La méthode présentée dans cet article est née de travaux financés par le BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) et une bourse d&#39;études de doctorat MRC (MH).

Remarque: Toutes les expériences ont été réalisées avec conformément au King College de Londres, Royaume-Uni et les lignes directrices de soins aux animaux UK Home Office. 1. Dissection de e14 Cerebellum <ol><li> Incuber les oeufs bruns de poule fertilisés à 38 ° C à jour embryonnaire 14. </li><li> L&#39;aide de ciseaux d&#39;œufs décapitent embryon de poulet in ovo et retirer la tête d&#39;une boîte de Pétri contenant de la glace froide PBS (figure 1A). </li><li> En utilisant des pinces standard, faire des incisions derrière chaque oeil tout le chemin à travers le tissu, la suppression des yeux et de la mâchoire supérieure. Ajouter un deuxième incision tout le chemin à travers le pharynx enlever la mâchoire inférieure (figure 1B). </li><li> En utilisant des pinces standard, retirer toute la peau de la surface du crâne par éplucher loin (figure 1C) et retirer frontales et pariétales os, révélant cerveau. </li><li> Du point de vue ventrale, retirez pharyngée cartilage et mésenchyme auxiliaire. </li><li> Du point de vue dorsale, attentionLy supprimer mésenchyme dorsale du cerveau postérieur en prenant soin de ne pas endommager Pia, et tout le cerveau séparé (figure 1D). </li><li> Assurez incision tout le chemin à travers le tissu entre mésencéphale et du cerveau postérieur et cerveau postérieur séparé comprenant cervelet (figure 1E). </li><li> En faisant des incisions tout le chemin à travers le tissu à deux jonctions latérales du cervelet et de la plaque alaire du cerveau postérieur, retirez toute cervelet, en prenant soin de maintenir l&#39;intégrité de la pie au long de la dissection (figure 1F). Retirez le plexus choroïde de formation (figure 1G). </li><li> Déplacez le cervelet disséqué dans glacée HBSS. </li></ol> 2. Tranche Culture de e14 Cerebellum <ol><li> Transférer toute cervelet à la plate-forme stérile d&#39;un tissu Chopper aide d&#39;une spatule ou d&#39;un 3 ml pipette Pasteur avec le bout coupé pour élargir l&#39;ouverture. Retirer l&#39;excès de liquide à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Couper toute entière cervelet en til nécessaire orientation à 300 um d&#39;épaisseur en utilisant le broyeur de tissu ensemble avec une vitesse de coupe à 50% du maximum. L&#39;intégrité des tissus est plus facilement conservé dans la section sagittale; Toutefois, l&#39;orientation est également un facteur important pour l&#39;analyse de cellule (dendrites des cellules de Purkinje sont sagittale alignés, tandis que les axones des cellules granulaires courent transversalement, perpendiculairement au plan de dendrites des cellules de Purkinje). </li><li> Utilisation d&#39;un 3 ml pipette Pasteur, couvrir le cervelet en tranches dans la glace HBSS froid. </li><li> Transférer les tranches dans un plat HBSS à 60 mm Petri contenant de la glace froide HBSS frais en utilisant un 3 ml pipette Pasteur avec la pointe de coupe. </li><li> Sous un microscope de dissection éclairé par une source de lumière de fibre optique, assurer la séparation des tranches individuelles aide de pinces horloger. Identifier les tranches à électroporation, en fonction de leur intégrité des tissus et la position médio-latérale. Remarque: Chaque dissection de l&#39;embryon grâce à trancher incubation dans un milieu de culture prend environ 10-20 min selon upon expérience. Effectuer dissections un à la fois pour assurer que cerebella passer un minimum de temps entre la décapitation et la culture ex vivo. </li></ol> 3. L&#39;électroporation de tranches <ol><li> Construction d&#39;une chambre d&#39;électroporation en fixant l&#39;anode d&#39;un électroporateur à la base d&#39;une boîte de Petri de 60 mm avec du ruban isolant. Ajouter environ 1 ml de HBSS pour couvrir l&#39;électrode. </li><li> Placer un insert de 0,4 um de la culture au-dessus de l&#39;électrode couvert dans du HBSS. Permettre à l&#39;insert de culture de se reposer sur l&#39;électrode en vous assurant qu&#39;il est toujours un contact entre l&#39;insert et l&#39;électrode. Remarque: Dans cette configuration, l&#39;insert de culture avec les tranches reposera sur la surface de la solution, le maintien du circuit, mais permettant un ciblage spatial de la cathode. </li><li> Tranches de transfert identifiés (jusqu&#39;à cinq par insert de culture) sur insert de culture en utilisant 3 ml pipette Pasteur avec la pointe de coupe. Indépendante et laisser reposer sur insert de culture dans un sagittorientation al. </li><li> En utilisant une pipette, éliminer l&#39;excès de HBSS sorte que les tranches ne sont plus baignés dans une solution. </li><li> En utilisant une pointe de pipette P10, de l&#39;ADN de pipette (à une concentration de 1 ug / ul), dilué avec 20% de vert rapide sur la surface de la région cible d&#39;une tranche. 20% de vert rapide assure solution d&#39;ADN visqueux et empêche prohibitif grande dispersion de l&#39;ADN. Ajouter la solution verte d&#39;environ 5 ul d&#39;ADN / rapide à chaque tranche (figure 2B). </li><li> Placez la cathode sur tissu ciblé souhaité et l&#39;électroporation avec 3 x 10 V, 10 impulsions de msec. Eviter le contact direct de la cathode avec le tissu. Au lieu de cela, profiter de la tension de surface du liquide pour maintenir la conductance (placer la cathode au plus près du tissu que possible sans le toucher du tissu). </li><li> Répétez la livraison de l&#39;ADN et l&#39;électroporation à plusieurs régions de EGL sur chaque tranche cérébelleuse individu comme souhaité. </li><li> À la fin de l&#39;électroporation, la culture de transfert Insert à 30 mm boîte de Petri. </li><li> Pour chaque culture, ajouter 1 ml de milieu de culture préchauffé (Basal Medium aigle, 0,5% (p / v) D - (+) - glucose, supplément de B27 1%, 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine) en dessous de l&#39;insert de culture de telle sorte que l&#39;insert de culture est en contact avec le milieu, mais des tranches ne sont pas baigné en elle. </li><li> Incuber les cultures à 37 ° C / 6% de CO2 pendant jusqu&#39;à 3 jours. Remplacez tout le milieu de culture tous les 24 heures avec un milieu préchauffé frais. </li><li> Après la culture, de fixer des tranches sur la culture insère pendant 1 h à 4% de paraformaldéhyde (ou O / N à 4 ° C) dans un plat frais de 30 mm sans les milieux de culture. </li></ol> 4. Imagerie de cervelet tranches <ol><li> Après la fixation, laver tranches 3 fois pendant 5 min dans du PBS. </li><li> En utilisant une lame de rasoir, disséquer chaque tranche cérébelleuse électroporation et cultivée de l&#39;insert de culture en coupant autour de la tranche et en supprimant la tranche et la région de l&#39;insert, il est respecté. Fairepas tenter de retirer une tranche de la surface de l&#39;insert de la culture. </li><li> Tranches de montage dans environ 1 ml de milieu de montage contenant DAPI (si désiré) sous une lamelle en prenant soin de ne pas introduire de bulles, et de l&#39;image en utilisant le laser-microscopie confocale à balayage. Remarque: des paramètres d&#39;images peuvent être modifiées selon les constructions électroporation, et à la discrétion de l&#39;utilisateur individuel. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le protocole présenté ici décrit une méthode pour disséquer, électroporation et la culture tranches de jour embryonnaire 14 cervelet du poussin. Ce protocole permet le ciblage de l&#39;électroporation aux petites régions focales de l&#39;EGL, y compris le ciblage isolé de lobes cérébelleux individuels. Il permet l&#39;analyse génétique et de l&#39;imagerie à haute résolution et de commodité, et à un faible coût par rapport à des techniques établies chez les rongeurs 43-47. Cette analyse es...

