Les auteurs remercient le flux de recherche cytométrie de base à l&#39;hôpital Fondation de la recherche pour enfants de Cincinnati et Richard Demarco, Sherree ami, et Scott Mardochée du Amnis Corporation (partie de EMD Millipore) pour le support technique expert. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde K08HL088126 et R01HL116352 (TAK) et P30 DK090971 (YZ).

1. Long terme in vitro érythropoïèse Culture (Ex vivo différenciation érythroïde Protocole Culture par Giarratana et al. 8, modifié et adapté pour les cellules de souris) Il s&#39;agit d&#39;un long terme en 3 étapes dans le protocole de l&#39;érythropoïèse vitro. Dans la première étape (0-4 jours) 2 x 10 5 cellules / ml sont placés dans un milieu de croissance supplémenté avec érythroblastes le facteur des cellules souches (SCF), l&#39;interleukine-3 (IL-3), et d&#39;érythropoïétine (Epo). Dans la seconde étape (5-6 jours), les cellules sont remises en suspension à 2 x 10 5 cellules / ml et en co-culture sur des cellules stromales adhérentes (MS5) dans du milieu de croissance frais additionné d&#39;érythroblastes seulement avec Epo. Dans la troisième étape (7-9 jours), les cellules sont cultivées sur une couche de MS-5 les cellules dans un milieu de croissance des érythroblastes frais sans cytokines jusqu&#39;à énucléation (Figure 1A). Tous les protocoles d&#39;animaux ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) deMedical Center Hospital de Cincinnati Children. <ol><li> Récolte des os et l&#39;isolement de cellules de moelle osseuse faible densité <ol><li> Ajouter 2 ml de IMDM stérile contenant 2% de sérum bovin fœtal (FBS) dans un tube conique de 15 ml et conserver sur de la glace. </li><li> Euthanasier un vieux 2-6 mois C57/BL6 souris de type sauvage (avec ou sans souris génétiquement ciblée d&#39;intérêt) à la suite institution approuvée par le protocole (par exemple inhalation de CO 2, suivie par dislocation cervicale). </li><li> Isoler les os du bassin, fémurs, tibias et des deux jambes à la pince et scalpel, ajoutez-les dans le tube contenant IMDM 2% de FBS et garder sur la glace. </li><li> Ajouter 1 ml IMDM 2% de FBS dans un tube cytométrie de flux stérile et rincer os en utilisant une pince et une seringue à tuberculine avec un 25-G x 5/8 &quot;aiguille. IMDM Flush 2% de FBS à travers les os quelques fois doucement ( en aspirant ~ 500 ul de la suspension cellulaire et de rinçage à nouveau à travers l&#39;os), et de recueillir des cellules de la moelle osseuse dans le flux-cytometrtube de y. Flushing est complète lorsque les os apparaissent en blanc. </li><li> Filtrer suspension cellulaire par un 40-um tamis cellulaire appareil au-dessus d&#39;un tube conique de 50 ml. Laver avec tamis cellulaire IMDM 2% de FBS et en utilisant le même moyen d&#39;ajuster le volume final de la suspension cellulaire à 5 ml. </li><li> Préparer des cellules de moelle osseuse de faible densité (ldbm) par centrifugation en gradient de densité: superposer soigneusement les 5 ml de suspension cellulaire par 5 ml de séparation cellulaire à gradient de densité moyenne 1,083 g / ml dans un tube de 15 ml et on centrifuge à 750 g pendant 25 min à température ambiante (RT), sans accélération de freinage / bas. </li><li> Transférer le surnageant (de tout jusqu&#39;à environ la marque de 2 ml du tube de 15 ml afin d&#39;acquérir couche leuco-plaquettaire) dans un nouveau tube de 15 ml et effectuer un lavage plus avec IMDM 2% de FBS à 525 g pendant 5 min à RT. </li><li> Aspirer le surnageant et lyser des