Recherche présentée dans cette publication a été soutenu par le National Eye Institute des National Institutes of Health sous les numéros d&#39;attribution: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) et P30EY014104. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health. Un soutien supplémentaire a été fourni par le Fonds Massachusetts Lions Eye Research (KMC) et un prix spécial Scholar de la recherche à Prevent Blindness (à KMC).

Toutes les expériences sur les animaux ont été traités conformément à l&#39;Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l&#39;utilisation d&#39;animaux dans ophtalmique et Vision Research, et les directives et règlements énoncés par le Ear Infirmary Comité de protection des animaux Massachusetts Eye et. La veille de l&#39;expérience: 1. Préparation des tubes de la Chambre de débit <ol><li> Pour préparer le côté jugulaire, connectez une cm PE10 tuyaux en polyéthylène à un tube de silicium de 6 cm par 5 cm suivi des tuyaux en polyéthylène. Pour la partie de la carotide, de préparer de manière similaire au côté jugulaire avec l&#39;addition d&#39;un tube en T dans le tube de silicium de 6 cm à environ 1,5 cm de la 1 cm de tubulure en polyéthylène (figure 1A, B). Pour insérer le tube en T, d&#39;élargir le tube de silicium en utilisant une pince fine si nécessaire. </li><li> Branchez une extrémité de 10 cm de tube de silicone pour le capteur de pression puis insérez la fin de la carotide s Tide tube en T dans l&#39;autre extrémité. Vérifiez que la connexion des sites sont serrés et sans fuite. Appliquer une petite pièce rectangulaire de parafilm sur lequel se emboîte le tube, si nécessaire, pour éviter les fuites (figure 1C). </li></ol> 2. Revêtement la Chambre <ol><li> Préparation de la protéine de revêtement de surface endotheliale (par exemple, P-sélectine, molécule d&#39;adhésion intercellulaire-1 (ICAM-1), protéine vasculaire-1 d&#39;adhésion cellulaire (VCAM-1)) dans 0,1% de BSA. A titre indicatif, 1 pg de protéine dans 200 pi de BSA est assez pour recouvrir 4-5 chambres. En utilisant une seringue de 1 ml reliée à une aiguille G 25, infuser chaque chambre (0,04 x 0,4 x 50 mm) avec une protéine de revêtement de surface endotheliale. Stocker les chambres revêtues dans un tube de 15 ml à 4 ° C jusqu&#39;au lendemain. </li></ol> Le jour de l&#39;expérience: 3. Préparation de la Chambre <ol><li> Enlever les chambres recouvertes de 4 ° C et raccorder le tuyau jugulaire et la carotide de chaque côté. Sceller les rapproons en étirant attentivement une petite pièce rectangulaire de parafilm sur l&#39;endroit où le tuyau se réunit la chambre. En utilisant une seringue, remplir la chambre et le tube avec 0,1% de BSA (vérifier les fuites). Incuber pendant 45 min. </li><li> Préparer un plat de 35 mm de Petri à maintenir la chambre en coupant encoches de chaque côté de l&#39;assiette. Stabiliser la chambre dans les encoches; puis utiliser une petite goutte de silicone à apposer la chambre à l&#39;antenne sur le site crantée. Assurez-vous que la chambre est de niveau en regardant sous le microscope. Laisser le silicone sécher pendant au moins 15 min. </li><li> Remplir une seringue de verrouillage 60 ml avec de l&#39;héparine et à connecter le transducteur de pression. Connecter le transducteur de pression à la tubulure de la carotide dans l&#39;ordre suivant: transducteur, un tube de silicium et T-tube. <ol><li> Utiliser un 1 cm entre la tubulure PE50 de silicium relié au transducteur et le tube en T pour sécuriser la connexion. Passez le tube de silicium de l&#39;artère carotide dans le collier de pression (figure 1D). Exécutez 100USP héparine Through le tube et la chambre jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air. </li></ol></li></ol> 