Nous remercions le cœur des flux UMass cytométrie: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu et Tammy Krupoch. Ce travail a été financé par le NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) et le NIH CA T32-130 807 (JRS). Les ressources de base soutenu par le diabète de recherche en endocrinologie Centre DK32520 subventions ont également été utilisés.

1. La récolte des tissus <ol><li> Préparer des tubes contenant 2 à 5 ml tampon de coloration à froid (tampon phosphate salin (PBS) avec ajout de BSA 0,2% et glucose 5 mM). Garder les tubes sur la glace avant la récolte des tissus. </li><li> Cull souris selon le protocole approuvé approprié (par exemple le CO 2 par inhalation suivie de dislocation cervicale). </li><li> Prélever du sang par ponction cardiaque sur EDTA ou héparine de collecte de sang pour une analyse ultérieure des tubes, par exemple, de l&#39;hématocrite, numération des réticulocytes ou l&#39;analyse de la SRC. </li><li> Récolte de la rate et des os, des tissus de placer de chaque souris dans un tube séparé, préparé à l&#39;étape 1. Un accès facile à la rate est du côté gauche. Pour la moelle osseuse, la récolte d&#39;une ou deux fémurs. Gardez les tissus récoltés sur la glace. </li><li> Si désiré, peser la rate. Souris subissant une réponse au stress érythropoïétique sont susceptibles de montrer une augmentation significative du poids de la rate. </li></ol> 2. Préparation des cellules spléniques <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un pré-humidifiées 3 ml piston de la seringue, poussez doucement la rate, ou une partie de la rate (idéalement, 0,1 gramme ou moins, ce qui équivaut à environ 10 8 cellules) à travers une passoire 40 um de cellules stériles (numéro de catalogue Fisherbrand 22363547 ou autre) placé sur le dessus d&#39;un tube conique de 50 ml. Maintenir le tube sur la glace pendant cette procédure. Laver les cellules à travers le tamis avec un total de 2 ml tampon de coloration. </li><li> Délicatement la pipette la suspension cellulaire tendues pour briser les mottes de petite taille. Si nécessaire, re-déformation des cellules. </li><li> Laver les cellules deux fois par centrifugation et remettre en suspension dans un tampon de froid. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Les rendements typiques sont 1-2 x 10 8 cellules / rate. Pour cytométrie en flux analyse, aliquotes de 1 à 2.000.000 cellules par échantillon, soit dans des tubes FACS coloration (BD Falcon polystyrène à fond rond tubes, 352 008) ou à fond en U 96 puits (BD Falcon 353 910). Volume de coloration de l&#39;échantillon est 200 pi, à une concentration cellulaire finale 0,5 à 1 x 10 7 cellules / ml ou 1-2 x 10 6 cellules / échantillon de 200 pi. </li></ol> 3. Préparation des cellules de moelle osseuse <ol><li> Préparez 1 ou 3 seringues ml avec une aiguille attachée 26G, pré-rempli avec le tampon de coloration à froid. </li><li> Enlever les muscles attachés au fémur afin de visualiser l&#39;os clairement. </li><li> En utilisant des ciseaux chirurgicaux pointus, coupez les deux extrémités du fémur, aussi près que possible des extrémités de l&#39;os. Cela devrait révéler un petit trou à chaque extrémité coupée, entraînant dans la cavité de la moelle osseuse, qui traverse la longueur du fémur. </li><li> Utiliser des seringues pré-remplies à l&#39;étape 1, insérer l&#39;aiguille dans un de ces trous, et doucement rincer la moelle par le trou à l&#39;autre bout, dans un tube. </li><li> Dissocier les cellules vidées par pipetage doux, et passer dans une passoire 40 um que pour la rate plus haut (voir section 2.1). </li><li> Laver les cellules deux fois par centrifugation dans un tampon de coloration à froid </li><li> Compter les cellules et resuspendre comme dans la section 2.4. Les rendements typiques sont d&#39;environ 10 7 cellules par le fémur. </li></ol> 4. Préparation des cellules de foie foetal <ol><li> Pour préparer chronométré enceintes souris femelles, mis en place pour l&#39;accouplement des souris dans la soirée; examiner pour les bouchons vaginaux avant 10 h le lendemain, le jour où le bouchon vaginal est détecté est considéré comme jour 0.5. Le personnel vétérinaire peut être en mesure d&#39;aider les enquêteurs qui sont peu familiers avec cette technique pour identifier les femmes enceintes. La grossesse peut également être déterminé par le poids