Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (MCB 1021831, JM) et J. &amp; E. Programme de recherche biomédicale (Floride ministère de la Santé, JM).

Une. Préparatifs exemples <ol><li> Effectuer la préparation des échantillons et toutes les manipulations échantillon dans une pièce sombre pour prévenir une uncaging indésirables. </li><li> Solubiliser nitrophen DM-((1 - (2-nitro-4 ,5-diméthoxyphényl) - N, N, N &#39;, N&#39;-tétrakis [(oxy-carbonyl)-méthyl] -1,2-éthanediamine) dans 50 mM d&#39;HEPES tampon, mM KCl, pH 7,0 à une concentration finale de 400 pM (100 350 nm ε = 4330 M -1 cm -1 9). </li><li> Ajouter CaCl2 partir de la solution 0,1 M d&#39;atteindre un ratio souhaitable de [Ca 2 +]: [DM-nitrophen]. Pour les protéines ayant une valeur de Kd pour la liaison du Ca 2 + supérieure à 10 uM, le rapport de [Ca 2 +]: [DM-nitrophen] de 1:1 est préférable d&#39;empêcher la liaison de photo-libéré de Ca 2 + à uncaged DM-nitrophen . En effet, compte tenu de la valeur de K d de DM-nitrophen être 10 nM et la concentration totale de DM-nitrophen et Ca 2 + à 400 mM, ~ 90% d&#39;une protéine de liaison de calciumavec K d = 10 uM seront dans la apoform. D&#39;autre part, pour l&#39;étude de Ca 2 + se lier à des protéines avec des Kd ​​&lt;10 uM, il est préférable de diminuer la [Ca 2 +]: rapport [DM-nitrophen] de 0,95 à empêcher Ca 2 + complexation avec l&#39;apo- protéine avant la cage photo-dissociation. </li><li> Solubiliser le composé de référence, K 3 [Fe (III) (CN) 6] ou Na 2 CrO 4, dans le même tampon que pour l&#39;échantillon. </li></ol> 2. Mise en place de l&#39;Expérience <ol><li> La configuration expérimentale de base est représentée sur la figure 2. </li><li> Utiliser un trou de broche (P 2) pour ajuster le diamètre du faisceau de sonde (632 de sortie de nm d&#39;un laser He-Ne, ~ puissance laser de 5 mW) à 1 mm et de propager le faisceau sonde à travers le centre d&#39;une cellule placée dans une température contrôlée support de cellule à l&#39;aide d&#39;un miroir M 1. </li><li> Utiliser un miroir (M 2) en arrière de l&#39;échantillon pour centrer le faisceau de sondesur un centre du détecteur sensible à la position. </li><li> Focaliser le faisceau sonde sur le centre du détecteur de telle manière que la différence de tension entre les deux premières diodes et de fond de deux diodes ainsi que la différence de tension entre les deux diodes sur le côté gauche et droit du détecteur est zéro. </li><li> Par la suite, la forme d&#39;un diamètre du faisceau de pompage, une sortie de 355 nm de Q-switched laser Nd: YAG, 5 ns FWHM) en utilisant un trou d&#39;épingle de 3 mm (P 1) placé entre deux miroirs de laser de 355 nm. </li><li> Copropagate le faisceau de pompage à travers le centre de la cuve comme l&#39;illustre la figure 2. Il est important que les deux faisceaux laser se propagent à travers le centre de la cellule optique de manière à peu près colinéaires afin d&#39;obtenir un angle de déviation mesurable et donc une grande amplitude du signal de PBD. Dans des conditions expérimentales, l&#39;angle de l&#39;intersection des faisceaux sonde et pompe est inférieur à 15 °. </li><li> Utilisez un composé de référence pour aligner la sonde et la pompefaisceau pour obtenir un signal PBD satisfaisante, c&#39;est à dire un bon rapport S / N et stable amplitude PBD sur des échelles de temps plus longues (~ 100 ms). </li><li> Ajuster la position du faisceau de pompage par rapport au faisceau sonde par un