La transmigration des lymphocytes est une caractéristique importante de toute réponse immunitaire. Par conséquent, ce protocole est significatif parce qu’il permet à un chercheur d’évaluer la mobilité des lymphocytes dans un système in vitro bien défini. Le principal avantage de cette technique est que diverses chimiokines peuvent être évaluées pour déterminer leur efficacité d’induire la migration dans les cellules récemment définies, telles que le groupe deux cellules lymphoïdes innées, ou ILC2.
Un deuxième avantage est que les inhibiteurs ou les thérapies biologiques visant à bloquer certaines voies de chimiokine peuvent être testés par cette méthode avant de faire des expériences plus coûteuses avec des animaux. Commencez par exciser les poumons et la rate des souris mâles et femelles euthanasiées traitées aux ovules à l’aide de deux à trois animaux par groupe. Placer les tissus excisés dans des tubes de dissociation séparés selon le type de tissu et le sexe animal.
Placez le tissu pulmonaire dans 500 microlitres de supports de dissociation pulmonaire dans un tube de dissociation, placez le tube dans le dissociateur automatisé des tissus et dissociez-le à l’aide du protocole pulmonaire. Répétez ces étapes pour un total de deux fois. Pour dissocier le tissu de la rate, placez-le dans 500 microlitres de médias RPMI complets dans le dissociateur, puis utilisez le protocole de la rate.
Travaillant dans une armoire de sécurité biologique utilisant la technique stérile à partir de maintenant, filtrez chaque tissu dissocié par une passoire de cellules de 40 micromètres, et recueillez dans des tubes coniques de 50 millilitres. Rincer les tubes de dissociation contenant des homogénéités pulmonaires avec cinq millilitres de supports de dissociation pulmonaire supplémentaires, des tubes contenant des homogénéisations de la rate avec cinq millilitres de RPMI complet, et filtrer leur contenu à travers les filtres utilisés pour leurs tissus correspondants. Pour dissocier davantage le tissu pulmonaire, incuber les homogénéisations pulmonaires pendant 15 à 30 minutes dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.
Ajoutez ensuite cinq millilitres de RPMI complet aux homogénéisations pulmonaires et de la rate, ainsi qu’à la centrifugeuse. Après avoir jeté le supernatant, mélanger les granulés contenant des splenocytes et des cellules pulmonaires du groupe d’animaux du même sexe en un seul tube conique de 50 millilitres. Ajouter 10 millilitres de RPMI complet à chaque tube, et resuspendre.
Déterminer le nombre total de cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé. Réglez les suspensions cellulaires mâles et femelles à 100 millions de cellules par millilitre dans le tampon de séparation, puis ajoutez-les à un tube de polystyrène de cinq millilitres. Après isoler le groupe deux cellules lymphoïdes innées de 2/3 des cellules totales décrites dans le manuscrit, utilisez les cellules restantes pour la procédure d’isolement de cellule T CD4-positive.
Pour commencer l’isolement des lymphocytes T CD4 positifs, ajoutez du sérum de rat à la suspension d’enrichissement des lymphocytes T CD4. Ajouter ensuite un cocktail d’isolement à l’échantillon cellulaire et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Vortex sphères rapides pendant 30 secondes, et ajouter à l’échantillon cellulaire pour atteindre une dilution de 75 microlitres par millilitre.
Mélanger délicatement et incuber pendant 2 1/2 minutes à température ambiante. Garnir les échantillons d’environ deux millilitres de tampon de séparation jusqu’à trois millilitres, placer les tubes de cinq millilitres dans l’aimant de séparation facile de huit chambres et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Puis inclinez l’aimant vers l’avant, et pipette chaque suspension cellulaire dans un tube propre de cinq millilitres.
Ajouter 1,5 millilitres de RPMI sans sérum à chaque tube et centrifugeuse. Versez le supernatant, et resuspendez la pastille cd4-positive de cellule T à 10 millions de cellules par millilitre dans le RPMI sérique-libre. Pour commencer cette partie du protocole, déterminez le nombre d’inserts Transwell nécessaires à l’expérience pour les lymphocytes T ILC2 et CD4 positifs comme décrit dans le manuscrit.
Déplacez doucement les inserts Transwell de trois microns des rangées moyennes d’une plaque de 24 puits vers les rangées supérieure et inférieure de la même plaque de 24 puits avec une pointe de pipette et des mains gantées. Ajouter 500 microlitres de supports migratoires avec CCL17 à 1/3 des puits dans la rangée centrale de la plaque de 24 puits. Ajouter 500 microlitres de supports migratoires avec CCL22 à un autre 1/3 des puits.