de la souris de contrôle. </li><li> Timed enceintes souris femelles sont abattues sur les jours de 12,5 à 14,5 de la grossesse. Les cornes utérines sont enlevés dans une boîte de Petri contenant glacée milieu de culture ou de tampon de coloration. </li><li> Les embryons sont retirés de chaque utérus et le foie fœtal est disséqué. Un microscope à dissection est nécessaire pour jour embryonnaire 12,5 (E12.5) ou moins. </li><li> Foies peuvent être dissociées mécaniquement par pipetage dans un tampon, et sont traitées individuellement dans des plaques 96 puits, ou regroupés, selon les exigences expérimentales. </li><li> Un foie fœtal à E13.5 a ~ 10 7 cellules. Les cellules sont lavées deux fois dans la coloration de tampon et remises en suspension à 1-2 x 10 6 cellules / échantillon de 200 ul pour l&#39;analyse par cytométrie en flux. </li></ol> 5. Coloration des anticorps pour la cytométrie en flux <ol><li> Préparer un anticorps primaire coloration pré-mix à être utilisé pour tous les échantillons, sauf pour les échantillons de contrôle, contenant les éléments suivants: <ul><li> ChromePure IgG de lapin (Jackson, 015-000-003), à une concentration finale de 200μg/ml. Vérifiez la concentration des stocks sur la bouteille (elle peut varier). Ceci est utilisé pour bloquer les récepteurs Fc des cellules de souris, des espèces alternatives qui peuvent être utilisées pour cela sont IgG de souris ou rat IgG. Le choix des espèces est déterminée par la présence potentielle dans le protocole de coloration des anticorps secondaire dirigé contre primaires de rat / souris / lapin des anticorps, dans ce cas, ces espèces ne peuvent pas être utiliséD que les anticorps bloquant. Alternativement, sérum de lapin 5% peut également être utilisée à la place de IgG purifiées. Une autre alternative est l&#39;utilisation d&#39;anticorps monoclonaux ou des fragments Fab dirigés au niveau des récepteurs Fc de souris. Le protocole de base ci-dessous ne comprennent pas les anticorps IgG secondaire et donc d&#39;aucune des trois espèces peuvent être utilisées. </li><li> CD71-FITC, dilué 1:200 (stock 0.5mg/ml, BD-Biosciences, 553266) </li><li> Ter119-PE, dilué 1:200 (stock 0.2mg/ml, BD-Biosciences, 553673) </li><li> Tout anticorps supplémentaire destinée à des épitopes de surface de l&#39;intérêt, par exemple des anticorps dirigés au Fas ou FasL (voir 1,2). Mélanger délicatement la solution d&#39;anticorps en inversant le tube 2-3 fois. </li></ul></li><li> Ajouter 200 pi de la pré-mélange pour chaque échantillon de cellules et doucement remettre en suspension les cellules. </li><li> Préparer des échantillons de cellules de contrôle comme suit: <ul><li> «Non marqué»: ces cellules sont laissées à la coloration de tampon et de fournir l&#39;autofluorescence de fond des cellules. </li><li> «Couleur unique&quot; contrôles: un contrôle est nécessaire pour chaque anticorps / couleur utilisée dans le protocole. Les cellules de ces contrôles sont colorées soit avec un anticorps directement conjugués primaire, ou avec les deux un anticorps primaire et un anticorps secondaire conjugué. Ces contrôles sont utilisés pour corriger les chevauchements entre les canaux spectraux. </li><li> &#39;Fluorescence moins un &quot;(FMO) contrôles: un contrôle est nécessaire pour chaque anticorps / couleur dans le protocole: les cellules sont colorées avec toutes les couleurs / anticorps dans le protocole, sauf pour la couleur / anticorps pour lesquels cela est le contrôle FMO. Le contrôle FMO pour un canal particulier fournit le vrai fond de ce canal. Il peut s&#39;agir non spécifique d&#39;anticorps de même isotype, et conjugué avec la même marque de fluorescence de l&#39;anticorps d&#39;essai (contrôle isotypique). </li></ul></li><li> Incuber les échantillons et les contrôles pertinents dans l&#39;anticorps primaire tache sur la glace pendant 45 &#39;à 1 heure dans le noir (mettre du papier d&#39;aluminium sur le couvercle seau à glace). </li><li> A la fin de l&#39;incubation, laver les cellules en ajoutant 3ml de tampon de coloration pour chaque tube d&#39;échantillon et de spin de 3 &#39;à 5&#39; à environ 400 xg à 4 ° C. Si vous utilisez des plaques de 96 puits, laver les cellules à trois reprises dans un volume de 200 pl. </li><li> Le cas échéant, appliquer anticorps secondaire tache. Appliquer et laver comme pour le premier anticorps