Nous remercions Chuck Scott et Victor McKnight de la CBS Scientific Company Inc. ( <a href="http://www.cbsscientific.com/" target="_blank">www.cbsscientific.com</a> ) pour l&#39;assistance technique et la fabrication de la chambre 3D, l&#39;unité d&#39;échange de gaz et inserts. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (subventions R21DK067084 et R43CA141782 à SKK).

1. Préparer les insertions supérieures et inférieures pour la croissance cellulaire en collagène Coating <ol><li> Calculer le nombre de plaquettes nécessaires pour l&#39;expérience. Placez chaque insert dans une boîte de Pétri stérile séparée (35 x 10 mm) et stériliser par irradiation (11 Gy). </li><li> Préparer la solution de collagène pour le revêtement de membranes: 50 pg / ml, 154 pi par insert (insérer Surface 1,54 cm 2). </li><li> Placez quelques gouttes (~ 20 pi par goutte) de solution de collagène dans un cercle sur la surface de la membrane d&#39;insertion (ne laissez pas la pointe de la pipette toucher la surface), puis ajouter délicatement le reste de l&#39;aliquote pour former une forte baisse sur le surface de la membrane. S&#39;assurer que la solution de collagène reste hémisphérique et ne s&#39;écoule pas à partir de la surface de la membrane. </li><li> Couvrir le plat de Pétri avec un couvercle et incuber pendant 1 heure à température ambiante sur une surface plane. </li><li> Aspirer la solution de collagène et laver la membrane une fois en couvrant avec 160 pi de PBS. </li><li> Aspirate le PBS et remettre le couvercle. Si vous utilisez le même jour, placez la boîte de Pétri dans un endroit sec à température ambiante. Sinon, placez le plat à 4 ° C et utiliser l&#39;insert dans les 7 jours. </li></ol> 2. Culture cellules endothéliales sur les inserts supérieurs <ol><li> Préparer suspension CE dans le milieu de culture souhaitée. Assurez-vous que la viabilité cellulaire est&gt; 98% et l&#39;utiliser immédiatement. </li></ol> Note: Pour veine ombilicale humaine CE (HUVEC), 4 x 10 5 cellules dans 160 ul par insert est utilisé. <ol start="2"><li> Prenez les boîtes de Pétri avec des inserts revêtus de collagène préparés à la section 1, ne pas retirer les inserts de la vaisselle. Placez quelques petites gouttes de la suspension cellulaire (environ 20 pi par goutte) dans un cercle sur la surface de la membrane enduite de collagène (ne pas laisser la pointe de la pipette contact de la surface), puis ajouter délicatement le reste de la suspension de cellules pour former une forte baisse. Assurez-vous que la suspension cellulaire reste hemis<html> pherical et ne s&#39;écoule pas à partir de la surface de la membrane. </li><li> Remplacer les couvercles et placer soigneusement les plats dans un 5% de CO 2 incubateur de culture cellulaire et incuber (sans agitation) à 37 ° C pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de se fixer sur la membrane. </li><li> Ajouter lentement 5 ml de milieu de culture de chaque boîte de Petri en sorte que l&#39;insert reste sur le fond de la boîte et est complètement recouvert par le support. Remplacer les couvercles et placer soigneusement les plats de retour dans l&#39;incubateur. Culture des cellules à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Utilisez la même méthode pour préparer le second (facultatif) insert inférieur avec des cellules qui représentent le micro-environnement local, qui sera placée sous l&#39;insert contenant la couche CE. </li></ol> Remarque: si les inserts inférieurs sont inclus dans les expériences, les inserts supérieurs et inférieurs sont d&#39;abord reliés les uns aux autres avant de placer les inserts dans le dispositif 3D (figure 4B). e &quot;&gt; 3. Assemblez la chambre d&#39;écoulement périphérique 3D <ol><li> Visser les plaques supérieure et inférieure, connecter les plaques de l&#39;unité d&#39;échange de gaz en utilisant un tube, placer le dispositif assemblé dans un sac en plastique propre, et stériliser le sac et son contenu par irradiation (11 Gy). </li><li> Enlevez un plateau-plateau de l&#39;incubateur de culture cellulaire, la placer dans une hotte de culture de tissus stériles, pulvérisation avec de l&#39;éthanol à 70%, essuyer, puis recouvrir le plateau avec une grande serviette stérile. </li><li> Placez le sac en plastique irradié dans le capot, retirez le périphérique dans le sac et le placer sur le plateau incubateur stérile. Connecter le dispositif à la pompe péristaltique avec la tubulure prévue. Programme de la pompe pour une vitesse optimale de 0,2 ml / min. </li></ol> Remarque: Pour raccorder la pompe à la prise de courant, extruder le cordon électrique à travers le trou dans la face arrière de l&#39;incubateur. Utilisez fiche de voleur autour du cordon afin de s&#39;assurer que le trou est hermétique. <ol start="4"><li&gt; La place 5-7 ml de milieu de culture désirées dans un tube stérile 15 ml (pour le &quot;entrée&quot;). </li></ol> 