globules rouges (RBC) restant en mettant en suspension le culot dans 3 ml de tampon de lyse RBC pendant 5 min à température ambiante. Si une plus grande pureté des érythroblastes estnécessaire à l&#39;étape finale (par exemple pour les études biochimiques), purifier les cellules ldbm encore à cette étape de cellules neg Lin par séparation magnétique. </li></ol></li><li> Ex vivo la différenciation érythroïde protocole de culture à partir de cellules ou LDBM neg Lin (Figure 1A) <ol><li> Ajouter 7 ml IMDM 2% de FBS, rotation à 525 g pendant 5 min à température ambiante et remettre en suspension le culot cellulaire dans 2 ml de milieu de croissance des érythroblastes (EGM), composé de: une. Moyen STEMPRO-34, contenant b. 2,6% STEMPRO-34 moyen supplément, c. 20% de BIT-9500, d. Sulfate ferreux 900 ng / ml, e. 90 ml de nitrate ng / ferrique, f. 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine, 2 mM de L-glutamine g. 10 -6 M d&#39;hydrocortisone h. et des cytokines fraîchement ajoutée: i) 100 ng / ml SCF, ii) de 5 ng / ml d&#39;IL-3, et iii) 3 UI / ml Epo. </li><li> Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatique ou manuellement à l&#39;aide d&#39;un microscope d&#39;un ourletocytometer. </li><li> Plaque dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits à une concentration de 5 x 10 5 cellules / puits à un volume final de 2,5 ml dans EGM (2 x 10 5 ldbm cellules / ml) et incuber à 37 ° C (ce qui est considéré comme le jour # 0 de la culture). </li><li> Changer le milieu par aspiration 1,5 ml du surnageant, tournant à 525 g pendant 5 min à température ambiante, la remise en suspension dans 1,5 ml de milieu frais contenant tous les trois cytokines et ajoutant au puits chaque jour les jours 2, 3, 4, afin d&#39;optimiser phase de prolifération. Au jour 3, enlever toutes les cellules, compter et divisé en un nombre approprié de puits afin de maintenir les concentrations de cellules et de ~ 2 x 10 5 cellules / ml. Maintenir la culture à 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Au jour 4, les cellules de la plaque MS5 (lignée cellulaire stromale murine) aux puits d&#39;une nouvelle culture cellulaire plaque à 6 puits. Le milieu de culture cellulaire est MS5 α-MEM contenant 20% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine. </li><li> Au jour 5, compter le nombre deles cellules (à présent nettement enrichi en érythroblastes) dans chaque puits de la plaque de culture d&#39;origine en utilisant un compteur de cellules automatique ou manuellement au microscope en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Lever toutes les cellules de chaque puits et transférer dans des tubes coniques de 15 ml, centrifuger à 525 g pendant 5 min à température ambiante, aspirer le surnageant et dissoudre des pastilles avec EGM frais ne contenant que de l&#39;Epo (3 UI / ml) à une concentration de 2 x 10 5 cellules / ml. </li><li> Aspirer le surnageant des puits où MS-5 cellules ont été étalées la veille (cible à 70-80% de confluence au moment de la co-culture) et ajoutent les cellules érythroïdes dans ces puits dans EGM ne contenant que de l&#39;Epo (mais pas moyen de leur choix, MS-5 cellules survivent bien dans EGM pendant plusieurs jours). </li><li> Changer le milieu ajoutant frais OEB le jour # 6. </li><li> Changer le milieu du jour # 7, en utilisant EGM sans cytokines ajoutés. Les jours de 7 à 9, les échantillons d&#39;essai pour l&#39;énucléation de cytométrie de flux après coloration avec anti-Ter119 et Syto-16 tous les jours et procéder