tache. </li><li> Le cas échéant, une tache avec de l&#39;annexine V est appliquée à la fin de l&#39;incubation, en utilisant un tampon HEPES comme dans les instructions du fabricant. Cette tache est appliquée pendant 15 minutes à température ambiante, ou pendant 1 heure sur la glace. </li><li> Les cellules sont re-suspendu pour cytométrie en flux d&#39;analyse de la coloration solution contenant un colorant ADN cellulaire imperméable, d&#39;exclure les cellules mortes. Plusieurs colorants ADN sont disponibles, y compris l&#39;iodure de propidium, 7-amino-actinomycine D (7AAD), ou DAPI. Le choix parmi ces dépend des canaux disponibles, étant donné les canaux pris pour la coloration des anticorps spécifiques, et les canaux disponibles sur le cytomètre de flux-. 7AAD est obtenu à partir de BD-Biosciences (559 925) et utilisé conformément aux instructions du fabricant. Pour la coloration DAPI, faire un bilan de 1mg/ml dans le diméthylformamide (DMF) à partir de poudre (Roche, Cat # 236276), conserver à -20 ° C, et diluer à 1:10,000 1:15,000 dans la coloration de mémoire tampon. </li></ol> 6. Cytométrie en flux de tri <ol><li> Les cellules sont marquées avec des anticorps contre le CD71, Ter119, marqueurs lignée, et la viabilité d&#39;un colorant comme décrit pour l&#39;analyse par cytométrie en flux (article 5). La concentration cellulaire pendant l&#39;étiquetage peut être augmentée à 5 x 10 7 / ml. </li><li> Mélanger un volume égal de chacun des anticorps à la suite de faire le master mix lignée: <ul><li> Rat FITC anti-souris CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553848 </li><li> Rat FITC anti-souris CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553087 </li><li> Hamster FITC anti-souris CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061 </li><li> FITC rat anti-souris CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396 </li><li> Rat FITC anti-souris Ly-6G et Ly-6C (GR-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126 </li><li> Utiliser le mélange maître à 1:80 (Ceci est équivalent à 1:400 dilution de chacun stocks d&#39;anticorps individuels, qui sont tous de 0,5 mg / ml). </li></ul></li><li> Utiliser des conditions de tri à basse pression et les buses de large. Pour l&#39;Aria (BD Biosciences), nous utilisons 100 μ buse, 20 psi. </li><li> Collection tampon: PBS avec ajouté 20% de sérum de veau fœtal. </li><li> Pour vérifier la pureté des populations triées, ré-exécuter une petite aliquote de chaque échantillon dans un tampon qui contient un colorant viabilité (7AAD ou similaire). </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: CD71/Ter119 coloration de moelle osseuse adulte ou de la rate identifie une séquence de développement de quatre sous-ensembles, étiquetées ProE, Erya, EryB et Eryc (figure 1) 1. Morphologiquement, elles correspondent à des érythroblastes en plus mature. La figure 1 illustre la séquence de déclenchement à l&#39;étape de l&#39;analyse de données, qui se défait événement très petite taille (y compris les noyaux, les globules rouges), les cellules agrégées et les cellules mortes. Expression des protéines de surface cellulaire peut être mesurée simultanément pour chacun de ces sous-ensembles, en ajoutant que les anticorps concernés au même moment que Ter119 et CD71 coloration. La figure 1 montre un exemple de surface cellulaire d&#39;expression du récepteur de mort Fas 1. Cette mesure a été réalisée chez des souris injectées avec l&#39;EPO, ou chez les souris témoins injectés avec une solution saline. Il est évident que l&#39;Epo supprime l&#39;expression de Fas dans la population Erya in vivo 1. Expression de protéines intracellulaires ou le statut du cycle cellulaire peut également être mesurée pour les cellules dans chaque sous-ensemble. La figure 2 illustre représentant l&#39;analyse du cycle cellulaire des cellules fraîchement récoltées moelle osseuse. Ces mesures nécessitent, en plus de coloration de surface des cellules CD71 et avec Ter119, la fixation et perméabilisation des cellules pour l&#39;étiquetage intracellulaire (voir la section Discussion). Dans le foie fœtal, non érythroïdes cellules sont d&#39;abord exclus par gating sur «Lin-» les cellules qui sont négatives pour CD41, Mac-1, Gr-1, B220 et CD3 (figure 3). Les cellules restantes sont sous-divisé en 6 sous-ensembles, S0 à S5. Le modèle précis de cellules dans le