The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

Les neutrophiles ont été isolés chez des volontaires sains qui ont signé un consentement éclairé. La recherche a été effectuée en conformité avec les directives nationales et institutionnelles, pour le bien-être humain. 1. placage et l&#39;entretien des cellules ombilicales humaines endothéliales de veine <ol><li> La culture de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) selon les instructions du fabricant. Cultivez HUVECs sur la fibronectine (FN) doté d&#39;un revêtement plats (10 pg / ml, dissous dans l&#39;eau déminéralisée) par des moyens (endothéliale Basal Medium (EBM-2) supplémenté avec de croissance endothélial moyen (EGM-2) SingleQuots). Utilisez culture cellulaire entre 4-8 passages pour les expériences. </li><li> Jour 1: Coat-débit chambres avec 100 pi de la fibronectine (10 pg / ml dans PBS) pendant au moins 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Jour 2: Lorsque les cellules atteignent 80-90% de confluence, les cellules trypsiniser après un lavage soigneux avec RT tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4, centrifuger à 800 xg et remettre en suspension à 800 000 cellules / ml en utilisant les médias. Plate 80.000 cellules dans chaque canal unique des flux-chambres FN-enduits et doucement pipeter la suspension de cellules de haut en bas. Culture O / N dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Jour 3: Actualiser les médias dans la diapositive débit chambre d&#39;incliner lentement la lame à un angle de 45 °. (Voir la figure 1A). NOTE: Il est recommandé de ne supprimer que les médias dans les réservoirs et pas dans le canal lui-même. Retrait des médias dans les canaux peut entraîner la perte de cellules endothéliales et de décès dus à la force d&#39;entraînement des médias provoquée par pipetage. </li><li> Vérifiez par microscopie à contraste de phase si les cellules endothéliales ont formé une monocouche (soit 100% de confluence). Si les cellules ne sont pas 100% de confluence, changer les médias deux fois par jour jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent 100% de confluence. </li><li> Une fois que les cellules ont atteint la confluence, stimuler les cellules avec des milieux (voir l&#39;étape1.1) contenant du médiateur inflammatoire (TNF-α (10 ng / ml)). La stimulation des cellules HUVEC O / N (c&#39;est-à-12 h) avec les résultats de TNF-α dans un phénotype inflammatoire de l&#39;endothélium, ie., La régulation positive de molécules d&#39;adhésion cellulaire telles que ICAM-1 et VCAM-1 13. </li></ol> 2. leucocytes polynucléaires isolement en utilisant des gradients de Percoll <ol><li> Préparer N-2 hydroxyéthylpiperazine-N&#39;-2-éthanesulfonique (HEPES) -buffer (ci-après dénommé: flux tampon) avant d&#39;isoler les leucocytes polynucléaires (PMN). Flow-tampon est utilisé pour laver les PMN isolées et en tant que tampon dans le dosage de l&#39;écoulement. Pour préparer le tampon d&#39;écoulement: diluer 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g d&#39;HEPES (20 mM), 0,45 g de KCl (6 mM), 0,25 g de MgSO 4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) dans 1 litre d&#39;eau déminéralisée et d&#39;ajuster le pH à 7,4 (ce stock peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs semaines). </li><li> Ajouter frais 100 pi 1 M CaCl 2 &amp; #160; (1 mM), 2,5 ml d&#39;albumine humaine à partir d&#39;une concentration de 200 g / L de bouillon (0,5% v / v) et 0,1 g de glucose pour 100 ml (0,1% p / v) de tampon d&#39;écoulement. Ensuite, filtrage du flux-tampon en utilisant un filtre de 0,45 um. NOTE: Ce tampon de flux doit être préparé frais pour chaque expérience. </li><li> Avant d&#39;isolement des PMN, préparer 10% de citrate trisodique (CNC) dans une solution PBS, pH 7,4. </li><li> Recueillir 20 ml de sang total dans vacuettes de l&#39;héparine de sodium à partir d&#39;un volontaire sain. Diluer le sang total à 1: 1 avec 10% de PBS / TNC en tubes de 50 ml et 20 de pipette ml dilués sang avec précaution sur 12,5 ml de Percoll (23% (w / w) de solution colloïdale dans l&#39;eau avec une densité de 1,130 g / ml) dans un nouveau tube de 50 ml. Placez délicatement les tubes dans la centrifugeuse et tourner pendant 20 min à 800 xg avec une faible accélération et pas de pause fixé à RT. REMARQUE: Lors de l&#39;ajout du sang dilué au Percoll, incliner le tube Percoll contenant dans un angle de 45 ° et une pipette doucement le sang dilué dans l&#39;esprit du tubeh la vitesse la plus lente pipette de garçon. </li><li> Retirer tout le liquide et remplir ensuite le tube à