Le protocole étudie les neurones granulaires cérébelleux à différents stades de développement afin de visualiser la croissance morphologique clé. Les avantages de la technique comprennent le ciblage spécifique des cellules, l’expression rapide des constructions transfectées et le marquage clairsemé des cellules qui permet l’étude des effets autonomes cellulaires. Commencez par couper un segment de 11,2 millimètres à partir de l’embout d’une pipette de chargement et placez la partie coupée sur l’embout de la seringue Hamilton comme intercalaire pour limiter la profondeur d’injection à 1,5 millimètre.
Fixez l’entretoise sur l’embout de la seringue avec de l’adhésif ou du parafilm. Pour étudier la morphologie des CGN électroporés simples à partir de sections cérébrales sagittales du chiot expérimental, prenez des images Z-stack à 0,5 micromètre par pile sur un microscope confocal. Imagez une cellule par fenêtre d’image pour faciliter l’analyse de l’image et la reconstruction 3D.
Analysez la longueur des neurites et la formation de griffes dendritiques en aveugle à l’aide d’un simple traceur de neurite. Téléchargez des images Z-stack monocanal de CGN électroporés aux Fidji et cliquez sur Plugins"Segmentation » et Simple Neurite Tracer"Sélectionnez Create New 3D Viewer » dans le menu déroulant. Faites défiler jusqu’à la base d’une dendrite se connectant à la cellule soma et commencez un chemin en cliquant sur la jonction.
Tracez manuellement le chemin en cliquant sur les sections où le signal de remplissage de cellule est le plus lumineux et en appuyant sur Y pour conserver la trace. Tracez jusqu’à la fin de la dendrite et confirmez le chemin en appuyant sur F.Sinon, tracez jusqu’à la base de la griffe. Ensuite, tracez la griffe à partir de la base de la structure jusqu’à la fin du neurite le plus long.
Tracez les branches secondaires et tertiaires en maintenant la touche Ctrl sous Windows ou ALT sous macOS enfoncée et en cliquant sur le chemin. Confirmez le chemin en appuyant sur F.Observez que les mesures des traces sont visibles sur une fenêtre séparée. Additionnez toutes les tailles des branches de griffe pour obtenir la longueur totale de chaque griffe.
Dans l’analyse représentative, les images de projection des CGN électroporés de 3 à 14 jours après l’injection ont montré une diminution progressive du nombre de dendrites. Les CGN ont subi une phase de croissance dendritique suivie d’un raffinement de 3 DPI à 7 DPI qui a abouti à l’élagage de plus de 50% des dendrites en excès. Cet événement coïncide avec l’allongement progressif des tonnelles restantes dans la formation de structures en forme de griffes à la fin de chaque dendrite, ce qui indique que ces processus de développement se produisent simultanément.
À 7 DPI, des griffes ont été trouvées sur environ 75% des dendrites. Chaque CGN étiqueté a été reconstruit dans NMRS pour quantifier la surface et le volume somato-dendritiques totaux. Aucune différence significative dans la taille du CGN n’a été observée au cours du développement.
Bien qu’à 7 DPI, les CGN ont montré une diminution significative de 20% du volume par rapport à 3, 5 et 10 DPI. La chose la plus importante dans la procédure est de localiser avec précision le cervelet avant l’injection. La méthode peut être adaptée pour manipuler génétiquement des gènes in vivo afin d’étudier leur rôle dans le développement des neurones granulaires par transfection de shRNAs, de siRNA ou de Cre Recombinase.