foie fœtal dépend de l&#39;âge embryonnaire (voir section Discussion). Une analyse de cellules représentatives du cycle du sous-ensemble S3 dans E13.5 foie fœtal est montré (figure 4). <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1 Les sous-ensembles CD71/Ter119 érythroïde dans la rate de souris stratégie Gating A.:.. Les cellules de rate ont été traités et étiquetés avec des anticorps dirigés au CD71, Ter119 et Fas. Cette figure montre la stratégie d&#39;analyse suite à l&#39;étape d&#39;acquisition de données. Histogramme I montre des événements tous les acquis. La porte diagonale représente les événements qui sont susceptibles d&#39;être des cellules individuelles, à l&#39;exclusion des doublets ou des agrégats plus gros. Les cellules de cette porte sont analysés plus en histogramme II. Voici des événements très petites, les noyaux probable ou de débris, sont exclus. Les cellules fermée sont présentés dans l&#39;histogramme III, où DAPI cellules positives, qui sont susceptibles de membrane perméable cellules apoptotiques, sont exclus de l&#39;analyse. Histogramme IV montre la population résultant de cellules spléniques viables. Le portail contient ProE CD71 haute Ter119 cellules intermédiaires. Ter119 cellules haute sont analysés plus en histogramme V. Voici CD71 cellules haute sont subdivisés en moins matures, grand érythroblastes &#39;Erya (CD71 haute Ter119 haute FSC élevé) et plus petit, plus mature érythroblastes&#39; EryB (CD71 haute Ter119 haute FSC basse) . Le sous-ensemble des érythroblastes les plus matures est Eryc (CD71 faible Ter119 haute FSC basse). VI Histogramme expression de Fas à la surface cellulaire, en particulier dans le sous-ensemble Erya, chez la souris à l&#39;état basal (injecté avec du sérum physiologique), et les souris injectées avec une dose unique de l&#39;Epo. La coloration avec des anticorps Fas a été réalisée simultanément avec la coloration CD71/Ter119. Cytospin B. préparations de cellules triées à partir de chacun des sous-ensembles indiqués. Les cellules ont été colorées au Giemsa et avec diaminobenzidine, celui-ci génère une tache brune à l&#39;hémoglobine. Cytospin données a été initialement publié dans Liu et al. Blood. 2006 Jul 1; 108 (1) :123-33. Epub mars 2006 9. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Analyse du cycle cellulaire de CD71 haute Ter119 érythroblastes élevé dans la moelle osseuse de souris. Des souris ont été injectés par voie intrapéritonéale avec BrdU, et la rate ou de moelle osseuse ont été récoltés 30 à 60 minutes plus tard. Les cellules ont été fixées et perméabilisées et en plus d&#39;être colorées pour CD71 et Ter119, ont été colorées pour l&#39;incorporation de BrdU dans leur ADN réplication avec un anticorps monoclonal dirigé au BrdU (protocole de fixation, et de perméabilisation BrdU-coloration a été selon les instructions du fabricant). BrdU positives cellules sont en phase S du cycle. Cellules en interphase sont BrdU négative et peut être résolu en phases G1 ou G2 / M, en utilisant l&#39;ADN de teinture 7AAD. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3 sous-ensembles CD71/Ter119 érythroïdes dans le foie de souris fœtales stratégie Gating A.:.. Les cellules du foie fœtal ont été étiquetés pour CD71, Ter119, et un cocktail d&#39;anticorps marqués FITC dirigés au niveau des marqueurs lignée non érythroïdes («Lin»). Les cellules viables (7AAD-négatifs) ont été analysés pour l&#39;expression de Lin, et le Lin-cellules sont ensuite subdivisés en sous-ensembles érythroïdes S0 à S5. Jeune, E13 foie fœtal est composé d&#39;érythroblastes moins matures, en témoigne l&#39;absence de cellules dans le S4/S5 matures sous-ensembles. Cytospin B. préparations de cellules triées à partir de chacun des sous-ensembles indiqués. Les cellules ont été colorées au Giemsa et avec diaminobenzidine, celui-ci génère une tache brune à l&#39;hémoglobine. Des données Cytospin était à l&#39;origine publié au Pop et al, Biol PLoS 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Analyse du cycle cellulaire des cellules érythroïdes du fœtus sous-ensembles du foie. Des souris gravides ont été injectés avec BrdU, et le foie du fœtus ont été récoltés 30 à 60 minutes plus tard, fixées, perméabilisées et colorées avec des anticorps contre le CD71, Ter119 et BrdU. L&#39;état du cycle cellulaire des cellules S3 est montré.