la lyse des érythrocytes-tampon glacé (4,15 g NH 4 Cl [0,155 M], 0,5 g de KHCO3 [0,01 M] et 18,5 mg d&#39;EDTA (triplex III) [0,1 mm] à 500 ml glacé de H 2 O) pour lyser les érythrocytes. Laisser le tube sur de la glace, de temps en temps renversant le tube, jusqu&#39;à ce que la suspension vire au rouge foncé, suivie d&#39;une centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C avec des pauses activées. REMARQUE: La fraction de culot contient les PMN (neutrophiles, éosinophiles, basophiles) avec des érythrocytes. </li><li> Retirer le surnageant et laver culot deux fois dans la lyse-tampon glacée à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Reprendre le culot avec flow-tampon à la température ambiante et déterminer la concentration PMN l&#39;aide d&#39;un hématimètre ou compteur de cellules automatisé. Suspendre les PMN du débit-tampon à 1 x 10 6 cellules / ml et conserver à la température ambiante. </li></ol> 3. étiquetage des endothéliale Junctional VE-cadhérine et PECAM-1 <ol><li> Ajouter le PECAM Alexa Fluor 647 anticorps (clone WM59) à une dilution 1: 100 et l&#39;anticorps VE-cadhérine-FITC calcium-indépendante (clone 55-7H1) à un milieu de culture à la dilution 1:50 HUVEC (voir étape 1.1), et incuber pendant 30 min avant de commencer l&#39;expérience de flux de visualiser la dynamique de jonction des cellules endotheliales au cours de la transmigration des neutrophiles dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques. REMARQUE: Avant d&#39;ajouter les anticorps directement marqués à l&#39;écoulement-chambres, veiller à ce que le volume de chaque canal ne dépasse pas 100 pi. Cela permet de garder les frais d&#39;anticorps aussi bas que possible. </li></ol> 4. PMN TEM test sous flux <ol><li> Placer les PMN dans un bain-marie pendant 15 min à 37 ° C avant de les injecter dans le système d&#39;écoulement. </li><li> Connectez le tuyau à un débit chambre vide et remplir avec chaud (par exemple, 37 ° C) Flux-tampon (voir l&#39;étape 4.3) pour éviter la formation de bulles d&#39;air lors de la mise en place eSystème de flux de courrier. </li><li> Se connecter un côté d&#39;une chambre d&#39;écoulement à vide du système de débit de la pompe de la seringue à l&#39;aide de tubes en silicone contenant une seringue de 20 ml, et de mettre la chambre d&#39;écoulement dans la platine du microscope. </li><li> Branchez l&#39;autre extrémité d&#39;un flux chambre vide dans le ballon réservoir rempli de 37 ° C Débit-tampon (figure 1B) et démarrer la pompe de la seringue afin de combler tous les tubes avec flow-tampon. La pompe va tirer le tampon d&#39;écoulement à partir du réservoir à travers la chambre d&#39;écoulement dans la seringue. NOTE: Ce tube comprend également un port d&#39;injection Luer en ligne, qui permet aux PMN à injecter avec une aiguille dans une expérience en cours d&#39;exécution sans arrêter la circulation et la création de bulles d&#39;air. </li><li> Remplacer le flux chambre vide avec le flux compartiments contenant le TNF-α HUVEC traitées, raccorder le tuyau d&#39;écoulement tampon contenant et le placer dans la platine du microscope (figure 1C). Pincez les tubes avant de débrancher et de rebrancher lem dans les chambres contenant les cellules HUVEC, comme pincement peut pas conduire à la formation de bulles d&#39;air à l&#39;intérieur de la tubulure et / ou débit-chambres. </li><li> Réglez la vitesse d&#39;écoulement de 1 dyn / cm 2, en fonction de la vitesse d&#39;écoulement physiologique dans les veinules post-capillaires (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Fiche contraste interférentiel différentiel (DIC), FITC (488 nm) et l&#39;Alexa Fluor 647 (647 nm) en utilisant simultanément un microscope confocal à balayage laser microscope. </li><li> Injecter les PMN (étape 4.1) lentement dans le système d&#39;écoulement via le in-line orifice d&#39;injection Luer (figure 1D) en utilisant seringues de 1 ml. </li><li> Après quelques minutes, les leucocytes apparaissent, adhèrent, et transmigrer. Arrêter l&#39;expérience à tout moment désiré en débranchant le tube de l&#39;écoulement chambre et pipetage fixateur (formaldéhyde 3,7% dans PBS) dans le flux chambre. Laisser fixation pendant 10 minutes, suivie d&#39;un lavage avec du PBS. Les données sont analysées en utilisant un logiciel d&#39;imagerie (voir tableau des matériaux et de l&#39;équipement). REMARQUE: Effectuer la il expérience utilisant un microscope confocal à balayage laser équipé d&#39;une chambre climatique à une température constante à 37 ° C, 5% CO 2, et un objectif 63X d&#39;huile. </li></ol>