4. Premier de la chambre d&#39;écoulement périphérique 3D <ol><li> Déconnecter la tubulure d&#39;entrée de la prise en tirant l&#39;aiguille métallique de la tubulure (utiliser de petites serviettes stériles pour maintenir la stérilité de la tubulure). Utilisation de l&#39;aiguille métallique reliée à la tubulure en tant que &quot;entrée&quot; et l&#39;extrémité coupée du tube en tant que &quot;sortie&quot;. Placez l&#39;entrée de l&#39;aiguille métallique dans le tube de 15 ml avec les médias; placer la sortie dans le tube de vide ml 15. </li><li> Mettre la pompe de sorte que le flux est réglé dans le sens antihoraire et la vitesse d&#39;écoulement de 0,2 ml / min. Permettre à la pression négative pour attirer le fluide à partir du tube d&#39;admission de 15 ml dans le tube et d&#39;arrêter la pompe lorsque le support atteint la fin du tube immédiatement avant qu&#39;il se connecte à l&#39;appareil (figure 2, arrêt n ° 1). </li><li> Dévisser les plaques supérieure et inférieure de l&#39;appareil. Retirez délicatement la plaque supérieure et le lieu 1,500 - 1,550 l de médecineUM (soit le milieu seul ou en plus des chimiokines expérimentales) dans les puits inférieurs. Vérifiez que le support contient également suffisant pour former une demi-sphère qui atteint environ 1 - 2 mm au-dessus de la plaque inférieure. </li><li> Transférer l&#39;insert préparé à partir de la boîte de Petri dans les puits de la plaque inférieure à l&#39;aide des pinces stériles, en s&#39;assurant qu&#39;aucune bulle sont piégés sous les inserts. Aspirer tout support qui apparaît sur la surface de la plaque inférieure de sorte que la plaque reste sèche. Placer la plaque supérieure en arrière sur la plaque inférieure et re-connecter les plaques à l&#39;aide des vis. </li><li> Tournez immédiatement à la pompe péristaltique et permettre au milieu de circuler à travers le dispositif 3D. Élever l&#39;extrémité de sortie du dispositif et de maintenir la chambre dans cette position, pour empêcher la formation de bulles à l&#39;intérieur de l&#39;espace entre les plaques. </li><li> Laisser le milieu de remplissage de la chambre et la tubulure reliant la chambre à l&#39;unité d&#39;échange de gaz. Arrêtez immédiatement la pompe avant que le milieu atteigne le gaz eunité de Xchange (Figure 2; Arrêt n ° 2). Placer 3 ml de milieu dans l&#39;unité d&#39;échange de gaz, tourner sur la pompe, et de permettre aux bulles d&#39;air de s&#39;échapper à travers l&#39;unité d&#39;échange de gaz. Élever l&#39;unité d&#39;échange de gaz pour permettre au moyen de remplir le tube sortant de l&#39;unité d&#39;échange de gaz et d&#39;arrêter la pompe lorsque le produit arrive jusqu&#39;à 2-3 cm avant la fin de la tubulure de sortie (figure 2, l&#39;arrêt # 3). </li><li> Connecter l&#39;aiguille métallique entrée vers la sortie à l&#39;aide de petites serviettes stériles. Reprogrammer la pompe de sorte que les flux de fluide dans le sens inverse (sens horaire) vers l&#39;unité d&#39;échange de gaz et d&#39;assurer toutes les bulles d&#39;air sont éliminées une fois qu&#39;ils atteignent l&#39;unité d&#39;échange de gaz. Vérifiez qu&#39;aucune bulle d&#39;air dans le système. </li><li> Reprogrammer la pompe de sorte que le fluide circule dans le sens antihoraire. Ajouter 100 pl de la suspension cellulaire de test à l&#39;unité d&#39;échange de gaz. Fermer le couvercle de l&#39;unité d&#39;échange de gaz, placer le plateau avec l&#39;arrière du système de travail dans l&#39;incubateur, et permettent aux cellules de test pour circulantdans le dispositif électronique 3D à 37 ° C pendant le temps souhaité. </li></ol> Remarque: Nettoyer le cordon électrique de la pompe à l&#39;éthanol 70% et le placer à l&#39;intérieur de l&#39;incubateur. 5. Mettre fin à l&#39;essai et de recueillir des échantillons pour essai <ol><li> Retirez le plateau avec le système de travail de l&#39;incubateur et le placer dans la hotte. Arrêter la pompe, débrancher l&#39;entrée et à la sortie, et placez les extrémités dans vides stériles tubes de 15 ml. </li><li> Mettre la pompe et recueillir la suspension de cellules à partir du système; lieu de la suspension cellulaire sur de la glace, le cas échéant, jusqu&#39;à son utilisation. </li><li> Démonter la chambre en retirant les vis et soulevant la plaque supérieure. Retirer les inserts de la plaque inférieure et les transférer sur des boîtes de Pétri. </li></ol> Note: Les inserts peuvent être colorées de visualiser et de compter les cellules in situ (cristal violet 0,05% en dH 2 O) ou la trypsine pour recueillir la CE pour de plus amplestest. <ol start="4"><li> Retirez le support et les cellules des puits inférieurs dans des tubes et centrifuger pendant 5 min à 210 x g. Retirer le surnageant, laver et remettre en suspension les cellules comme souhaité, et traiter les cellules selon les objectifs expérimentaux spécifiques (voir plus loin). </li></ol>