Le cervelet se trouve à l&#39;extrémité antérieure du cerveau postérieur et est responsable de l&#39;intégration du traitement sensoriel et moteur dans le cerveau mature ainsi que la régulation des processus cognitifs supérieurs 1. Chez les mammifères et les oiseaux, il possède une morphologie complexe et est fortement feuilleté, un produit de grande amplification des progéniteurs de transit au cours du développement, qui produit plus de la moitié des neurones dans le cerveau adulte. Le cervelet a été un sujet d&#39;étude pour les neurobiologistes pour des siècles et dans l&#39;ère moléculaire a également reçu beaucoup d&#39;attention. Cela concerne non seulement à sa biologie intrinsèquement intéressante, mais aussi au fait qu&#39;il est fortement impliqué dans les maladies humaines, y compris les troubles génétiques de développement tels que les troubles du spectre autistique 2 et plus en évidence le cancer du cervelet, médulloblastome 3, qui est le cerveau pédiatrique la plus répandue tumeur. Surtout, il est un excellent système de modèle au sein de which pour étudier la répartition de sort et la neurogenèse au cours du développement du cerveau 4. Au cours des dernières années, il a également été établi comme un système modèle pour l&#39;étude comparative du développement du cerveau, en raison de la grande diversité des formes cérébelleux vu à travers la phylogénie des vertébrés 5-10. Le cervelet se développe à partir de la moitié dorsale de rhombomère 1 dans le cerveau postérieur et de développement 11 est constitué de deux populations de cellules progénitrices primaires, la lèvre rhombique et la zone ventriculaire. La lèvre rhombique étend autour de la région dorsale de la neuroépithélium du cerveau postérieur à la frontière avec la plaque de toit. Il est le lieu de naissance des neurones excitateurs glutamatergiques du cervelet 12-14. La zone ventriculaire donne lieu à des neurones inhibiteurs GABAergiques cérébelleux, le plus en évidence les grands neurones de Purkinje 14,15. Plus tard dans le développement (d&#39;environ jour embryonnaire 13,5 chez la souris; e6 en poussin 16), glutamatergique Progenvisi- migrer tangentiellement à partir de la lèvre rhombique et forment une couche piale progéniteurs: une zone de progéniteur secondaire appelée la couche de granulés externe (EGL). Il est de cette couche qui subit l&#39;amplification très étendue de transit qui conduit à le grand nombre de neurones granulaires présents dans le cerveau mature. Prolifération dans le EGL a longtemps été associé à l&#39;emplacement du sous-pial qui résulte de la migration tangentielle à partir de la lèvre rhombique 17, avec le commutateur de sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale de progéniteurs étant associée à leur sortie de la couche EGL extérieur dans le milieu EGL 18. La migration tangentielle étendue de cellules granulaires post-mitotiques dans l&#39;axe médio-latérale se produit dans la moyenne et interne EGL 19, avant la migration radiale finale dans la couche intérieure de granules du cortex cérébelleux mature. Migration de cellules de la lèvre rhombique sur la surface du cervelet dépend signalisation CXCL12 de la pie-20-22 </sup&gt; Cellules granulaires et expriment le récepteur CXCR4 CXCL12. Leur migration tangentielle est donc sans rappeler celui de la migration des populations tangentiellement néocortex des interneurones inhibiteurs 23-25. Curieusement, études au microscope électronique 17 ont suggéré que les cellules EGL avec une morphologie proliférative maintenir le contact pial, reliant le comportement des cellules avec une capacité de prolifération d&#39;une manière qui rappelle les progéniteurs basales du cortex des mammifères 26. Ceci se reflète dans la stratification précitée de la EGL en trois sous-couches qui sont définies par des environnements extracellulaires distinctes et où granulés précurseurs ont l&#39;expression du gène 18 signatures distinctes. Prolifération des progéniteurs dans la oEGL se produit avec une distribution normale des tailles de clones de sorte que lorsque les progéniteurs sont génétiquement marquées individuellement à la fin du développement embryonnaire chez la souris, ils donnent lieu à une moyenne médiane de 250 à 500 g postmitotiqueneurones ranule 27,28. Prolifération dépend de signalisation SHH mitogénique sous-jacents neurones de Purkinje 29-32. La capacité à répondre à SHH a été montré pour être entièrement dépendant de cellule autonome expression du facteur de transcription Atoh1, à la fois in vitro et in vivo 33 34,35. De même, la sortie du cycle cellulaire et de la différenciation a été démontré que l&#39;expression dépendant du facteur de transcription en aval NeuroD1 36, ce qui est probablement un répresseur directe de Atoh1 37. Malgré ces progrès, et le progrès considérable à déchiffrer la base biologique de la cellule de sortie du cycle cellulaire 38-42, le mécanisme moléculaire fondamentale (s) qui sous-tendent la décision de quitter le cycle cellulaire et la transition d&#39;un ancêtre à un neurone de différenciation, et la la migration tangentielle postmitotique associé dans le EGL intérieure ainsi que l&#39;interrupteur tardà la migration radiale, restent mal compris. Ceci est dans une large mesure en raison de l&#39;intransigeance de l&#39;EGL expérimentale: il est tard en développement et difficiles à cibler génétiquement puisque bon nombre des mêmes molécules neurogènes sont également cruciales tôt dans la vie des précurseurs de granulés à la lèvre rhombique. Pour surmonter ce problème, de nombreux auteurs ont développé in vivo et ex vivo électroporation comme une méthode pour cibler le cervelet postnatale chez les rongeurs 43-48. Ici, nous Pioneer l&#39;utilisation des ex vivo électroporation dans poussin pour étudier le EGL, ce qui représente des avantages considérables en termes de coût et de commodité. Notre méthode d&#39;électroporation et ex vivo tranche culture de tissu cérébelleux poussin utilise le tissu disséqué jour embryonnaire 14 poussins au sommet de EGL prolifération. Cette méthode permet le ciblage génétique de l&#39;EGL indépendamment de la lèvre rhombique et préparera le terrain pour la dissection génétique de la transition de granuleprogéniteur de neurone post-mitotiques granule dans le cervelet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