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	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université du Massachusetts Medical School comité IACUC.

La méthodologie cytométrie en flux permet l&#39;étude simultanée de toutes les fonctions cellulaires qui peuvent être détectées avec un anticorps conjugué à fluorescence spécifique ou ligand, y compris les marqueurs de surface cellulaire, l&#39;expression des protéines, la survie cellulaire, signalisation cellulaire en utilisant des anticorps phospho-spécifiques 3 et l&#39;état du cycle cellulaire. Ces mesures peuvent être effectuées dans chacun d&#39;un nombre de différenciation au stade des ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Fas-biotine </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Streptavidine-APC </td><td> Molecular Probes </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 um tamis cellulaire stérile </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> Polystyrène fond rond tubes pour la coloration FACS </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> À fond en U 96 puits </td><td> BD Falcon </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure IgG de lapin </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD-Biosciences </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI en poudre </td><td> Roche </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> Rat FITC anti-souris CD41 MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> Rat FITC anti-souris CD45R/B220 RA3-6B2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> Rat FITC anti-souris CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> Rat FITC anti-souris Ly-6G et Ly-6C (GR-1) RB6-8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> Hamster FITC anti-souris CD3e 145-2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC kit de BrdU débit </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Annexine V-biotine </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

L&#39;étude de l&#39;érythropoïèse a pour objectif de comprendre comment les cellules rouges sont formés à partir de progéniteurs hématopoïétiques et érythroïdes tôt. Plus précisément, le taux de formation de globules rouges est régulée par l&#39;hormone érythropoïétine (Epo), dont la synthèse est déclenchée par une hypoxie tissulaire. Une menace pour les résultats adéquats oxygénation tissulaire à une augmentation rapide de l&#39;Epo, la conduite d&#39;une augmentation du taux de l&#39;érythropoïèse, un processus connu comme la réponse au stress érythropoïétique. L&#39;augmentation du nombre de cellules circulantes rouges améliore l&#39;apport d&#39;oxygène des tissus. Une réponse au stress efficaces érythropoïétique est donc essentielle à la survie et au rétablissement de conditions physiologiques et pathologiques telles que l&#39;altitude élevée, une anémie, des hémorragies, une chimiothérapie ou une transplantation de cellules souches. La souris est un modèle clé pour l&#39;étude de l&#39;érythropoïèse et sa réponse au stress. Souris érythropoïèse définitive (de type adulte) a lieu dans le foie fœtal entre les jours embryonnaires 12,5 et 15,5, dans la rate néonatale, et dans la rate et la moelle osseuse adulte. Les méthodes classiques d&#39;identification progéniteurs érythroïdes dans le tissu reposent sur la capacité de ces cellules pour donner naissance à des colonies de cellules rouges lorsque plaquées Epo contenant milieux semi-solides. Leur descendance précurseurs érythroïdes sont identifiés sur la base des critères morphologiques. Aucune de ces méthodes classiques permettent d&#39;accéder à un grand nombre de cellules érythroïdes différenciation spécifiques au stade de l&#39;étude moléculaire. Nous présentons ici une méthode cytométrie en flux d&#39;identifier et d&#39;étudier la différenciation spécifiques au stade progéniteurs érythroïdes et des précurseurs, directement dans le contexte d&#39;un tissu de souris fraîchement isolées. Le test repose sur les marqueurs de surface cellulaire CD71, Ter119, et sur la cytométrie en flux &quot;en avant-scatter&quot; paramètre, qui est fonction de la taille des cellules. Le dosage de CD71/Ter119 peut être utilisé pour étudier les progéniteurs érythroïdes au cours de leur réponse au stress érythropoïétique in vivo, par exemple, chez la souris anémiques ou souris logés dans des conditions pauvres en oxygène. Il peut également être utilisée pour étudier les progéniteurs érythroïdes directement dans les tissus de souris adultes génétiquement modifiés ou des embryons, afin d&#39;évaluer le rôle spécifique de la voie moléculaire modifiée dans l&#39;érythropoïèse.