<ol>
	<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+perils+of+stem+cell+therapeutics.">The promise and perils of stem cell therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).</li><li>Khaldoyanidi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+stem+cell+homing.">Directing stem cell homing.</a> Cell Stem Cell. 2, 198-200 (2008).</li><li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+trafficking+in+tissue+development,+growth,+and+disease.">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132, 612-630 (2008).</li><li>Lapidot, T., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain-bone-blood+triad:+traffic+lights+for+stem-cell+homing+and+mobilization.">The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).</li><li>Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoengineering+of+HCELL,+the+human+bone+marrow+homing+receptor:+sweetly+programming+cell+migration.">Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).</li><li>Smart, N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+movement.">The stem cell movement.</a> Circ. Res. 102, 1155-1168 (2008).</li><li>Khaldoyanidi, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDA-MB-435+human+breast+carcinoma+cell+homo-+and+heterotypic+adhesion+under+flow+conditions+is+mediated+in+part+by+Thomsen-Friedenreich+antigen-galectin-3+interactions.">MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions.</a> J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).</li><li>Le Devedec, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Intravital+Multicolour+Imaging+to+Study+Metastatic+Behaviour+of+Cancer+Cells+in+vivo.">Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo.</a> Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).</li><li>Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+vascular+endothelium+to+shear+stress:+potential+role+of+ion+channels+and+cellular+cytoskeleton+(review).">Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review).</a> Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).</li><li>Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cellular+response+to+altered+shear+stress.">Endothelial cellular response to altered shear stress.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).</li><li>Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+force+and+its+effect+on+cell+structure+and+function.">Shear force and its effect on cell structure and function.</a> ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).</li><li>Topper, J. N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+and+vascular+gene+expression:+fluid+shear+stress+as+a+modulator+of+endothelial+phenotype.">Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype.</a> Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).</li><li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions.">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).</li><li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemokine+functions+in+lymphocyte+migration+through+vascular+endothelium+under+shear+flow.">Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow.</a> J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels:+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1.">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+source+determines+human+hematopoietic+progenitor+distribution+pattern+within+the+CD34(+)+compartment.">Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment.</a> Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).</li><li>Fuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+as+a+preferable+source+of+stem+cells+for+salvage+transplantation+in+patients+with+graft+failure+after+cord+blood+transplantation:+a+retrospective+analysis+of+the+registry+data+of+the+Japanese+Society+for+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).</li><li>Haspel, R. L., Miller, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+source+matters.">Hematopoietic stem cells: source matters.</a> Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).</li><li>Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+and+C5a+are+chemotactic+factors+for+human+mesenchymal+stem+cells,+which+cause+prolonged+ERK1/2+phosphorylation.">C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation.</a> J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).</li></ol>

Cascade LifeSciences Inc. possède les droits exclusifs de brevet n ° US 7,927,867 B2 &quot;Dispositif d&#39;évaluation dans la migration cellulaire in vitro dans des conditions d&#39;écoulement et les méthodes de leurs usages». SKK est un inventeur de la technologie de l&#39;appareil de la chambre de flux 3D et un co-fondateur scientifique et actionnaire de Cascade LifeSciences Inc.