ajustement incrémentiel de miroirs laser 355 nm. </li><li> Mesurer l&#39;amplitude du signal de référence PBD comme une différence entre les deux photodiodes en haut et en bas sur le détecteur sensible à la position. Le signal PBD doit présenter une augmentation rapide de l&#39;amplitude sur une échelle de temps rapide (&lt;10 ps) et reste stable sur 100 calendrier ms comme le montre la figure 3. Le tir à la variabilité tiré de l&#39;amplitude APB est à moins de 5% de l&#39;amplitude du signal et la reproductibilité du signal est principalement affectée par les vibrations. </li><li> Vérifier la linéarité de l&#39;amplitude du signal PBD par rapport à l&#39;énergie thermique dégagée par la mesure de la dépendance linéaire du signal PBD sur la puissance du laser d&#39;excitation et le nombre de Einstein absorbé, E un= (10.01-A), où A correspond à l&#39;absorbance de référence à la longueur d&#39;onde d&#39;excitation. </li><li> Maintenir la puissance laser inférieure à environ 1 000 pJ et l&#39;absorbance du composé échantillon / de référence à la longueur d&#39;onde d&#39;excitation inférieur à 0,5 pour éviter une absorption multiphotonique et une diminution de la puissance du faisceau de pompage, respectivement, et d&#39;assurer la linéarité du signal PBD. </li></ol> 3. Mesures PBD <ol><li> Commencez par la mesure des traces PBD pour la référence. Placer la solution du composé de référence dans une cellule de quartz de 0,5 cm x 1,0 cm x 1,0 cm ou 1,0 cm et la position de la cellule dans le support à température contrôlée. Les deux longueurs de trajet fournissent amplitude PBD comparable. </li><li> Détecter le signal de PBD de référence en fonction de la température dans la plage de températures 16-35 ° C avec l&#39;augmentation de température de 3 ° C. </li><li> A chaque changement de température, vérifier la position du faisceau de la sonde sur le détecteur sensible à la position et à nouveauajuster la position du centre du détecteur, si nécessaire. </li><li> Vérifier la linéarité du signal PBD en fonction de la [(dn / dt) / ρ p C] terme conformément à l&#39;équation 2. </li><li> Placer la solution d&#39;échantillon dans la même cellule optique que pour le composé de référence en conservant la même orientation de la cellule optique pour la mesure de référence. </li><li> Détecter les traces de PBD de l&#39;échantillon dans la même gamme de température que pour la référence et vérifier la linéarité de l&#39;amplitude de l&#39;échantillon PBD à l&#39;égard de la [(dn / dt) / C p ρ] terme. </li></ol> 4. Analyse des données L&#39;amplitude de la déviation est directement proportionnelle à la variation de volume due à l&#39;échauffement de l&#39;échantillon (AV th) et de changement de volume non thermique (AV de nonth) selon l&#39;équation 1: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="Equation 1" /> L&#39;amplitude de l&#39;échantillon (A S) Et de référence (A r) signal de PBD peut être décrit en utilisant les équations 2 et 3, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="Equation 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="Equation 3" /> Le signal PBD est directement proportionnelle au paramètre de réponse de l&#39;instrument (K) et le nombre d&#39;Einstein absorbée (E a). Le premier terme de l&#39;équation 2, (dn / dt) (1/ρC p) Q, correspond à la variation du signal due à la chaleur dégagée dans le solvant. Le dn / dt terme représente la variation dépendant de la température de l&#39;indice