39;imagerie par bioluminescence (BLI), les interactions cellulaires de piste dans les fragments d&#39;os en utilisant la microscopie de fluorescence, et d&#39;évaluer les cellules mammaires après colonisation par cytométrie de flux. Les principaux avantages de ce modèle sont les suivants: 1) un MicroE de tissu natif, l&#39;architecture intactenvironnement qui comprend les types pertinents de cellules humaines, et 2) l&#39;accès direct à la micro, ce qui facilite quantitative rapide et suivi qualitatif et la perturbation du sein et de cellules osseuses propriétés, les comportements et interactions. Une limitation principale, à l&#39;heure actuelle, la viabilité est finie de fragments de tissus, qui confine la fenêtre d&#39;études de culture à court terme. Les applications du système de modèle comprennent l&#39;étude de la biologie fondamentale du cancer du sein et d&#39;autres tumeurs malignes ostéotropes l&#39;intérieur de la niche métastatique, et le développement de stratégies thérapeutiques pour cibler efficacement les cellules de cancer du sein dans les tissus osseux.

Isoler des fragments de tissus provenant de têtes fémorales Têtes fémorales ont été prélevés sur un nombre égal de patients de sexe féminin (44-90 ans) qui subissent une chirurgie de remplacement total de la hanche élective dans le département de chirurgie orthopédique à l&#39;École de médecine de l&#39;Université Stanford et masculins. Chaque tête fémorale jeté contient une petite portion de la partie supérieure du fémur, qui abrite tissu osseux trabéculaire composé ...

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Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Les protocoles sont décrits pour l&#39;étude de la migration des cellules de cancer du sein, de la prolifération et de la colonisation dans un système de modèle d&#39;expiant de tissu osseux humain.

Méthodes pour explants de tissus en culture fémur humain pour étudier le cancer du sein cellulaire colonisation de la Niche métastatique

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K vues.  Stanford University School of Medicine.  Les protocoles sont décrits pour l'étude de la migration des cellules de cancer du sein, de la prolifération et de la colonisation dans un système de modèle d'expiant de tissu osseux humain. 

Vidéo: Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Méthode pour le développement de nouveaux médicaments anti-cancer en utilisant des explants des tumeurs des spécimens chirurgicaux


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

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Médecine

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Une In Vitro Système d&#39;étude dormance tumorale et le commutateur à la croissance métastatique

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

L&#39;homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l&#39;étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

L&#39;utilisation des puces à protéines de phase inversée (RPPA) Variation à explorer l&#39;expression des protéines dans les cancers à cellules rénales individuels

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Initiation de carcinome du sein métastatique en ciblant de l&#39;épithélium canalaire avec adénovirus Cre: un modèle de souris transgénique roman du cancer du sein

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profilage de microARN œstrogène réglementés dans les cellules du cancer du sein

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Trois Cultures dimensionnelles: un outil pour étudier l&#39;architecture normale Acinaire vs transformation maligne des cellules mammaires

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...