extravasation des cellules est le processus par lequel les cellules circulantes quittent la circulation sanguine et est une composante essentielle de nombreuses réactions physiologiques dans l&#39;organisme. Le processus est aussi important pour la régénération des tissus, comme par exemple, lorsque les cellules thérapeutiques mobilisés à partir de tissus dans les vaisseaux sanguins (ou injecté par voie intraveineuse) migrent à travers le système vasculaire et sortent de la circulation sur les sites de blessure ou de dégénérescence. Extravasation est également une composante essentielle de la pathogenèse de nombreuses maladies, y compris l&#39;inflammation, le rejet immunitaire, l&#39;auto-immunité, et la métastase des tumeurs. Extravasation est un processus à plusieurs étapes complexe qui implique l&#39;interaction de cellules avec des cellules endothéliales (EC) circulant dans des conditions d&#39;écoulement physiologique. Le procédé consiste à (a) de roulement de la cellule, (b) l&#39;adhésion ferme à la surface luminale des CE, et (c) la transmigration à travers la CE. Surtout, chaque étape de la cascade d&#39;extravasation est régulée par un sous-ensemble de cell spécifique au type et des molécules spécifiques à l&#39;espèce. Cependant, les mécanismes moléculaires détaillées qui régissent l&#39;extravasation des sous-ensembles de cellules spécifiques sont pas bien comprises, en grande partie en raison de la difficulté technique de rappeler les conditions dans le sang. Le dispositif 3D roman décrit ici est conçu pour surmonter ces défis techniques et permettre d&#39;effectuer des essais qui permettront d&#39;améliorer notre compréhension de la biologie de la migration cellulaire. Les molécules qui interviennent dans la migration cellulaire sont des cibles thérapeutiques importantes. Une compréhension détaillée des événements moléculaires qui contrôlent la migration des types cellulaires spécifiques aidera à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la promotion ou l&#39;inhibition de l&#39;extravasation. Par exemple, les interventions qui améliorent la migration des cellules souches thérapeutiques (qu&#39;elles dérivent de tissus fœtaux adultes, néonatale ou même d&#39;) vers des sites de lésion ou de la dégénérescence serait d&#39;une grande utilité dans la régénération tissulaire.Il ya un intérêt croissant pour la production in vitro de cellules souches thérapeutiques, y compris les cellules dérivées de sources pluripotentes, et dans des cellules ex vivo manipulés souches adultes (élargi, manipulé génétiquement et prétraité avec différentes enzymes) 1. Ainsi, il existe un besoin pour de nouvelles technologies à évaluer la qualité des cellules souches avant qu&#39;ils ne soient utilisés à des fins thérapeutiques. Parmi les autres paramètres, les cellules doivent être en mesure de sortir efficacement la circulation, car les traitements pour les troubles multifocales peuvent nécessiter une administration intraveineuse des cellules souches 2. En effet, l&#39;un des défis actuels de la biologie des cellules souches est de remédier à la très faible efficacité avec laquelle les cellules souches maison aux sites des lésions tissulaires 3-6, soulignant la nécessité de combler cette lacune dans notre compréhension de la migration des cellules souches. En revanche, les stratégies que la migration des cellules de bloc en ciblant des molécules spécifiques homing serait utile pour le traitement de l&#39;enmaladies inflammatoires et auto-immunes ainsi que le cancer métastatique. Ainsi, la compréhension des mécanismes moléculaires qui interviennent dans les interactions entre les cellules circulantes et la CE au cours de la migration cellulaire et extravasation est pertinent pour la médecine translationnelle et la découverte de médicaments ainsi que de la science fondamentale. Il ya actuellement un certain nombre de méthodes disponibles pour étudier les différents aspects de la migration cellulaire. Cependant, ces méthodes présentent des inconvénients qui peuvent être surmontés avec le nouveau dispositif 3D. Les modèles animaux: Les modèles animaux, tels que des souris immunodéprimées et les souris génétiquement manipulées, ont été des outils utiles pour étudier la migration des cellules humaines in vivo. Cependant, un inconvénient important pour ces modèles est que les cellules humaines interagissent faiblement avec les molécules d&#39;adhésion présentes sur les souris CE, en partie à cause des différences de séquences spécifiques d&#39;espèces dans de nombreuses molécules de surface cellulaire. Ainsi, l&#39;utilisation des rongeurs pour étudiermigration cellulaire humaine est peu susceptible de refléter authentiquement les événements de lits vasculaires spécifiques d&#39;organes humains. En outre, dans des modèles in vivo ne sont pas adaptés pour le criblage à haut débit de candidats-médicaments. Le classique des modèles in vivo à l&#39;aide d&#39;étudier cellule homing ne discriminent pas entre les différentes étapes de la cascade d&#39;extravasation, il est difficile d&#39;identifier et de cibler de nouvelles molécules à tête chercheuse. L&#39;approche de microscopie intravitale a été développé pour répondre à ce besoin et a été instructif, mais cette technique demande beaucoup de temps et de main-d&#39;œuvre 7,8. Dosages de transmigration statiques: Transwell ou Boyden chambre essais migration des cellules de mesure à travers une membrane poreuse et sont largement utilisés dans les études sur la migration. Le test a l&#39;avantage qu&#39;il peut être utilisé pour étudier non seulement la motilité cellulaire et la matrice des interactions cellule-extracellulaire (MEC), mais aussi la migration chimiokine médiée par des cellulesà travers une monocouche CE cultivées sur des membranes poreuses. Malheureusement, le phénotype et la fonction des CE dans des conditions statiques diffèrent sensiblement de ceux sous flux physiologique 9,10. Ainsi, les événements chimiotactiques qui se produisent dans des dosages TRANSWELL ne fidèlement imiter les interactions entre les cellules migrantes et des CE au titre de la contrainte de cisaillement. En outre, l&#39;étape de «roulement» de la cascade homing, ce qui ajoute une dimension supplémentaire de la sélectivité à l&#39;ensemble du processus, ne se produit pas dans des essais statiques TRANSWELL. Ainsi, alors que cette technologie ne permettra l&#39;évaluation quantitative de la migration cellulaire chimiokine induite à travers la monocouche CE, elle est limitée par son incapacité à fournir la contrainte