de réfraction, ρ est la masse volumique du solvant, C p est la capacité calorifique. Tous les paramètres sont connus de l&#39;eau distillée et peut être déterminée pour une solution de tampon en comparant un signal de PBD pour le composé de référence dans de l&#39;eau distillée et dans un tampon approprié. Q est la quantité de returne de chaleurd pour le solvant. Le ρ (dn / d ρ) est un terme constant en unités de moins que est indépendante de la température dans la plage de température de 10-40 ° C 10. Terme abs An correspond à la variation de l&#39;indice de réfraction due à la présence d&#39;espèces absorbantes dans la solution et il est négligeable si la longueur d&#39;onde du faisceau de sonde est déplacé par rapport au spectre d&#39;absorption d&#39;une espèce dans la solution. Le signal issu du composé de référence (A r) est exprimée par l&#39;équation 3 h ν où E est l&#39;énergie des photons à la longueur d&#39;onde d&#39;excitation, E h ν = 80,5 kcal / mol pour 355 nm excitation. <ol><li> Prendre l&#39;amplitude du signal de PBD de référence comme la différence entre la pré-déclenchement et le signal de PBD poste de déclenchement comme illustré dans la figure 3. De la même manière, déterminer l&#39;amplitude de la vitesse (A s rapide) et la phase lente (A s lent) Du signal échantillon de PBD. </li><li> Pour éliminer le paramètre de réponse de l&#39;instrument, K, l&#39;échelle de l&#39;amplitude du signal échantillon de PBD par l&#39;amplitude du signal pour le PBD référence. Le rapport entre le signal d&#39;échantillonnage au signal de référence et donne l&#39;équation 4 peut être écrite comme: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="Equation 4" /> </li><li> En utilisant cette équation, déterminer la chaleur libérée dans la solution (Q) et le changement de volume non thermique (AV de nonth) associée à une réaction de photo-initiée à partir de la pente et l&#39;interception, respectivement, d&#39;un terrain de [(A s / A r) E h ν] terme fonction de la température terme dépendant [(dn / dt) (1/ρCp)]. </li><li> Pour déterminer le volume de réaction et changement d&#39;enthalpie pour le rapide et le lent processus, à l&#39;échelle du volume observé et changement d&#39;enthalpie pour le rendement quantique appropriée selon les équations 5-7. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot; alt = &quot;équation 5&quot; /&gt; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="Equation 6" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="Equation 7" /> Pour un procédé en plusieurs étapes avec une cinétique se produisant sur l&#39;échelle de temps comprise entre 10 ps ~ 200 ms, le volume et les variations d&#39;enthalpie associées aux différentes étapes de la réaction peuvent être déterminées. Les amplitudes et les durées de vie pour les étapes individuelles sont analysées par ajustement des données à la fonction F (t), qui décrit l&#39;évolution temporelle du volume et de changements d&#39;enthalpie. <img alt="Équation 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> où α 0 correspond à la Une s rapide et α i correspond à une lente s pour chaque processus individuel et τ i sont la durée de vie des différentes étapes de réaction. De la dépendance en température de la constante de vitesse de for processus individuels (k i = 1 / τ i) les paramètres d&#39;enthalpie d&#39;activation et d&#39;entropie peut être facilement déterminée en utilisant des parcelles Eyring. </li></ol>