4. Mise en place du logiciel <ol><li> Pour préparer le logiciel, allumez l&#39;ordinateur, microscope, et un dispositif de laboratoire ouvert. Double-cliquez sur le Leica Application Suite (LAS) (ou l&#39;équivalent) et de préparer un dossier pour enregistrer la vidéo: parcourir → → acquérir film → définir séquence de clips (clips = 15, temps d&#39;enregistrement = 30 sec, et les intervalles = 15 sec) puis cliquez sur le signe &quot;+&quot; pour confirmer. </li><li> Pour enregistrer la pression d&#39;écoulement ouvrir le LabChart (ou équivalent) fichier et coordonner le nom de fichier dans le dossier d&#39;enregistrement à l&#39;étape 4.1, ci-dessus. </li></ol> 5. Procédure chirurgicale <ol><li> 10.8 anesthésier un week-old souris en utilisant une combinaison de kétamine (60 mg / kg) et de xylazine (6 mg / kg) injecté par voie intraperitoneale (IP). Assurez-vous que la sédation profonde est atteint dans 5-10 min par la perte du retrait de la pédale réflexe. Si nécessaire, l&#39;isofluraneenvoyé par masque peut être donnée au besoin. </li><li> Alors que sous anesthésie, placer un coussin chauffant sous la cage et mettre à 37 ° C pour maintenir la température du corps. Une fois l&#39;anesthésie adéquate est confirmée, placez la souris dans une position ventrale et le manteau les yeux avec bacitracine onguent pour prévenir la sécheresse oculaire. </li><li> Par la suite, de se raser les cheveux à l&#39;endroit de l&#39;incision à l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir et nettoyer le site avec de l&#39;alcool. </li><li> Une fois complètement anesthésié sécuriser l&#39;animal avec du ruban adhésif en gardant la souris dans une position ventrale. Exposer la région du cou avec des ciseaux et enlever la glande thyroïde pour exposer la trachée et des vaisseaux (figure 2A). </li><li> Nettoyez l&#39;artère carotide jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit entièrement exposé en prenant soin de ne pas endommager le nerf vague (figure 2B). Pliez un morceau de suture et passer le virage sous l&#39;artère carotide puis couper au niveau du coude il ya donc maintenant deux morceaux de suture en dessous de la carotide. Boucle chaque suture en noeuds (ne pas serrer lesnœuds). </li><li> Répétez la même procédure pour exposer la veine jugulaire gauche (figure 2C), la préparation des sutures de la même manière (Figure 2D). </li><li> Connectez le tuyau à la vascularisation de la souris. <ol><li> Hépariner la souris par injection de 1 ml d&#39;héparine IP. </li><li> Serrer la suture supérieure sur l&#39;artère carotide. Placez la pince aussi bas qu&#39;il peut aller sur l&#39;artère carotide (figure 3A) de la cuve. Utiliser des pinces pour maintenir l&#39;artère par la suture supérieure et une petite incision, environ 1/8 de la circonférence de l&#39;artère, en utilisant les microciseaux (figure 3B). </li><li> Faire passer le tube de l&#39;artère carotide par l&#39;intermédiaire du second noeud dans le fil de suture supérieure et dans l&#39;incision pratiquée dans l&#39;artère. Attacher la suture inférieure de sorte que l&#39;artère est scellée autour du tube (plusieurs noeuds doivent être prises pour assurer un joint étanche, la figure 3C). </li><li> Répétez la même procédure pour insérer le tube de la veine jugulaire (le navirepince ne est pas nécessaire pour le côté jugulaire; Figure 3D). </li><li> Testez le flux en relâchant la pince de navire. Se il n&#39;y a pas de fuites déplacer la souris pour le microscope et raccorder le tuyau de la carotide et la veine jugulaire à la tubulure de chambre (voir vidéo ci-jointe pour la démonstration d&#39;intervention chirurgicale). </li></ol></li></ol> 6. Enregistrement de Rolling Velocity <ol><li> Ouvrir la pince