La couche externe de granules cérébelleux (EGL) est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement, et un excellent modèle pour l&#39;étude de la prolifération et de la différenciation neuronale. En outre, les modifications évolutives de sa capacité proliférative ont été responsables de l&#39;expansion spectaculaire de la taille du cervelet dans les amniotes, rendant le cervelet un excellent modèle pour les études évo-dévo du cerveau des vertébrés. Les cellules constitutives de l&#39;EGL, progéniteurs granulaires du cervelet, représentent également une cellule d&#39;origine significatif pour le médulloblastome, la tumeur pédiatrique neuronale la plus répandue. Après un transit amplification, précurseurs granules migrent radialement dans la couche granulaire interne du cervelet où ils représentent la plus grande population de neurones dans le cerveau des mammifères mature. En poussin, le pic d&#39;EGL prolifération se produit vers la fin de la deuxième semaine de gestation. Afin de cibler la modification génétique de cette couche aule pic de la prolifération, nous avons développé une méthode de manipulation génétique par électroporation ex vivo de tranches de cervelet de jour embryonnaire 14 embryons de poulet. Ce procédé reprend plusieurs aspects importants de granule développement in vivo de neurones et sera utile pour générer une compréhension approfondie de la prolifération des cellules du cervelet de granulés et de la différenciation, et donc du développement de cervelet, l&#39;évolution et la maladie.