aux taches échantillons pour Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux (tel que décrit dans la section 3). Remarque:. Avant de placage et le jour 2, 4, 6, et 7 de la culture, de surveiller les cellules en culture pour l&#39;enrichissement des érythroblastes et la différenciation avec la cytométrie de flux par l&#39;évaluation des marqueurs de surface CD44 et Ter119 vs taille (FSC) 9 Sinon CD71, Ter119, et FSC peut également être utilisé 10, 11. </li></ol></li></ol> 2. Rapide énucléation dosage, selon le protocole décrit par Yoshida et al. 12 avec modifications (figure 1B) <ol><li> Stress érythropoïèse induction et le stroma préparation cellulaire pour la culture de l&#39;érythropoïèse in vitro <ol><li> Anesthésier un vieux 2-6 mois type sauvage C57/BL6 la souris selon les lignes directrices du IACUC (par exemple avec une solution de l&#39;isoflurane). Assurez-vous que la souris a été correctement anesthésié par la vérification de l&#39;absence de réponses réflexes à une douce biche patte pincement et pourrespirations régulières au cours de la procédure. Utilisez vétérinaire pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. </li><li> Induire un stress érythropoïèse par la queue saignement à un volume final de 500 pl. En utilisant une seringue à insuline, injecter un volume égal de solution saline normale par voie intrapéritonéale d&#39;assurer la réanimation liquidienne de l&#39;animal (tenir animal en position déclive avant l&#39;injection et injecter dans le bas de l&#39;abdomen afin de ne pas endommager les organes internes). </li><li> Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait repris le contrôle du moteur, comme indiqué par l&#39;animal commence à se déplacer autour de la cage et être capable de se tenir debout et marcher sans tomber. La souris phlébotomisé est placé dans une cage sans autres souris. </li><li> Après 2 jours, la plaque MS-5 cellules dans les puits d&#39;une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Incuber MS-5 les cellules à 37 ° C / 5% de CO2 dans un milieu de cellules MS5 (a-MEM contenant 20% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) dans le but d&#39;être de 70 à 80 i% de confluencepuits n de la plaque après 48 h. </li></ol></li><li> Récolte de la rate et du traitement des splénocytes <ol><li> Quatre jours (96 h) après un stress érythropoïèse induction, euthanasier déjà saigné la souris via le protocole IACUC approuvé (par exemple inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale). </li><li> rate de récolte et le mettre dans un tube conique de 15 ml contenant IMDM 2% de FBS et garder sur la glace. </li><li> De retour au laboratoire, dans le tissu de la culture capot dans des conditions stériles, inverser le tube contenant la rate sur un tamis cellulaire de 40 um situé sur le haut d&#39;un tube de 50 ml. Écraser la rate en utilisant le piston d&#39;une seringue en plastique de 5 ml. </li><li> Laver avec tamis cellulaire IMDM 2% de FBS et en utilisant le même moyen, d&#39;ajuster le volume final de la suspension cellulaire à 5 ml. </li><li> Couche délicatement la suspension de splénocytes 5 ml sur 5 ml gradient de densité de séparation de cellules moyenne 1.083 g / ml dans un tube de 15 ml et centrifuger à 750 g pendant 25 min à température ambiante, sans accélération de frein / bas. </li><li> Transfertsurnageant (solution à environ la marque de 2 ml du tube de 15 ml afin d&#39;acquérir couche leuco-plaquettaire) dans un nouveau tube de 15 ml et effectuer un lavage avec IMDM