<ol>
	<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis--an+inflammatory+disease.">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li><li>Szekanecz, Z., Koch, A. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium.">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li><li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium.">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li><li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro:+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model.">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li><li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium.">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Pour ce protocole, il est essentiel d&#39;éviter la formation de bulles d&#39;air dans le débit-chambres, car cela se traduira par l&#39;apoptose des cellules et une monocouche perturbé. Pour éviter cela, nous tenons à souligner à payer un intérêt particulier pour les étapes 4.2 et 4.5, où les tubes sont reliés à l&#39;écoulement chambre. Une autre étape importante dans le protocole est le amorçage des PMN qui sont conservés à la température ambiante en les incubant pendant 15 à 30 min à 37 ° C avant de les injecter à l&#39;écoulement de chambre (étape 4.1). Cela se traduit par l&#39;amorçage des intégrines leucocytaires, en leur permettant d&#39;adhérer à des molécules d&#39;adhésion telles que ICAM-1, VCAM-1 ou à l&#39;endothélium. Ce protocole n&#39;est pas limitée à étudier la transmigration des neutrophiles. Mais aussi d&#39;autres types de leucocytes tels que les monocytes ou les lymphocytes peuvent être utilisés. Notez que l&#39;étape 4.1, c&#39;est à dire, l&#39;amorçage des leucocytes peuvent différer entre les différents types de leucocytes. En outre, d&#39;autres types de cellules endotheliales peuvent être utilisés. Pour cela, il reste critiquepour stimuler les cellules endotheliales à des stimuli inflammatoires appropriés, tels que le TNF-α ou IL-1β. Si les neutrophiles ne répondent pas de transmigration, on peut envisager de traiter les neutrophiles brièvement (5 min) avec de la N-formyl-L-méthionyl-L-leucyl-L-phénylalanine (fMLP) peptide 16. Cela stimulera les neutrophiles, en particulier leurs intégrines, encore plus loin, ce qui les rend plus enclins à adhérer à l&#39;endothélium. Typiquement / cm 2 vitesses d&#39;écoulement 1 dyn est utilisé. Cette vitesse d&#39;écoulement est mesurée dans les veinules post-capillaires, les sites où la plupart des migrations leucocytes transendotheliale se produit 17. En utilisant les débits-chambres décrites, il est possible d&#39;augmenter la vitesse de circulation de 10 dyn / cm 2. Cependant, il n&#39;est pas recommandé d&#39;augmenter le cisaillement plus loin. Elle peut entraîner une fuite non désirée du tube et le détachement des cellules de la chambre d&#39;écoulement. Les résultats décrits dans la figure 3 indiquent que ceux-cianticorps peuvent être utilisés pour visualiser et étudier la dynamique des jonctions endothéliales cellule-cellule pendant la diapédèse des leucocytes. En particulier, en plus des dosages de transmigration existants ce protocole permet de discriminer de migration transcellulaire paracellulaire dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques en temps réel. Comme les anticorps se colorent les jonctions cellule-cellule, on peut marquer le nombre de leucocytes qui traversent la VE-cadhérine / jonctions PECAM-1-positifs par rapport non positive VE-cadhérine / PECAM-1 sites. De cette façon, la migration transcellulaire peut être discriminé de la migration paracellulaire. Il est important de souligner que ces anticorps ne gênent pas la fonction des protéines, ils se lient à l&#39;anticorps: PECAM-1 utilisé dans cette étude est dirigé contre le domaine extracellulaire secondes. Les cellules endotheliales qui ont été étalées en présence de l&#39;anticorps n&#39;ont pas montré de défauts dans la diffusion ou la formation d&#39;une monocouche, ce qui suggère que l&#39;anticorps n&#39;a pas au moinsinterférer avec les interactions entre les cellules endothéliales homotypiques. en plus de cela, les deux anticorps ne nuisent pas à la capacité des neutrophiles à migrer à travers la monocouche endothéliale. En outre, le nombre de neutrophiles qui transmigrent à travers la monocouche endothéliale, en l&#39;absence ou en présence de l&#39;anticorps n&#39;est pas modifié (données non présentées). Fait important, la microscopie confocale à balayage laser nous donne la possibilité d&#39;enregistrer différents canaux de fluorescence et DIC simultanément. Ainsi, ce test permet d&#39;étudier la dynamique de la VE-cadhérine et PECAM-1 en même temps quand un neutrophiles traverse la jonction cellule-cellule endothéliale et aidera à comprendre pourquoi les leucocytes choisissent une voie sur l&#39;autre, c&#39;est-à-paracellulaire contre transcellulaire.