carotide pour remplir la chambre, ce qui rend un circuit avec le système circulatoire de la souris. Laisser le sang de circuler pendant 3-5 min, de manière à ce que les conditions d&#39;écoulement se stabilisent. Au cours de la période d&#39;attente de 3-5 minutes, ajuster la platine du microscope de telle sorte que la chambre est au niveau d&#39;une extrémité à l&#39;autre de l&#39;objectif du microscope et son bord est parallèle à la fenêtre d&#39;enregistrement vidéo sur l&#39;écran. </li><li> Remplissez la boîte de Pétri modifié contenant la chambre de verre avec de l&#39;eau puis abaissez l&#39;objectif de l&#39;immersion en eau 10X dans le plat de sorte que les cellules se écoulant à travers la chambre sont visibles.L&#39;intensité de la lumière peut être ajusté pour une visualisation adéquate des cellules. En général, une intensité plus faible est mieux. </li><li> Régler la pince sur le tube de sorte que le transducteur lit une constante 30 mm Hg, en corrélation avec une pression physiologique fluide en écoulement, ou comme on le souhaite. </li><li> Appuyez sur &quot;Start&quot; pour lancer l&#39;enregistrement à la fois la vidéo et la pression avec le premier laps de temps près de la fin jugulaire et se déplaçant à contre-courant vers la fin de la carotide jusqu&#39;à leur achèvement. NOTE: Plusieurs conditions de revêtement utilisant différentes molécules d&#39;adhésion peuvent être étudiés dans la même souris en utilisant plusieurs chambres. Une seule chambre est enregistré à la fois. <ol><li> Lorsque l&#39;enregistrement est terminé, fermer la vanne sur le site d&#39;entrée, l&#39;arrêt de la circulation sanguine. Retirer la chambre et se adapter à une nouvelle chambre (couché avec une molécule d&#39;adhérence différente) au circuit à l&#39;aide de pinces fines dans une main et pince rainurés dans l&#39;autre main. Reprendre l&#39;enregistrement de la nouvelle chambre comme indiqué dans les étapes06.01 à 06.04. </li></ol></li><li> Euthanasier toutes les souris par asphyxie au CO2 suivie d&#39;une dislocation de la moelle épinière à la fin de l&#39;expérience. La procédure est terminal, par conséquent, les souris sont euthanasiées par dislocation de la moelle épinière à la fin de l&#39;expérience. </li></ol> 7. Interprétation des résultats <ol><li> Pour analyser les données enregistrées utiliser le plugin &quot;M TrackJ&quot; pour le logiciel ImageJ 23. </li><li> Convertir le fichier en niveaux de gris par Sélectionnez Fichier → Importer → → AVI convertir en niveaux de gris. </li><li> Standardiser les cadres Sélectionnez l&#39;image → → → propriété de pénétrer dans les intervalles de trame (i) → mondiale. Calculer les intervalles de trame en divisant la durée totale de la vidéo (généralement 30 sec) par le nombre de trames dans une vidéo (indiqué dans le coin supérieur de la fenêtre d&#39;image vidéo J). </li><li> Mesurer le débit de chaque leucocytes par Choisir le plugiciel → M TrackJ → Ajouter pistes → sélectionner un leucocyte→ Suivi avec chaque image pour 15-20 sec → Fusionner. </li><li> Répétez l&#39;étape 7.4 pour tous les leucocytes en vue. </li><li> Déterminer la vitesse moyenne de roulement des leucocytes par Select mesure → deux colonnes apparaissent → Copier tous les M TrakJ: Tracks dans un tableur. La colonne intitulée &quot;V signifie&quot; est le roulement des leucocytes mesurée en pixels / seconde. Convertir en um / sec en divisant par 2/3. </li><li> Pour analyser le point culminant de données de pression et d&#39;exportation dans un tableur et d&#39;effectuer le calcul suivant: AP (mm Hg) et t (dyne / cm 2) pour une comparaison entre chaque groupe expérimental. Une fois calculée, copier les données dans le logiciel de prisme pour le graphisme. </li></ol>