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le principe physique derrière procédés photothermiques qui est une molécule de photo-excité dissipe de l&#39;énergie en excès par relaxation vibrationnelle à l&#39;état de base, ce qui entraîne un chauffage thermique de la 1,12 solvant environnant. Pour les solvants tels que l&#39;eau, ce qui produit une expansion de volume rapide (AV th). Molécules à l&#39;état excité peuvent également subir des processus photochimiques qui entraînent des changements de volume non thermiques (AV <s...

méthodes de photo-thermique tels que la calorimétrie photoacoustique, déviation du faisceau photothermique (APB), et des réseaux transitoires couplé avec une excitation laser nanoseconde représentent une alternative puissante aux transitoires spectroscopies optiques pour les études résolues en temps de courte durée intermédiaires 1,2. Contrairement aux techniques optiques, tels que l&#39;absorption transitoire et la spectroscopie IR, qui contrôlent le profil temporel des changements d&#39;absorption dans le chromophore environnante; techniques photothermiques détecter la dépendance temporelle de l&#39;évolution de la chaleur / volume et donc sont des outils précieux pour l&#39;étude des profils de temps de optiquement processus «silencieux». Jusqu&#39;à présent, la calorimétrie photoacoustique et réseau transitoire a été appliquée avec succès pour étudier la dynamique de conformation des processus photo-induites, y compris la migration de ligand diatomique dans globines 3,4, interactions ligand avec la protéine du capteur d&#39;oxygène FixL 5, électronique et le transport des protons dans l&#39;hème-cuivre oxydases 6 une photosystème II ainsi que photo-isomérisation dans la rhodopsine 7 et dynamique conformationnelle de cryptochromes 8. Pour étendre l&#39;application des techniques photothermiques de systèmes biologiques qui manquent un chromophore interne et / ou fluorophore, la technique PBD a été combiné avec l&#39;utilisation du composé en cage à photo-déclenchement d&#39;une augmentation de la concentration de ligand / substrat à l&#39;intérieur de quelques microsecondes ou plus rapide, en fonction de sur le composé encagé. Cette approche permet la surveillance de la dynamique et de l&#39;énergétique de changements structurels associés à la liaison ligand / substrat de protéines qui manquent un fluorophore interne ou chromophore et sur l&#39;échelle de temps qui ne sont pas accessibles par des instruments arrêt flux commerciaux. Ici, une demande de PBD pour surveiller la thermodynamique du composé de cage, Ca 2 + DM-nitrophen, photo-clivage, ainsi que la cinétique de liaison de Ca 2 + pour le domaine C-terminal de la sonde calcique neuronal vers le basflux réglementation élément antagoniste Modulator (DREAM) est présenté. Le Ca2 + est libéré par photo-Ca 2 + DM-nitrophen à moins de 10 microsecondes et lie de nouveau à une cage unphotolysed avec une constante de temps d&#39;environ 300 microsecondes. D&#39;autre part, en présence d&#39;un apoDREAM cinétique supplémentaire se produisant sur l&#39;échelle de temps d&#39;une milliseconde est observée et reflète la liaison à la protéine ligand. L&#39;application de PBD pour sonder les transitions conformationnelles dans les systèmes biologiques a été quelque peu limitée en raison des difficultés instrumentales; alignement par exemple difficile de la sonde et du faisceau pompe pour obtenir un signal fort PBD et reproductible. Cependant, une conception minutieuse d&#39;une instrumentation mise en place, un contrôle précis de la température, et un alignement précis de la sonde et la pompe faisceau fournissent un signal cohérent et robuste PBD qui permet de contrôler le volume en temps résolu et changements d&#39;enthalpie sur un large échelle de temps de 10 microsecondes à environ 200 ms. En outre, modifications de la procédure expérimentale pour assurer la détection d&#39;échantillon et de référence traces sous température identique, la composition du tampon, de l&#39;orientation de la cellule optique, la puissance du laser, etc réduit sensiblement l&#39;erreur expérimentale dans les volumes et les enthalpies de réaction mesurés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

déviation du faisceau photothermique avec photo-acoustique de la calorimétrie et réseau thermique appartient à la famille des méthodes photothermiques qui surveillent les temps un profil de volume et d&#39;enthalpie changements de lumière induit des changements conformationnels de protéines sur microseconde à la milliseconde des échelles de temps qui ne sont pas accessibles à l&#39;aide traditionnelle d&#39;arrêt -flux instruments. En outre, étant donné que les changements globaux dans le volume et / ou l&#39;enthalpie sont sondés, ces techniques peuvent être appliquées à des protéines et d&#39;autres macromolécules biologiques qui n&#39;ont pas un fluorophore et une étiquette ou d&#39;un chromophore. Pour suivre la dynamique et de l&#39;énergétique de changements structurels associés à Ca 2 + se lier à des transducteurs de calcium, de tels capteurs calciques neuronaux, un composé de calcium en cage, DM-nitrophen, est utilisé pour la photo-déclenchement d&#39;une augmentation rapide (τ &lt;20 ps) en calcium libre concentration et le volume associé et enthalpie changements sont sondés en utilisant une technique de déviation du faisceau photothermique.

Un exemple représentatif de PBD retrace pour Ca 2 + photo-libération de Ca 2 + DM-nitrophen est représenté dans la figure 3. La phase rapide correspond à la photo-clivage de Ca 2 + DM-nitrophen et la libération de Ca 2 +, tandis que la phase lente reflète la liaison du Ca 2 + à la cage nonphotolysed. Le tracé de l&#39;échantillon PBD amplitude pour la phase rapide et lente à l&#39;échelle de l&#39;amplitude du composé de référence en ...

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Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection | Chemistry | Video

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Nous rapportons ici l&#39;application de la technique de déflexion de faisceau photothermique en combinaison avec un composé de calcium mis en cage, DM-nitrophen, pour surveiller microsecondes et une milliseconde dynamique et énergétique des changements structurels associés à l&#39;association de calcium à une sonde calcique neuronal, Regulatory Element aval Antagoniste Modulator .