plus 2% de FBS à 525 g pendant 5 min à température ambiante . </li><li> Aspirer le surnageant et lysent les cellules rouges du sang par mise en suspension du culot dans 3 ml de tampon de lyse RBC pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 7 ml IMDM 2% de FBS à laver les cellules et à diluer et neutraliser le tampon de lyse RBC et de spin à 525 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant et suspendre les cellules sous forme de granulés dans 2 ml de milieu de croissance des érythroblastes (EGM). </li></ol></li><li> Culture des splénocytes isolés de faible densité, enrichis en érythroblastes, sur le plastique (première étape de culture in vitro rapide de l&#39;érythropoïèse) <ol><li> Compter les cellules sur un compteur de cellules automatisé ou manuellement par un hématimètre. Nombre habituel de cellules isolées par la rate à ce stade est d&#39;environ 15 x 10 6. </li><li> Suspendre d&#39;autres cellules dans EGM contenant les cytokines (à fconcentrations Inal): SCF 50 ng / ml, IL-3 5 ng / ml, et Epo 2 U / ml. </li><li> Plate 1-5 x 10 6 cellules dans un volume final de 1 ml / puits (même nombre de cellules par puits en fonction du nombre total de cellules) d&#39;une plaque de culture cellulaire à 24 puits et incuber O / N à 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Culture des érythroblastes sur les cellules MS5 (deuxième étape de culture in vitro rapide de l&#39;érythropoïèse <ol><li> Aspirer le surnageant du plastique bien et lever les cellules (hautement enrichi dans les érythroblastes) en ajoutant 2 ml de froid EDTA 10 mM dans du PBS pendant 5 min, sur la glace à chaque puits. </li><li> Mettez cellules dans des tubes frais, laver une fois dans EGM (sans cytokines) et remettre en suspension dans le même. </li><li> Planche 5 5 x 10 -1 x 10 6 cellules dans un volume de 2.1 ml à chaque MS5 puits d&#39;une plaque à 24 puits revêtue de cellule. Si inhibiteurs pharmacologiques sont utilisés dans l&#39;expérience, les ajouter à des concentrations appropriées maintenant. </li><li> Incuber pendant 6 à 8 heures (heure guidée parl&#39;observation microscopique de l&#39;ordre de 30% à 40% dans l&#39;échantillon énucléation WT non traité). La liaison des érythroblastes de MS-5 cellules accélère leur énucléation. </li><li> Soulever les cellules de chaque puits en ajoutant 2 ml de PBS froid mM d&#39;EDTA + 10, pendant 5 min, sur de la glace. Avec les érythroblastes, MS-5 cellules seront également collectées mais ceux-ci peuvent ensuite être facilement exclus lors de l&#39;analyse par cytométrie de flux comme FSC salut Ter119 - cellules. </li><li> A ce stade, les cellules peuvent être fixées et colorées pour l&#39;analyse par Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux. </li></ol></li></ol> 3. Coloration des érythroblastes pour la localisation des protéines intracellulaires ou radeaux lipidiques Pendant énucléation par imagerie multispectrale cytométrie en flux <ol><li> Laver les cellules dans du PBS, tourner 525 g pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant. </li><li> Fixer les cellules en remettant en suspension les culots cellulaires dans 500 ul de 3,7% de formaldehyde dans du PBS pendant 15 min (temps de fixation variable en fonction de la lutte contregen sondée) et un léger pipetage. </li><li> Transférer dans des tubes à centrifuger en plastique de 1,5 ml et incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Spin 2000 xg sur un banc à centrifuger pendant 20 s, aspirer le surnageant et effectuer un lavage