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The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

Le processus de recrutement des leucocytes est une étape cruciale dans la réponse inflammatoire; elle implique la migration de leucocytes à partir du système circulatoire vers les tissus cibles, où ils sont capables d&#39;exercer leur fonction effectrice. Le recrutement des leucocytes est solidaire dans une variété de conditions inflammatoires telles que les plaques d&#39;athérosclérose, infarctus du myocarde, de l&#39;ischémie / reperfusion et une chirurgie de transplantation, ainsi que plusieurs conditions neuro-inflammatoire du système nerveux central liés 10-12,20,24,25. Compte tenu de la diversité des conditions de la maladie qui se étend de recrutement des leucocytes, la chambre de microflux autoperfused fournit un outil indispensable permettant l&#39;enquêteur la possibilité d&#39;étudier la dynamique de la migration des leucocytes. Au cours des dernières décennies, une variété d&#39;essais in vitro ont été développées pour étudier la dynamique des leucocytes adhésion cellulaire 26. Malheureusement, tous ces essais nécessitent l&#39;extraction deles leucocytes du sang, l&#39;introduction de l&#39;activation mécanique. Pour se rapprocher de l&#39;environnement in vivo, des adaptations ont été faites pour recueillir des échantillons de sang total et de contrôler les conditions d&#39;écoulement hémodynamique 16,17. Ici, nous présentons les progrès antérieurs dans le domaine de liaison d&#39;une chambre revêtue au système circulatoire de la souris. Nous sommes en mesure de réguler le flux du sang à une gamme physiologique et étudier la dynamique des leucocytes roulant. La chambre revêtu nous donne la possibilité d&#39;étudier les interactions de leucocytes avec des molécules d&#39;adhésion spécifiques. Comme le système fonctionne comme une unité actionnée par une souris vivante, il imite plus étroitement l&#39;environnement naturel, ce qui permet d&#39;étudier les interactions des leucocytes-endothélial dans une variété de modèles de souris immunologiques. En outre, ce système nous permet de tirer parti des modèles multiples de souris génétiques disponibles. Bien que le système ne se réplique pas totalement l&#39;environnement in vivo, il offre une plate-forme pour étudier spécific éléments des leucocytes dans des conditions physiologiques, un exploit qui n&#39;a pas été possible auparavant. Même si cela nous prend un pas de plus vers un environnement plus physiologique il ya des limites au système. Il ne se réplique pas complètement la matrice 3D complexe de la vascularisation de sorte que nous ne sommes en mesure d&#39;évaluer certains éléments des interactions de leucocytes qui sont limités au revêtement de la chambre. En outre, un grand soin doit être pris pour assurer un système fermé à la circulation de la souris en suivant toutes les étapes mentionnées dans le protocole. L&#39;introduction des bulles d&#39;air affectera considérablement la précision et la reproductibilité des expériences. Bien que nous décrivons l&#39;utilisation de la chambre Autoperfused Microflow pour l&#39;évaluation dynamique de roulement de leucocytes de la procédure a le potentiel d&#39;être personnalisés par des chercheurs d&#39;étudier une variété de maladies. Par exemple, les cellules cancéreuses se métastasent en exprimant un grand nombre des intégrines communs partagés par les leucocytes. StudyIng leurs dynamique de roulement dans un cadre qui imite plus étroitement un environnement in vivo pourrait contribuer à notre connaissance, et peut-être la prédiction, de la nature invasive de certaines cellules cancéreuses. Une approche possible pourrait consister à combiner une technique de marquage des cellules cancéreuses, telles que la GFP 27, ainsi que le dosage de la chambre d&#39;écoulement pour suivre la dynamique de roulement des cellules cancéreuses exprimant la GFP. Compte tenu de la souplesse du revêtement de la chambre avec une variété de substances et la connexion de plusieurs chambres à la même souris, il sera intéressant de voir comment ce procédé est modifié pour être utilisé dans d&#39;autres laboratoires, en combinaison avec des souris génétiquement modifiées et des modèles de maladies. La technique que nous décrivons ici touche juste sur un potentiel d&#39;application beaucoup plus large qui ne est limitée que par la créativité de l&#39;enquêteur.