Et enfin, ajoutez 500 microlitres de RPMI sans sérum ne contenant aucune chimiokine au dernier tiers des puits. Étiquetez clairement le couvercle de la plaque avec le nom du média de transmigration approprié placé dans les puits du bas. Ensuite, placez les inserts Transwell dans les puits contenant les différents traitements.
Ajouter délicatement 100 microlitres de lymphocytes T CD4 ou ILC2 au puits supérieur de chaque insert, en s’assurant de ne pas mélanger ou pipette la suspension cellulaire de haut en bas dans les Transwells. Étiquetez clairement le couvercle sur la plaque avec le type de cellule placé dans chaque puits, et écrivez la date et l’heure de la journée que les cellules ont été ajoutées. Répétez ce processus à partir de l’enlèvement des inserts Transwell de la plaque jusqu’à ce que toutes les cellules aient été placées dans des inserts Transwell avec des supports.
Une fois que les cellules d’intérêt sont isolées, les étapes les plus importantes sont de garder une trace des chimiokines et des types de cellules qui sont placés dans des puits particuliers, d’ajouter doucement des cellules aux chambres supérieures, et enfin d’éviter tout contact inutile avec la plaque de transmigration pendant l’incubation de 48 heures. Placez délicatement la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et incubez pendant 48 heures, en vous assurant de minimiser le contact avec la plaque pendant la période d’incubation. Après avoir délicatement retiré la plaque de l’incubateur, retirez tous les inserts Transwell des rangées du milieu dans les puits vides juste au-dessus ou au-dessous.
Recueillir les cellules des puits supérieur et inférieur des inserts Transwell dans des tubes étiquetés en haut ou en bas avec CCL17, CCL22 ou médias, avec le type de cellule, et avec le numéro de réplique. Rincez les puits du bas avec 500 microlitres de 1x PBS, recueillez-les dans les tubes correspondants et faites de même pour les puits du haut. Centrifuger les tubes à 378 fois g à température ambiante pendant cinq minutes.
Utilisez une pipette pour enlever délicatement tous les supernatants, puis résuspendez les granulés T et ILC2 avec 50 microlitres de 1x PBS. Après avoir enlevé 10 microlitres de la suspension cellulaire, ajouter 90 microlitres de 0,4% de bleu trypan. Comptez les cellules sur le compteur de cellules automatisé.
Et pour chaque échantillon, enregistrer le pourcentage de viabilité et le nombre de cellules par millilitre, et de déterminer le nombre total de cellules par traitement dans la chambre supérieure et inférieure. Quand l’expression de CCR4 a été évaluée sur les cellules T CD4-positives et ILC2 par cytométrie de flux, il n’y avait aucune différence entre les hôtes masculins et femelles. Cependant, l’expression de CCR4 sur une base par cellule sur ILC2 était plus élevée par rapport aux lymphocytes T CD4-positifs.
Lorsque la chambre inférieure de l’appareil Transwell était remplie de médias de culture cellulaire non traités, de supports contenant du CCL22 ou de supports contenant du CCL17, moins de 14 % des cellules ont migré dans des conditions de contrôle des médias. En réponse au CCL22, les deux types de cellules, qu’ils proviennent d’hôtes mâles ou féminins, ont répondu au CCL22. En outre, CCL22 a induit une migration plus importante que CCL17 chez les hommes ILC2.
D’autre part, CCL17 a induit une migration significative des lymphocytes T CD4 féminins et ilc2 par rapport aux seuls médias. Le traitement de CCL17 n’était pas différent des médias pour les lymphocytes T CD4-positifs masculins ou ilc2 masculins. Dans des conditions sous-optimales, lorsque la plaque avec des cellules CD4 est restée à température ambiante pendant les 24 premières heures, puis s’est déplacée dans l’incubateur, il n’y a pas eu de migration vers CCL22 et CCL17.
En outre, la viabilité des cellules était particulièrement faible pour les cellules de la chambre inférieure, montrant l’importance d’utiliser les températures et les conditions correctes décrites dans ce protocole pour obtenir des résultats optimaux. Une fois la procédure de transmigration terminée, il faut voir une migration importante vers la chimiokine d’intérêt par rapport aux puits de contrôle des médias. S’il n’y a pas de migration significative observée, on peut supposer que la procédure n’a pas fonctionné correctement ou que les lymphocytes ne sont pas sensibles à la chimiokine en question.
Cette technique peut être largement utilisée pour comprendre la migration des lymphocytes lorsque ces lymphocytes ont subi un large éventail de traitements in vivo.