de cisaillement qui imite le flux sanguin in vivo. Des essais sous contrainte de cisaillement: Mur contrainte de cisaillement est connue pour jouer un rôle important dans la régulation de la fonction CE 9,10. Les forces de cisaillement induisent une activation rapide des cascades de signalisation, transcLes facteurs de Ription, et l&#39;expression différentielle des gènes dans l&#39;affaire CE 11,12. Cette information a conduit au développement de la prochaine génération de tests d&#39;adhésion - chambres à flux laminaire parallèles et capillaires - étudier roulement et l&#39;adhérence des cellules à la CE dans des conditions de contrainte de cisaillement 7,13. Le facteur limitant pour ces tests est qu&#39;ils peuvent mesurer seulement de roulement et l&#39;adhérence, mais ne fait pas de différence entre une cellule adhérente qui irait à transmigrer et une cellule adhérente qui est «arrêté» sur la monocouche CE et ne serait pas transmigrer. De plus, ces tests ne peuvent pas mesurer la migration des cellules vers un gradient de chimiokine. Plusieurs rapports ont décrit la capacité des cellules adhérentes à ramper sous une monocouche CE cultivées sur des lames de verre dans des conditions d&#39;écoulement 14. Les limites de cette technique ramper comprennent: il analyse seulement un nombre limité de cellules, c&#39;est non quantitative, il analyse cellulaire rampant sur la matrice et celL surface mais pas la migration vers un gradient chimiotactique, et il ne permet pas aux cellules transmigré à être isolés. Ainsi, bien que ce test a l&#39;avantage de l&#39;application de la contrainte de cisaillement à la monocouche CE, il ne peut pas quantifier la migration des cellules vers un gradient de chimiokine. La technologie 3D roman décrit ici surmonte un grand nombre de ces lacunes en combinant la force de cisaillement (compartiment supérieur) avec un gradient de chimiokine statique (compartiment inférieur) et permet une évaluation quantitative de chaque étape de la cascade d&#39;extravasation (Figure 1). Le dispositif peut également être utilisé pour étudier comment la diaphonie entre la CE et le microenvironnement influe sur la capacité de la CE à soutenir extravasation des cellules circulantes. Le protocole suivant décrit la méthode étape par étape pour l&#39;utilisation du dispositif de chambre de flux 3D.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8)</td>
 <td>Watson-Marlow Limitid</td>
 <td>981.0142.000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3D Chamber</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FC-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gas exchange unit</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FCR-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inserts</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FCI-1005U</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagen Bovine,Type I</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354231</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric Acid 0.1M</td>
 <td>VWR</td>
 <td>BDH3200-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14190</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HUVEC</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC- 2517</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGM Bullet Kit (cc - 3121 &#38; cc - 4133)</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC - 3124</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin Neutralizing Solution</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5012</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5024</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDF-1</td>
 <td>R7D System</td>
 <td>460-SD</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extracel Trial 2.5 Kit</td>
 <td>Glycosam Byosystems</td>
 <td>GS211</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibronectin, human , nature</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>356008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>A-003-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BD Matrigel</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354277</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
 <td>ScienCell</td>
 <td>1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells</td>
 <td>ScienCell</td>
 <td>1001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypan Blue</td>
 <td>StemCells Tecnologies</td>
 <td>7050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TNF-alfa, 10 &mu;g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>PHC3015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC</td>
 <td>Southern Bioteck</td>
 <td>9519-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium Iodide Staining Solutuion</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td># 556463</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Frozen Human Cord Blood CD34+ cells</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>CB007F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Frozen Human Cord Blood CD34+ cells</td>
 <td>Zenbio</td>
 <td>SER - CD34-F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MethoCult GF M3434</td>
 <td>StemCells Tecnologies</td>
 <td>GFM3434</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse Methylcellulose complete media</td>
 <td>R&#38;D</td>
 <td>HSC007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Von Willibrand Factor antibody</td>
 <td>abcam</td>
 <td>C# ab11713</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petry dish (35 x 10 mm)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>CA25373-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>VWR Fisher</td>
 <td>21008 - 918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture flasks 75cm2</td>
 <td>VWR</td>
 <td>BD353136</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cristal violet</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C-3886-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting forceps, curved</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-384</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,000 &mu;l Pipette tips</td>
 <td>VWR</td>
 <td>83007-380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 - 200 &mu;l Pipette tips</td>
 <td>VWR</td>
 <td>37001-530</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Watson-Marlow Limitid</td>
 <td>403U/VM3</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a novel three-dimensional flow chamber device to study chemokine-directed extravasation of cells circulating under physiological flow conditions