Inflammation est la réponse universelle de l&#39;organisme à une lésion et est une étape cruciale à la fois la fonction immunitaire innée et adaptative système. En réponse à une blessure et / ou des stimuli inflammatoires, les cellules endothéliales régulation positive des molécules d&#39;adhésion spécifiques; ce qui conduit à extravasation des leucocytes à travers l&#39;endothélium microvasculaire, principalement dans les veinules post-capillaires. Ce processus commence par attacher des leucocytes à écoulement libre dans le sang sur l&#39;endothélium. Laminage stable et ferme adhésion des leucocytes, qui à son tour conduit à la transmigration et la sécrétion d&#39;agents cytotoxiques, suivent cette attacher 1,2. Les sélectines sont connus pour arbitrer les étapes précoces de la cascade de 3 à 5; intégrines sont responsables pour les étapes ultérieures de cabinet adhérence et la transmigration 1,6-8. Un nombre croissant de preuves suggère leucocytes et des molécules d&#39;adhésion endothéliales ont un rôle vital dans les modèles animaux de lésions de reperfusion d&#39;ischémie, L&#39;asthme, le psoriasis, la sclérose en plaques et la dégénérescence maculaire liée à l&#39;âge de 9 à 12. Dans ces conditions, la réponse inflammatoire est mal orienté à attaquer son propre corps, entraînant la dégradation des tissus sains. Des agents anti-inflammatoires existants (tels que les médicaments non-stéroïdiens anti-inflammatoires, les corticostéroïdes ou d&#39;autres agents chimiothérapeutiques) portent le risque d&#39;effets indésirables graves avec l&#39;utilisation à long terme 13. Par conséquent, il est d&#39;un grand intérêt d&#39;avoir les outils appropriés avec la possibilité d&#39;identifier des molécules spécifiques de la maladie, qui peut finalement être la cible d&#39;avoir l&#39;effet anti-inflammatoire désiré tout en restant non toxique 14. Existante de méthodes in vitro tels que le test d&#39;adhérence des leucocytes statique ont été utilisés dès 1976 15. La chambre d&#39;écoulement parallèle a été utilisé pour la première in vitro en 1987 pour étudier les interactions leucocytes-endothélial dans des conditions d&#39;écoulement. Dans ces expériences, stimulée human leucocytes polymorphonucléaires (PMN) à partir de sang veineux ont été perfuses sur une monocouche de cellules primaires humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC). Pour contrôler les conditions d&#39;écoulement hémodynamique, la pompe Appareil de seringue Harvard a été utilisé 16. En variante, pour éviter l&#39;isolement de leucocytes artificiel, le sang total a été utilisé en combinaison avec la chambre de verre revêtue de molécules d&#39;adhésion 17 immobilisées. Pour éviter une stimulation des leucocytes et d&#39;étudier de façon mécanique leur interaction avec les molécules d&#39;adhésion dans des conditions physiologiques approximatives, ex vivo autoperfused, extracorporelle, circuit artérioveineux est développé 16. Dans ce circuit, le sang se écoule entre le droit artère carotide commune gauche et la veine jugulaire externe d&#39;une souris sous anesthésie en direct, ce qui permet l&#39;interaction de PBL natifs dans une chambre de microflux de verre revêtue de molécules d&#39;adhérence simples ou co-immobilisée. Un avantage majeur à ce system est la capacité d&#39;utiliser des souris génétiquement modifiées, dans lesquelles les voies inflammatoires sont directement ou indirectement manipulé. En outre, il existe la possibilité d&#39;identifier la contribution isolé de molécules d&#39;adhérence des leucocytes à l&#39;inflammation, exempt d&#39;activation externe, dans des conditions d&#39;écoulement. L&#39;application d&#39;un régulateur de débit au point de la chambre de flux d&#39;entrée fournit une large gamme de variations expérimentales de forces de cisaillement pour imiter soit artérielle ou systèmes veineux 18-22. Ici, nous décrivons en détail un protocole concernant la préparation et l&#39;exécution de l&#39;ex vivo autoperfused dosage de la chambre de microflux.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Material</td>
			<td style="width:220px;">Vendor</td>
			<td style="width:237px;">Part number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro glass chamber 0.4x0.04x50mm</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>2540-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 60</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Silicone tubing 002</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-189-15A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y tube</td>
			<td>Value Plastics</td>
			<td>Y210-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T tube</td>
			<td>value plastics</td>
			<td>T410-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone gel</td>
			<td>Hardware store - Home Depo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Tube holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>00608-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Clamp applicator</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Vascular clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 silk sutures</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-1215-6/0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25x1G&#160; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30x1/2G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin 100 USP units/ml</td>
			<td>Hospital pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