Cette section présente des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en utilisant tranche électroporation et la culture du cervelet jour embryonnaire 14 poussin. La dissection du cervelet est illustré sur la Figure 1 et la chambre d&#39;électroporation mis en place est représenté sur la Figure 2. On montre qu&#39;il est possible pour l&#39;électroporation et avec succès la culture des tranches de cervelet, qui conservent leur structure et ...

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

La couche de granules cérébelleux externe est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement. Ici, nous présentons un protocole de cibler la modification génétique de cette couche au sommet de la prolifération utilisant ex électroporation et la culture de tranches de cervelet vivo à partir embryonnaires Jour 14 embryons de poulet.

Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

9.2K vues.  King's College London.  La couche de granules cérébelleux externe est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement. Ici, nous présentons un protocole de cibler la modification génétique de cette couche au sommet de la prolifération utilisant ex électroporation et la culture de tranches de cervelet vivo à partir embryonnaires Jour 14 embryons de poulet. 

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Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Efficient Gene Transfer dans Chick rétines pour cellulaires primaires études sur la culture: Un<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Approche d&#39;électroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Recherche

Biologie du développement

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimisé<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Culture des embryons de poulet aux stades avancés de développement

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero L&#39;électroporation et organotypiques Slice culture de souris hippocampe Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Culture ex vivo des pharyngée Arches pour étudier cardiaques et musculaires progéniteurs et leur niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &amp;#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

Approche génétique de l&#39;avant pour découvrir les gènes de résistance au stress chez la souris - un écran haute-débit dans les cellules ES

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Épicardique Excroissance Culture Assay et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Évaluation des épicardique dérivés Migration cellulaire

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Analyse clonale des précurseurs embryonnaires de cellules souches hématopoïétiques à l’aide de cellule unique Index tri combinée avec Niche de cellules endothéliales co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR induite par la perte de fonction dans cervelet granules des cellules utilisant In Utero électroporation basée sur un transfert de gènes

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Perfusion ex vivo du placenta de rongeurs

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

Méthode d'électroporation pour la livraison in vivo de l'ADN de Plasmid dans le Telencephalon adulte de poisson zèbre

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...