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Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Une méthode cytométrie en flux pour l&#39;identification et l&#39;analyse moléculaire de la différenciation-spécifiques au stade progéniteurs érythroïdes murines et précurseurs, directement dans la moelle osseuse de souris fraîchement récoltés, de la rate ou du foie fœtal. Le test repose sur la surface des cellules CD71 marqueurs, Ter119, et la taille des cellules.

Identification et analyse des progéniteurs érythroïdes de la souris en utilisant les CD71/TER119 cytométrie en flux Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

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Biology

31.8K vues.  University of Massachusetts Medical School. Une méthode cytométrie en flux pour l'identification et l'analyse moléculaire de la différenciation-spécifiques au stade progéniteurs érythroïdes murines et précurseurs, directement dans la moelle osseuse de souris fraîchement récoltés, de la rate ou du foie fœtal. Le test repose sur la surface des cellules CD71 marqueurs, Ter119, et la taille des cellules.

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A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

Un dosage quantitatif de l&#39;insuline exprimer formant colonie Progéniteurs

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Recherche

Biologie

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Essai de dépistage basé sur sA-MD-Galactosidase pour l'identification des médicaments sérothérapeutiques

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identification, isolement et caractérisation des progéniteurs fibro-adipogéniques (PAF) et des progéniteurs myogéniques (MP) dans le muscle squelettique chez le rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

Isolement des progéniteurs mégacarytaires de souris

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

Analyse quantitative de la mitophagie dans les cellules β pancréatiques murines

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

Pleins feux sur l’auteur : Évaluation du flux de mitophagie dans les cellules β pancréatiques à l’aide d’approches complémentaires efficaces et robustes 

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

Approches complémentaires pour interroger le flux de mitophagie dans les cellules β pancréatiques

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Analyse quantitative de l’auto-agrégation microbienne à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la recherche sur l’auto-agrégation microbienne à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

Cytométrie en flux d’imagerie pour étudier l’auto-agrégation microbienne

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...