par addition de 500 ul de PBS à chaque tube et pipetage doucement. </li><li> Spin sur un 2000 xg banc à centrifuger pendant 20 sec, aspirer le surnageant et conserver les tubes sur de la glace pendant au moins 15 min. Permeablization étapes 3.6-3.9 devrait être fait rapidement et efficacement, et en suivant la filature / aspiration à la température ambiante, les culots cellulaires devrait immédiatement être remis sur la glace, pour les cellules à mieux conserver leur intégrité. </li><li> Prenez des solutions d&#39;acétone à partir de -20 ° C congélateur et de mettre sur la glace. Perméabiliser les cellules en remettant en suspension les culots cellulaires dans 500 ul d&#39;abord 50% d&#39;acétone refroidie à la glace (1:1 avec dH 2 O) et de pipetage doucement. </li><li> Spin sur le banc microcentrifuge 2000 g pendant 20 sec, aspirer le surnageant et remettre en suspension cellulaires de pastilles dans 500 ul60; glacée 100% d&#39;acétone par pipetage. </li><li> Spin sur le banc microcentrifuge 2000 g pendant 20 sec, aspirer le surnageant et remettre en suspension cellulaires de granulés une fois de plus dans 500 ul glacée 50% d&#39;acétone par pipetage. </li><li> Spin sur le banc microcentrifuge 2000 g pendant 20 sec, aspirer le surnageant et laver les cellules une fois dans un tampon froid FACS (PBS + 0,5% de BSA) par un léger pipetage. </li><li> Préparer l&#39;étiquetage cocktail avec des anticorps ou des marqueurs pour les molécules d&#39;intérêt: 0,1 U/100 ul AF488-phalloidin pour la coloration F-actine et 1 μl/100 ul Ter119-PECy7 pour la coloration des cellules érythroïdes. Coloration de remplacement ou complémentaire peut également être effectuée en utilisant AF-488-anti-β-tubuline anticorps (1:50), AF-594 conjugué à la sous-unité B de la toxine cholérique à étiqueter les radeaux lipidiques (1:200), anti-pMRLC (SER19) l&#39;anticorps primaire de la chaîne de la myosine phosphorylée de la lumière de régulation (01:50), suivie d&#39;anti-lapin de AF-488 conjugué anticorps secondaire (1:400) et anti-γ-tubulin anticorps primaire de lapin (1:100) suivi par un anticorps anti-lapin secondaire AF-555-conjugué (1:300). </li><li> Suite à l&#39;aspiration le surnageant, remettre en suspension les culots de cellules dans 100 ul de cocktail le marqueur, une pipette doucement et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Préparer tampon FACS contenant 2,5 M de la tache DRAQ5 nucléaire. </li><li> Laver les cellules dans un tampon FACS, spin-down sur le banc microcentrifuge 2000 g pendant 20 sec, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 60 pl de tampon FACS contenant DRAQ5. </li><li> Échantillons s&#39;exécutent sur ​​le cytomètre de flux imagerie de recueillir au moins 10.000 événements par expérience, compenser les fichiers de données brutes comme précédemment publié le 13, et analyser les résultats comme le montre la figure 2, en utilisant le logiciel d&#39;analyse spécifique à l&#39;imagerie cytomètre de flux. </li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Au cours des dernières années, l&#39;étude de l&#39;énucléation érythroblastes a gagné en dynamique, car il est l&#39;étape dans des cultures in vitro en l&#39;érythropoïèse qui est le plus difficile à reproduire de manière efficace afin de réaliser avec succès, la production à grande échelle de cellules rouges du sang ex vivo. Jusqu&#39;à récemment, l&#39;étude de l&#39;énucléation des érythroblastes utilisé la microscopie par fluorescence et principalement la cytométrie en fl...