L&#39;extravasation des cellules du sang circulant joue un rôle central dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques, y compris les cellules souches métastases homing et de la tumeur. Le dispositif de chambre écoulement tridimensionnel (ci-après le dispositif 3D) est une nouvelle technologie in vitro qui reproduit la contrainte de cisaillement physiologique et permet à chaque étape de la cascade de l&#39;extravasation des cellules à quantifier. Dispositif 3D consiste en un compartiment supérieur dans lequel les cellules d&#39;intérêt circulent sous contrainte de cisaillement, et un compartiment inférieur de puits statiques qui contiennent des facteurs chimiotactiques d&#39;intérêt. Les deux compartiments sont séparés par des inserts poreux revêtu d&#39;une monocouche de cellules endothéliales (EC). Un second insert en option avec les cellules du microenvironnement d&#39;intérêt peut être placé immédiatement sous la couche CE. Un appareil d&#39;échange de gaz permet à l&#39;optimal tension de CO 2 pour être maintenu et fournit un point d&#39;accès pour ajouter ou retirer des cellules ou des composés au cours de l&#39;expérience. Les cellules de test circulent dans le compartiment supérieur à la contrainte de cisaillement souhaitée (débit) contrôlée par une pompe péristaltique. A la fin de l&#39;expérience, les cellules circulantes et migré sont collectés pour des analyses plus poussées. Le dispositif 3D peut être utilisé pour examiner cellule rouler sur et l&#39;adhésion à la CE sous la contrainte de cisaillement, transmigration en réponse aux gradients de chimiokines, la résistance au cisaillement, la formation de grappes, et la survie cellulaire. En outre, le second insert en option permet des effets de diaphonie entre la CE et les cellules du microenvironnement à examiner. Les applications de translation du dispositif 3D comprennent des tests de médicaments candidats que la migration de la cellule cible et prédire le comportement in vivo des cellules après injection intraveineuse. Ainsi, le dispositif de 3D roman est un outil polyvalent et peu coûteux d&#39;étudier les mécanismes moléculaires qui interviennent dans extravasation cellulaire.