Milliseconde conformationnels changements dans les protéines résolues par Photothermal déviation du faisceau

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

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8.9K vues.  Florida International University.  Nous rapportons ici l'application de la technique de déflexion de faisceau photothermique en combinaison avec un composé de calcium mis en cage, DM-nitrophen, pour surveiller microsecondes et une milliseconde dynamique et énergétique des changements structurels associés à l'association de calcium à une sonde calcique neuronal, Regulatory Element aval Antagoniste Modulator . 

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Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

Détermination des plans de liaison à la glace des protéines antigel par affinité du plan de glace basée sur la fluorescence

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Recherche

Chimie

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

L&#39;utilisation de la chromatographie en phase gazeuse pour l&#39;analyse compositionnelle modifications des acides gras dans les tissus de foie de rat pendant la grossesse

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarquage et la quantification des niveaux cellulaires de phosphoinositides par chromatographie liquide haute performance couplée flux scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). The fibronectin protein film was immobilized on the silicon nitride (SiN) membrane that forms the SALVI detection area. During ToF-SIMS analysis, three modes of analysis were conducted including high spatial resolution mass spectrometry, two-dimensional (2D) imaging, and depth profiling. Mass spectra were acquired in both positive and negative modes. Deionized water was also analyzed as a reference sample. Our results show that the fibronectin film in water has more distinct and stronger water cluster peaks compared to water alone. Characteristic peaks of amino acid fragments are also observable in the hydrated protein ToF-SIMS spectra. These results illustrate that protein molecule adsorption on a surface can be studied dynamically using SALVI and ToF-SIMS in the liquid environment for the first time.

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work presents a protocol for liquid handling and sample introduction to a microchannel for in situ time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of protein biomolecules in an aqueous solution.

La caractérisation in situ des protéines hydratés dans l&#39;eau par Salvi TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Un dosage de HS-MRM pour la Quantification des protéines de la cellule-hôte en protéine Biopharmaceuticals par chromatographie en phase liquide Ion Mobility QTOF spectrométrie de masse

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

Résolution temporelle des composés organiques Photophysiques caractérisation du Triplet-récolte à un sans oxygène environnement utilisant un iCCD caméra

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

ADN-magnétoscopie liaison analyse par diffusion de la lumière dynamique et électrophorèse

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

La co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes Fusion de façon efficace dans les plantes

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound electrons with neutral molecules/atoms. State-of-the-art in vacuo anion generation techniques allow application to a broad range of atomic, molecular, and cluster anion systems. These are separated and selected using time-of-flight mass spectrometry. Electrons are removed by linearly polarized photons (photo detachment) using table-top laser sources which provide ready access to excitation energies from the infra-red to the near ultraviolet. Detecting the photoelectrons with a velocity mapped imaging lens and position sensitive detector means that, in principle, every photoelectron reaches the detector and the detection efficiency is uniform for all kinetic energies. Photoelectron spectra extracted from the images via mathematical reconstruction using an inverse Abel transformation reveal details of the anion internal energy state distribution and the resultant neutral energy states. At low electron kinetic energy, typical resolution is sufficient to reveal energy level differences on the order of a few millielectron-volts, i.e., different vibrational levels for molecular species or spin-orbit splitting in atoms. Photoelectron angular distributions extracted from the inverse Abel transformation represent the signatures of the bound electron orbital, allowing more detailed probing of electronic structure. The spectra and angular distributions also encode details of the interactions between the outgoing electron and the residual neutral species subsequent to excitation. The technique is illustrated by the application to an atomic anion (F&#8722;), but it can also be applied to the measurement of molecular anion spectroscopy, the study of low lying anion resonances (as an alternative to scattering experiments) and femtosecond (fs) time resolved studies of the dynamic evolution of anions.

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&lt;sup&gt;&amp;#8722;&lt;/sup&gt;

Here, we present a protocol for photoelectron imaging of anionic species. Anions generated in vacuo and separated by mass spectrometry are probed using velocity mapped photoelectron imaging, providing details of anion and neutral energy levels, anion and neutral structure and the nature of the anion electronic state.

Imagerie de photoélectrons des Anions illustré par 310 Nm détachement de F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

Amélioration d’Extrusion de haute viscosité de microcristaux de Time-resolved série femtoseconde cristallographie à rayons x Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...