interactions leucocytes-endothélial sont des événements précoces et critiques dans l&#39;inflammation aiguë et chronique et peuvent, lorsque dérégulé, médiation lésion tissulaire entraînant des dommages pathologique permanente. Des analyses classiques existants permettent l&#39;analyse des molécules d&#39;adhésion des leucocytes seulement après l&#39;extraction de leucocytes à partir du sang. Cela nécessite le sang subir plusieurs étapes avant de leucocytes du sang périphérique (PBL) peuvent être prêtes pour l&#39;analyse, qui à son tour peut stimuler PBL influençant les résultats de recherche. Le dosage de la chambre d&#39;écoulement micro autoperfused, cependant, permet aux scientifiques d&#39;étudier début des leucocytes dérégulation fonctionnelle en utilisant le flux systémique d&#39;une souris vivante tout en ayant la liberté de manipuler une chambre couché. Grâce à un modèle de la maladie, l&#39;expression fonctionnelle de molécules d&#39;adhésion de leucocytes peut être évaluée et quantifiée dans une chambre micro-verre revêtue de molécules immobilisées d&#39;adhérence endotheliale ex vivo. Dans ce modèle, le sang se écouleentre le droit artère carotide commune gauche et la veine jugulaire externe d&#39;une souris vivante sous anesthésie, ce qui permet l&#39;interaction de PBL indigènes dans la chambre. Analyse expérimentale en temps réel est réalisée à l&#39;aide d&#39;un microscope intravitale ainsi qu&#39;un dispositif de pression de l&#39;appareil Harvard. L&#39;application d&#39;un régulateur d&#39;écoulement au niveau du point de la chambre de verre d&#39;entrée permet des conditions d&#39;écoulement physiologiques comparables entre les essais. Leucocytes vitesse de roulement est le résultat principal et est mesurée en utilisant les National Institutes of Health libre accès ImageJ logiciel. En résumé, le micro dosage de chambre d&#39;écoulement autoperfused fournit un environnement physiologique optimale pour étudier l&#39;interaction leucocytes endothéliale et permet aux chercheurs de tirer des conclusions précises lorsque l&#39;on étudie l&#39;inflammation.

<html> Au cours de chaque enregistrement leucocytes ne interagissant sont évidents sur la chambre. Les résultats d&#39;une expérience représentative peut être vu dans la figure 4. Les flèches blanches indiquent leucocytes individuels qui ont été capturés par la molécule d&#39;adhérence d&#39;intérêt et déploient le long de la chambre entre autres ceux à écoulement libre dans le flux sanguin. Un artefact commun en dehors de la chambre peut être vu avec les grandes sphères sombres dans toutes les images. Les sphères sombres aident le lecteur à apprécier le mouvement des leucocytes par rapport à un point fixe. Les leucocytes avancement sur une période de 22 secondes peut être considérée en relation avec les sphères. Le graphique sur la même figure montre un tracé final de ces données où Tx1 diminue la vitesse de roulement (un déplacement vers la gauche) et Tx2 augmente la vitesse (un déplacement vers la droite) par rapport au témoin. 0 &quot;/&gt; Figure 1: Préparation du tube de la chambre d&#39;écoulement. (A) des outils nécessaires pour les tubes et ensemble de chambre (chambre de verre micro 0,4 x 0,04 x 50 mm, tuyaux en polyéthylène PE10, des tuyaux en polyéthylène PE60, le silicium tube 002, Y tubes, T tubes, 35 mm boîte de Petri, pinces fines, des ciseaux fins, support de tube, pince vasculaire, 7-0 suture de soie. (B) Préparation de l&#39;artère carotide et la tubulure de la veine jugulaire pour re-diriger le flux de sang de souris à travers la chambre revêtue. (C) Raccordement de la tubulure de l&#39;artère carotide pour le transducteur de pression. (D) Passez le tube du transducteur à travers la pince pour régler le débit de l&#39;écoulement de sang. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /> Figure 2:. L&#39;exposition de l&#39;artère carotide et la veine jugulaire (A) Découpez soigneusement la zone du cou pour exposer la trachée (B) Nettoyez l&#39;artère carotide droite de sorte qu&#39;un morceau de suture peut être passé sous le bateau (pointillé jaune. ligne décrit l&#39;artère carotide). (C) Nettoyez la veine jugulaire gauche de sorte qu&#39;un morceau de suture peut être adopté en vertu du navire (ligne jaune parsemé décrit la veine jugulaire). (D) organisez moins reliée sutures dans les régions supérieures et inférieures de l&#39;artère carotide et la veine jugulaire (flèches indiquent les régions supérieures et inférieures des vaisseaux). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> Figure 3: Connexion du tube à til artère carotide et la veine jugulaire. (A) Serrez le noeud supérieure sur la carotide et placez la pince-dessous du noeud inférieur. (B) En utilisant les microciseaux, faire une petite incision dans la carotide, environ 1/8 de la circonférence (cercle jaune en pointillés indique l&#39;incision). ( C) Insérer le tube dans la carotide et sécurisé avec au moins deux sutures (ligne pointillée verte indique le tube et la ligne pointillée jaune l&#39;artère carotide). (D) insérer même tube dans la veine jugulaire (ligne pointillée verte montre le tube et le jaune ligne pointillée la veine jugulaire). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> Figure 4: évolution dans le temps représentant des leucocytes roulant à travers le cham de fluxbre (barre d&#39;échelle = 100 um) (pointes de flèches blanches soulignent leucocytes roulant). Graphique représente résultats représentatifs après l&#39;exportation dans un programme graphique (Tx1 Tx2 et sont des groupes de traitement expérimental et CTR est le groupe de contrôle). Tx1 représente un traitement dans lequel les leucocytes ralentir conduisant à une diminution des leucocytes roulant vitesse et un décalage vers la gauche du graphique par rapport au groupe non traité (CTR), tandis que Tx2 conduit à un décalage vers la droite reflétant une augmentation dans les leucocytes roulant vitesse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquez sur ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Ici, nous présentons un protocole qui permet à l&#39;enquêteur d&#39;évaluer la dynamique du recrutement de leucocytes ex vivo en connectant une chambre revêtue d&#39;adhérence des molécules dérivées de l&#39;endothélium dans le système circulatoire d&#39;une souris. Cette méthode offre des avantages importants, car il permet l&#39;évaluation de leucocytes dans des conditions biologiques relatives.