La moelle osseuse murine dérivée ligne CE STR-12 a été cultivé sur des plaquettes avec des pores de 5 um. Le taux de croissance CE a été contrôlée au microscope lors que la CE était de 100% de confluence, les inserts ont été transférés dans les puits dans le compartiment inférieur de l&#39;appareil 3D. Immédiatement avant de placer les inserts, les puits de la compartiment inférieur ont été remplis de milieu de culture seul (témoin négatif) ou avec un milieu additionné de stroma dérivée de cellules facteur-1 (SDF-1, 5 ng / ml et 50 ng / ml). Par la suite, le dispositif 3D a été assemblé et la chambre était remplie de fluide tel que décrit dans le protocole. Les cellules d&#39;essai doit être diffusé dans le compartiment supérieur de l&#39;appareil ont été fraîchement récoltées cellules de la moelle osseuse murine (3,5 x 10 6 cellules par chambre). Une contrainte de cisaillement défini de 0,8 dyn / cm 2 est appliquée en réglant le débit de la pompe péristaltique à 0,2 ml / min. Le système de travail ensemble est ensuite placé dans le 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C et la CElls ont été autorisés à circuler et d&#39;interagir avec la monocouche CE pendant 4 heures. Au bout de ce temps, les cellules circulantes ont été prélevés, la chambre a été démonté, et les inserts ont été retirés, comme décrit dans le protocole. Les cellules transmigré ont été récoltés dans les puits inférieurs, lavées, remises en suspension dans un milieu frais, et transférés aux cultures de méthylcellulose complétées par des facteurs de croissance hématopoïétiques pour cellulaire (CFC) essai de formation de colonies (figure 3). Comme prévu, nous avons trouvé un nombre significativement plus élevé de CFC avait migré à travers la monocouche CE dans les puits contenant 50 ng / ml SDF-1 que de puits contenant 5 ng / ml SDF-1 ou milieu seul. Comme nous l&#39;avons décrit précédemment, aucun des cours en techniques in vitro disponibles pour étudier la migration des cellules sont capables de tester l&#39;effet du micro-environnement local sur la capacité de la CE à soutenir extravasation des cellules migrantes. Pour illustrer comment cela peut être réalisé avec le dispositif 3D, nousextravasation examiné de cellules hématopoïétiques circulant à travers une couche de CE et d&#39;une couche de cellules stromales de la moelle osseuse. Pour cela, un deuxième insert (en bas) contenant une couche de cellules stromales est juxtaposée à la pièce supérieure contenant la monocouche CE dans la plaque inférieure (figure 4). L&#39;expérience a ensuite été réalisée comme décrit ci-dessus et les cellules transmigré ont été récoltées à partir des puits et comptés. Les résultats ont démontré que l&#39;insertion d&#39;une couche supplémentaire de cellules stromales sous la monocouche CE augmenté de façon significative la migration des cellules hématopoïétiques vers SDF-1 (figure 4). Ce résultat est cohérent avec l&#39;idée que le micro-environnement local contribue au recrutement de cellules circulant dans le tissu. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1.jpg" /> <strong&gt; Figure 1. Dispositif de chambre de flux 3D. A: Le dispositif 3D scellé hermétiquement est composé de deux compartiments séparés par une membrane poreuse jetable (PM). CE sont cultivés sur la membrane, qui forme alors une barrière entre les compartiments supérieur et inférieur. Des contraintes de cisaillement déterminées sont appliquées au compartiment supérieur du dispositif 3D par médias perfuser à l&#39;aide d&#39;une pompe péristaltique de perfusion constante. Cellules circulantes sont soit sans interaction (NIC), d&#39;interagir avec la CE transitoire (&#39;roll »; RC), ou adhérer à la CE (AC). Une sous-population de cellules adhérentes transmigre à travers la couche de la CE au compartiment statique inférieure du dispositif (TM) B:. Une vue de dessus dessin (panneau supérieur) du dispositif 3D. La vue en coupe horizontale (panneau inférieur) montre la position de la membrane supérieure (rouge), la membrane inférieure (vert) et le fond du puits (bleu) C:. L&#39;isometric vue illustre les parties intégrantes du dispositif: quatre vis, un bloc acrylique haut, un joint de la chambre haute, supérieure et membranes inférieures, en bas o-ring, et un bloc de fond acrylique 3 et D:. une photographie de l&#39;écoulement 3D chambre reliée à une pompe péristaltique et d&#39;une unité d&#39;échange de gaz. Le système est assemblé dans une hotte stérile, puis transféré dans un incubateur de culture cellulaire. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2.jpg" /> Figure 2. Une représentation schématique du système de dispositif 3D. Le dessin montre les trois arrêts nécessaires pour assembler le système. Le milieu de culture est aspiré à partir de l&#39;orifice d&#39;entrée par la pression négative créée par la pompe péristaltique. L&#39;écoulement du fluide est coupée par arrêt N ° 1 pour permettre aux inserts d&#39;être placés dans l&#39;appareil. Après la chambre est fermée, la pompe est Switched en marche et l&#39;enceinte est aussitôt remplie d&#39;un fluide pour empêcher le séchage des cellules cultivées sur les inserts. Arrêt n ° 2 permet milieu pour être placé dans l&#39;unité d&#39;échange de gaz. Arrêter ° 3 permet l&#39;écoulement soit arrêté pour la connexion de l&#39;entrée et la sortie. Le flux peut être orienté dans une direction dans le sens horaire ou anti-horaire pour éliminer les bulles d&#39;air à travers l&#39;unité d&#39;échange de gaz à l&#39;aide d&#39;un interrupteur situé sur la pompe. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3.jpg" /> Figure 3. Le dispositif 3D supporte transmigration SDF-1 médiée par des progéniteurs hématopoïétiques dans des conditions de contrainte de cisaillement physiologique. A: Trois dispositifs (contenant chacune trois puits dans le compartiment inférieur) ont été assemblés et fonctionnent en parallèle. Medium seul ou milieu contenant SDF-1 à 5 ou 50 ng / ml ont été ajoutés aux puits compartiment inférieur. Murin bocellules de la moelle NE ont été autorisés à circuler dans les dispositifs de 4 heures. Par la suite, chaque appareil a été démonté et les cellules qui avaient transmigré vers SDF-1 (jaune) ont été recueillies à partir des puits inférieurs, compté, et cultivé dans de la méthylcellulose complétée par des facteurs de croissance hématopoïétiques (GF). Quatorze jours plus tard, les colonies ont été marqués sous le microscope B:. Le nombre de progéniteurs (cellules formant des colonies, CFC) récupérée à partir des compartiments inférieurs est montré en moyenne ± SD de trois puits par condition. * P &lt;0,05. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;effet du microenvironnement sur ​​les interactions entre les cellules hématopoïétiques et des cellules endothéliales. A: L&#39;illustration montre la position d&#39;une seconde membrane poreuse avec st culturefibroblastes romal (SF) sous la membrane supérieure avec la CE. D&#39;autres abréviations sont comme décrit pour la figure 1A B:.. L&#39;membrane supplémentaire (insert inférieur) avec SF culture a été inséré sous la membrane supérieure C: Trois dispositifs (contenant chacun 3 puits) ont été exécutés en parallèle. Medium seul ou milieu contenant SDF-1 à 50 ng / ml SDF-1 a été ajouté aux puits de compartiment inférieur. Les chambres de commande négatives omises SC, SDF-1, ou les deux. les cellules de la moelle osseuse ont été autorisés à circuler pendant 4 heures à 37 ° C. Par la suite, chaque appareil a été démonté et les cellules transmigré ont été recueillies à partir des puits de compartiment inférieur et compté. Le nombre de cellules transmigré récupérés est présenté comme la moyenne ± SD de trois puits par condition. * P &lt;0,05.