La migration des leucocytes transendothéliale efficace et étroitement contrôlé (TEM) est d&#39;une importance capitale dans les processus physiologiques tels que la surveillance immunitaire et de l&#39;inflammation aiguë. Toutefois, dans certaines conditions physiopathologiques, TEM incontrôlée et excessive est observée traduit dans les maladies inflammatoires chroniques (par exemple, la polyarthrite rhumatoïde, l&#39;athérosclérose, l&#39;asthme). Egalement au cours de la métastase des cellules tumorales, le processus de migration trans-endothéliale est instrumental pour les cellules tumorales quittent la circulation à métastaser 1-3. Dans le but d&#39;interférer spécifiquement avec leucocytes excessive ou TEM des cellules tumorales, une compréhension détaillée de la régulation de ce processus est nécessaire. On pense que le processus de TEM se produit à travers différentes étapes. Études séminales, revu il ya deux décennies par Butcher et Springer, ont conduit au modèle en plusieurs étapes décrivant le processus de TEM 4,5. Ce modèle est toujours valable, même si certains annonceétapes conditionnelles ont été inclus 6. Alon et al. Décrit la nécessité de la présence de chimiokines immobilisés sur la surface de l&#39;endothélium 7. Récemment, ils ont montré que l&#39;endothélium génère lui-même chimiokines qui sont présentés à la surface apicale endothéliale 8. En outre, le même groupe a mis en avant l&#39;importance des conditions d&#39;écoulement pendant TEM 7. Récemment, plusieurs publications ont porté sur les deux itinéraires différents leucocytes peuvent prendre à l&#39;étape finale de la diapédèse de TEM. Ils peuvent soit aller à travers les jonctions cellule-cellule, c&#39;est à dire, la voie de migration paracellulaire, ou traverser le corps de la cellule endothéliale, connue sous le nom migration voie transcellulaire 9. Carman et ses collègues ont étudié ces voies dans le détail et a conclu que les leucocytes choisissent préférentiellement la voie de migration paracellulaire (90%) sur la voie transcellulaire (10%) lors de la traversée d&#39;une veine ombilicale endothéliale monocouche 10.Cependant, lorsque les cellules endotheliales provenant d&#39;autres origines ont été utilisés, par exemple, le cerveau ou le système microvasculaire, les plus utilisés leucocytes voie transcellulaire (30%) 11. Le groupe Vestweber récemment montré que, lorsque les jonctions cellule-cellule étaient incapables de dissocier l&#39;une de l&#39;autre à l&#39;aide d&#39;une réaction en chaîne dans un modèle animal, en remplaçant endogène VE-cadhérine de VE-cadhérine, alpha-caténine chimère, leucocytes TEM a été complètement bloqué 12 . De manière surprenante, les auteurs ont remarqué que TEM a été bloqué en plusieurs, mais pas tous, les tissus. Dans l&#39;ensemble, ces expériences élégantes ont indiqué que les leucocytes ont préféré la voie paracellulaire sur la voie transcellulaire, bien que les signaux de régulation qui déclenchent cette décision sont encore inconnues. Même si la majorité des leucocytes préfèrent la voie de migration paracellulaire, il est encore difficile de distinguer entre les deux voies. En outre, en dépit de nombreuses études portant sur le rôle de la cellule Junct-cellule endothélialeions, la dynamique de ces jonctions, en particulier les protéines de jonction VE-cadhérine et PECAM-1, au cours de leucocytes passage est encore en débat. Nous avons développé un test relativement simple dans lequel les molécules de jonction peuvent être surveillés en temps réel pendant la diapédèse des leucocytes dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques en utilisant des anticorps marqués par fluorescence. Ces anticorps n&#39;ont pas interféré avec ou bloquent l&#39;intégrité de jonction ou de la mobilité des protéines ciblées. Ce test nous permet de suivre la dynamique des protéines de jonction au cours du processus de paracellulaire TEM. En outre, ce test permet aussi la discrimination entre les voies de migration paramètres et transcellulaires.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