Évaluer les interactions de leucocytes-endothélial dans des conditions d&#39;écoulement dans un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Chambre Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

assessing-leukocyte-endothelial-interactions-under-flow-conditions-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

9.5K vues.  Harvard Medical School, Massachusetts Eye & Ear Infirmary.  Ici, nous présentons un protocole qui permet à l'enquêteur d'évaluer la dynamique du recrutement de leucocytes ex vivo en connectant une chambre revêtue d'adhérence des molécules dérivées de l'endothélium dans le système circulatoire d'une souris. Cette méthode offre des avantages importants, car il permet l'évaluation de leucocytes dans des conditions biologiques relatives. 

Vidéo: Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Chambre de circulation à plaques parallèles et de circuit d&#39;écoulement continu pour évaluer les cellules progénitrices endothéliales en cisaillement du flux laminaire

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Recherche

Bio-ingénierie

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Détermination de la vitesse de transport des xénobiotiques et des nanomatériaux à travers le placenta en utilisant l&#39;<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human perfusion placentaire modèle

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

A Novel tridimensionnelle chambre d&#39;écoulement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions d&#39;écoulement physiologiques

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Génie tissulaire par Intrinsic vascularisation dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Chambre Ingénierie

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Une nouvelle Technique chirurgicale comme fondement pour In Vivo partielle génie hépatique chez le Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Une méthode automatisée pour effectuer l'essai micronutrique in vitro à l'aide de la cytométrie du flux d'imagerie multispectrale

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

Modèles artériels 3D cultivés en cellules in vitro pour l’étude du ciblage de médicaments vasculaires sous flux

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Un système microphysiologique pour étudier l’interaction leucocytaire-endothéliale pendant l’inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.

Mesure in vivo résolue dans le temps de la dynamique des neuropeptides par immunosonde capacitive dans le cœur porcin

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by scoring MN in once-divided, cytokinesis-blocked binucleated cells or fully divided mononucleated cells. Historically, light microscopy has been the gold standard method to score the assay, but it is laborious and subjective. Flow cytometry has been used in recent years to score the assay, but is limited by the inability to visually confirm key aspects of cellular imagery. Imaging flow cytometry (IFC) combines high-throughput image capture and automated image analysis, and has been successfully applied to rapidly acquire imagery of and score all key events in the MN assay. Recently, it has been demonstrated that artificial intelligence (AI) methods based on convolutional neural networks can be used to score MN assay data acquired by IFC. This paper describes all steps to use AI software to create a deep learning model to score all key events and to apply this model to automatically score additional data. Results from the AI deep learning model compare well to manual microscopy, therefore enabling fully automated scoring of the MN assay by combining IFC and AI.

The micronucleus (MN) assay is a well-established test for quantifying DNA damage. However, scoring the assay using conventional techniques such as manual microscopy or feature-based image analysis is laborious and challenging. This paper describes the methodology to develop an artificial intelligence model to score the MN assay using imaging flow cytometry data.

Automatisation du test du micronoyau à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie et de l’intelligence artificielle

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...