Différenciation terminale à l&#39;intérieur de la lignée érythroïde chez les mammifères se termine par le procédé de l&#39;énucléation dramatique, à travers laquelle le érythroblastes orthochromatic expulse son noyau enveloppé d&#39;une membrane (pyrenocyte) 1, 2, générant une réticulocytes. Le mécanisme exact de ce procédé, qui est également l&#39;étape limitant le taux de succès, à grande échelle, la production de globules rouges du sang in vitro, n&#39;est pas encore complètement élucidé. La localisation des protéines et des structures clés au sein d&#39;énucléation d&#39;érythroblastes repose sur l&#39;utilisation de la fluorescence et microscopie électronique 5.3. Ce processus fastidieux se traduit généralement par l&#39;identification d&#39;un nombre limité d&#39;événements énucléation et ne permet pas toujours une analyse statistique significative. Étendre sur une méthode d&#39;identification des érythroblastes décrit précédemment par McGrath et al. 6, nous avons développé une nouvelle approche de l&#39;identification et l&#39;étude des événements énucléation par Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux (multiparamétrique imagerie cellulaire à haut débit de l&#39;écoulement, une méthode qui combine la microscopie à fluorescence avec la cytométrie de flux) 7, qui peut fournir un nombre suffisant d&#39;observations pour obtenir des mesures et effectuer des analyses statistiques. Ici, nous décrivons deux premières méthodes de culture in vitro de l&#39;érythropoïèse dans utilisés pour synchroniser les érythroblastes et augmenter la probabilité de capture d&#39;énucléation au moment de l&#39;évaluation. Ensuite, nous décrivons en détail la coloration des érythroblastes après fixation et perméabilisation afin d&#39;étudier la localisation des protéines intracellulaires ou radeaux lipidiques pendant énucléation par cytométrie de flux d&#39;imagerie multi-spectrale. Les échantillons sont analysés sur un flux d&#39;imagerie cytomètre et les cellules recueillies sont déclenchés de manière appropriée pour identifier les érythroblastes orthochromatiques 6. Érythroblastes orthochromatiques sont ensuite analysés en fonction de leur rapport d&#39;aspect, tel que mesuré en fond clair imaging, par rapport à leur valeur pour le paramètre delta centroïde XY Ter119-ADN, qui est définie comme la distance entre les centres des zones tachées pour Ter119 et l&#39;ADN, respectivement. La population de cellules ayant un faible ratio d&#39;aspect et delta haut centre de gravité XY Ter119/DNA est fortement enrichie en cellules énucléation. Utilisation de type sauvage (WT) érythroblastes contre érythroblastes avec suppression Mx-Cre médiation conditionnelle de Rac1 sur Rac2 - / - ou combiné Rac2 - / -; RAC3 - / - fond génétique et ce protocole d&#39;analyse de roman de flux d&#39;imagerie multi-spectrale cytométrie, nous avons récemment démontré que l&#39;énucléation ressemble cytokinèse asymétrique et que la formation d&#39;un anneau de actomyosin réglementé en partie par GTPases Rac est important pour la progression de l&#39;énucléation 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">&#945;MEM medium</td>
			<td style="width:199px;">CellGro&#160;</td>
			<td style="width:207px;">15-012-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">IMDM medium</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30228.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stempro-34 SFM</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Stempro-34 nutrient supplement</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10641-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:207px;">512450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">BIT9500</td>
			<td style="width:199px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:207px;">09500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP-1600-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30028.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SV30010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30590.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td style="width:199px;">Butler-Schein</td>
			<td style="width:207px;">029405</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Histopaque 1.083mg/ml</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">10831</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">555899</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">534064</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP 531-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">H4001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">250-03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">213-13</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:363px;">EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td>
			<td style="width:199px;">AMGEN</td>
			<td style="width:207px;">available by pharmacy</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">CD44-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:363px;">CD71-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553266</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Ter119-PECy7 antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">557853</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phalloidin-AF488</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#946;-tubulin-AF488 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF488-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A11008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF555-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A21428</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">AF594-cholera toxin B subunit</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">C34777</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">pMRLC (Ser19) antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3671</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#947;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">T-3559</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Syto16</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">S7578</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Draq5</td>