Au cours de l&#39;inflammation, les leucocytes quittent la circulation et traversent l&#39;endothélium pour lutter contre les pathogènes envahisseurs dans les tissus sous-jacents. Ce processus est connu comme la migration des leucocytes transendotheliale. Deux voies de leucocytes à traverser la monocouche endothéliale ont été décrites: la voie paracellulaire, c&#39;est-à travers les jonctions cellule-cellule et la voie transcellulaire, c&#39;est à dire, à travers le corps de la cellule endothéliale. Cependant, il est techniquement difficile de discriminer entre le paragraphe et la voie transcellulaire. Nous avons développé un test in vitro simple pour étudier la distribution de la VE-cadhérine endogène et PECAM-1 au cours de la migration des neutrophiles transendotheliale dans des conditions d&#39;écoulement physiologiques. Avant de neutrophiles perfusion, les cellules endothéliales ont été brièvement traités avec des anticorps marqués par fluorescence contre VE-cadhérine et PECAM-1. Ces anticorps ne gênent pas la fonction des deux protéines, comme cela a été déterminé par la cellule-électrique SUBSTRAte impédance de détection et PAF mesures. L&#39;utilisation de ce test, nous avons pu suivre la répartition des endogène VE-cadhérine et PECAM-1 lors de la migration trans-endothéliale dans des conditions de débit et de discrimination entre les paramètres et de migration transcellulaire routes des leucocytes à travers l&#39;endothélium.