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A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Dispositif de chambre de flux en trois dimensions est une nouvelle<em&gt; In vitro</em&gt; Technologie pour l&#39;évaluation quantitative et progressive de la cascade de l&#39;extravasation des cellules circulantes dans des conditions de contrainte de cisaillement physiologique. Le dispositif vient donc combler un besoin critique pour les études de base, préclinique, clinique et de la migration cellulaire.

A Novel tridimensionnelle chambre d&#39;écoulement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions d&#39;écoulement physiologiques

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K vues.  Torrey Pines Institute for Molecular Studies. Dispositif de chambre de flux en trois dimensions est une nouvelle In vitro Technologie pour l'évaluation quantitative et progressive de la cascade de l'extravasation des cellules circulantes dans des conditions de contrainte de cisaillement physiologique. Le dispositif vient donc combler un besoin critique pour les études de base, préclinique, clinique et de la migration cellulaire.

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

La peau Three-Dimensional Human Reconstruire Modèle: un outil pour étudier la peau normale et la progression du mélanome

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Recherche

Bio-ingénierie

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Impression Planar et en trois dimensions des encres conductrices

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Chambre de circulation à plaques parallèles et de circuit d&#39;écoulement continu pour évaluer les cellules progénitrices endothéliales en cisaillement du flux laminaire

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Tridimensionnelle modèle de culture cellulaire pour mesurer les effets de l&#39;écoulement des fluides interstitiels sur l&#39;invasion tumorale

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Étude de la séparation d’écoulement tridimensionnelle induite par un polype de pli vocal modèle

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Fabrication de tissus de cartilage humain en utilisant trois dimensions jet d&#39;encre Technologie d&#39;impression

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Évaluer les interactions de leucocytes-endothélial dans des conditions d&#39;écoulement dans un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Chambre Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

Modèle in vitro de physiologiques et pathologiques Blood Flow avec application aux enquêtes de cellules vasculaires Rénovation

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

Double Emulsion génération utilisant un flux focus périphérique (PDMS) Co-axial

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Développement d&#39;un modèle organotypique multicellulaire en trois dimensions de la muqueuse intestinale humaine Grown Sous microgravité

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...