			<td style="width:199px;">Biostatus</td>
			<td style="width:207px;">DR50200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferrous sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F7002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferric nitrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F3002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP120500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:363px;">15ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">50ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">6-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">353046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">24-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">351147</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">309602</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Syringe needle 25G5/8</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">305122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Capped flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">352058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">40&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Scalpel (disposable)</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td style="width:207px;">2975#21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">FACS Canto Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:363px;">Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Hemavet 950 Cell Counter</td>
			<td style="width:199px;">Drew Scientific</td>
			<td>CDC-9950-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NAPCO series 8000WJ Incubator</td>
			<td style="width:199px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Mini Mouse Bench centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Denville</td>
			<td style="width:207px;">C0801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of a murine erythroblast subpopulation  enriched in enucleating events by multi-spectral imaging flow cytometry

Érythropoïèse chez les mammifères conclut avec le processus dramatique de l&#39;énucléation qui aboutit à la formation de réticulocytes. Le mécanisme d&#39;énucléation n&#39;a pas encore été complètement élucidé. Un problème fréquemment rencontré lors de l&#39;étude de la localisation des protéines et des structures clés au sein énucléation des érythroblastes par microscopie est la difficulté d&#39;observer un nombre suffisant de cellules subissant une énucléation. Nous avons développé un nouveau protocole d&#39;analyse par imagerie multiparamétrique haut débit cellulaire en flux (Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux), une méthode qui combine la microscopie par immunofluorescence avec la cytométrie de flux, afin d&#39;identifier efficacement un nombre important d&#39;événements énucléation, qui permet de obtenir des mesures et effectuer des analyses statistiques. Nous décrivons d&#39;abord ici deux méthodes de culture in vitro de l&#39;érythropoïèse dans utilisés pour synchroniser les érythroblastes murins et augmenter la probabilité de capture d&#39;énucléation à etemps e de l&#39;évaluation. Ensuite, nous décrivons en détail la coloration des érythroblastes après fixation et perméabilisation afin d&#39;étudier la localisation des protéines intracellulaires ou radeaux lipidiques pendant énucléation par cytométrie de flux d&#39;imagerie multi-spectrale. Avec la taille et DNA/Ter119 coloration qui sont utilisés pour identifier les érythroblastes orthochromatiques, nous utilisons les paramètres &quot;aspect ratio&quot; d&#39;une cellule dans le canal champ lumineux qui aide à la reconnaissance des cellules allongées et &quot;delta barycentre XY Ter119/Draq5 &quot;qui permet l&#39;identification d&#39;événements cellulaires dans lequel le centre de Ter119 coloration (de réticulocytes naissante) est loin en dehors du centre de DRAQ5 coloration (noyau subissant extrusion), indiquant ainsi une cellule sur le enucleate. Le sous-ensemble de la population des érythroblastes orthochromatique avec centre de gravité du delta élevé et un faible rapport d&#39;aspect est fortement enrichie en cellules énucléation.

Tout d&#39;abord, les cellules sont analysées en fonction de leur Aspect Ratio Brightfield (le rapport de la longueur de leur mineure par rapport à leur axe principal) et son Espace Brightfield (indicatif de leur taille). Les événements avec une valeur Brightfield Région inférieur à 20 et supérieur à 200 sont pour la plupart des débris cellulaires et des agrégats, respectivement, et sont exclus de l&#39;analyse (figure 2A). Les cellules individuelles (porte &quot;R1&quot;) sont ensuite analys...

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Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Le présent protocole décrit un nouveau procédé d&#39;identification d&#39;une population d&#39;énucléation d&#39;érythroblastes orthochromatiques par écoulement d&#39;imagerie multi-spectrale cytométrie, fournissant une visualisation du processus d&#39;énucléation des érythroblastes.

Identification d&#39;une sous-population murine érythroblastes enrichi en énucléation événements par imagerie multispectrale cytométrie en flux

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K vues.  University of Cincinnati College of Medicine.  Le présent protocole décrit un nouveau procédé d'identification d'une population d'énucléation d'érythroblastes orthochromatiques par écoulement d'imagerie multi-spectrale cytométrie, fournissant une visualisation du processus d'énucléation des érythroblastes. 

Vidéo: Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Recherche

Biologie

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Vivre imagerie cellulaire de l&#39;autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Identification des événements intracellulaires de signalisation induite dans les cellules viables par interaction avec les cellules voisines Subissant la mort cellulaire apoptotique

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Mesurer d’endoréduplication par cytométrie de flux des protoplastes isolés Tuber

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.