Nous avons d&#39;abord testé si les anticorps n&#39;ont pas interféré avec la fonction de barrière de l&#39;endothélium. Nous avons mesuré la résistance des monocouches endothéliales en utilisant électrique cellule-substrat impédance de détection (ECIS). Pour plus de détails, voir Van Buul et al. Aucune 13 modification de la résistance a été observé lorsque l&#39;anticorps anti-VE-cadhérine marqué par fluorescence a été ajouté aux cellules (figure 2A). Un anticorps anti-VE-cadhérine qui est bien reconnu pour bloquer la VE-cadhérine fonction réduit considérablement la résistance (Figure 2A). En outre, les anticorps utilisés pour l&#39;imagerie ne pas modifier la dynamique de VE-cadhérine, comme cela a été évalué par mesure de la récupération de fluorescence après photo-blanchiment (FRAP) de la VE-cadhérine-GFP (figure 2B). Après 1-2 min, les neutrophiles ont adhéré à la monocouche endothéliale pouvant être activé comme visualisé dans le canal DIC (figure 3A). Après l&#39;exploration de soi 5-30c, la grande majorité des neutrophiles transmigré à travers la monocouche endothéliale travers les jonctions cellule-cellule qui ont été marquées avec les anticorps dirigés contre le PECAM-1 et VE-cadhérine. Au cours du processus de diapédèse, la distribution de la VE-cadhérine et PECAM-1 a été suivi en temps réel (figure 3B). Sur les sites de diapédèse des neutrophiles, la VE-cadhérine a été perturbé localement et PECAM-1 a montré une structure plus en forme d&#39;anneau. Après l&#39;achèvement de la diapédèse, les jonctions étroites et VE-cadhérine et PECAM-1 clairement déplacés sur les sites de la diapédèse (Figure 3C). Notez que les parties de l&#39;anticorps anti-PECAM-1 ont été détectés sur la surface de la neutrophiles polynucléaires neutrophiles a atteint une fois que le côté baso-latéral de l&#39;endothélium. Toutefois, cela n&#39;a pas empêché les neutrophiles de traverser l&#39;endothélium. Les dynamiques observées de VE-cadhérine en temps réel lors de la migration des neutrophiles transendotheliale étaient en accord avec les travaux de Shaw et ses collègues quiont montré, en utilisant la microscopie confocale et VE-cadhérine-GFP-transfecté les cellules endothéliales, que la VE-cadhérine-GFP diffuse latéralement lorsque les leucocytes ont traversé les jonctions cellule-cellule endotheliales 14. Travailler aussi par Su et ses collègues ont souligné nos observations de PECAM-1. Ils ont montré que la diffusion, à côté latéral VE-cadhérine au passage des leucocytes, PECAM-1 a été redistribué localement dans un anneau autour de la transmigration des neutrophiles à 15. <img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> Figure 1: Dans la chambre d&#39;écoulement vitro. (A) La flèche indique le réservoir à partir duquel le support a besoin d&#39;être rafraîchi. (B) un tube de silicone qui relie la chambre d&#39;écoulement avec la ligne dans l&#39;orifice d&#39;injection pour l&#39;injection Luer PMN sans déconnecter le tube (tête de flèche). (C) Connection d&#39;un écoulement de chambre de vide dans le ballon réservoir rempli de 37 ° C d&#39;écoulement tampon (tête de flèche). (D) de la connexion d&#39;écoulement avec la chambre de TNF-α HUVEC traitées à la tubulure d&#39;écoulement contenant un tampon et placé dans la platine du microscope (tête de flèche). <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2: VE-cadhérine anticorps n&#39;interfèrent pas avec la dynamique ou de la fonction de jonction. (A) impédance monocouche de cellules endothéliales est mesurée à l&#39;aide de l&#39;ECIS. Y-axe exprime impédance en ohms et l&#39;axe des x représente le temps en heures. VE-cadhérine anticorps clone 55-7H1, marqué avec ALEXA647 (ligne bleue) ou isotype IgG témoin-ALEXA647 (ligne rouge) ne modifient pas endothéliale impédance monocouche cellulaire, alors que le VE-cadhérine blocage CL75 anticorps (ligne noire) ne réduire l&#39;impédance . (B </strong&gt;) VE-cadhérine-GFP a été exprimée dans des cellules HUVEC et l&#39;analyse de FRAP utilisant la microscopie confocale a révélé aucun changement dans la récupération de la fluorescence en présence ou en l&#39;absence de la VE-cadhérine 55-7H1 anticorps. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3 VE-cadhérine et PECAM-1 au cours de la distribution des neutrophiles TEM en temps réel. (A) des neutrophiles (marquée avec la ligne blanche) faire adhérer sur l&#39;endothélium et traversant la jonction cellule-cellule sans affecter la distribution de la VE-cadhérine et PECAM -1. (B) des neutrophiles traversant la monocouche endothéliale à travers les jonctions cellule-cellule. Une dispersion locale de la VE-cadhérine et PECAM-1 peuvent être observées lorsqu&#39;un neutrophiles saillie à travers les jonctions cellule-cellule. La ligne blanche illustre présence de neutrophiles encore au-dessus de l&#39;endothélium. Ligne jaune montre tha membrane des neutrophilest est déjà sous endothélium. (C) des neutrophiles a entièrement franchi la monocouche endothéliale. VE-cadhérine et PECAM-1 sont déplacés sur les sites de diapédèse. Ligne jaune illustre frontières de l&#39;neutrophiles transmigré. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Les leucocytes traversent la monocouche endothéliale utilisant le paracellulaire ou la voie transcellulaire. Nous avons développé un test simple de suivre la distribution de jonction endogène VE-cadhérine et PECAM-1 au cours de la migration leucocytaire transendotheliale sous flux physiologique à une discrimination entre les deux voies de transmigration.

Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

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Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Cell Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

19.4K vues.  Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam.  Les leucocytes traversent la monocouche endothéliale utilisant le paracellulaire ou la voie transcellulaire. Nous avons développé un test simple de suivre la distribution de jonction endogène VE-cadhérine et PECAM-1 au cours de la migration leucocytaire transendotheliale sous flux physiologique à une discrimination entre les deux voies de transmigration. 

Vidéo: Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Imagerie en temps réel des leucotriènes B 4</subMigration> Cell Mediated et BLT1 Interactions avec β-arrestine

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel dans le SNC normal et pendant neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

En temps réel l&#39;imagerie en direct de T-signalisation cellulaire Formation Complex

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Human neutrophiles Chambre flux Essai d&#39;adhésion

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imagerie en temps réel et la Quantification du développement de biofilms fongiques en utilisant un système de flux de recirculation en deux phases

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...