Nous remercions Geoff Daniels pour une assistance technique. Ce travail a été financé par R01 AI067946 à JSO

Une. Les lamelles couvre-Manteau avec anticorps <ol><li> Préchauffer (à 37 ° C) de 30 ml de RPMI 10% des médias FCS et 1 ml de BD Cytofix / Cytoperm. </li><li> Préparer une solution de 5 pg / ml d&#39;anticorps purifié dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Pour l&#39;activation de la lignée de cellules NK92, l&#39;utilisation d&#39;anti-CD18 et anti-NKp30 est recommandée. <ol><li> Cochez une pièce de dix cents environ cercle de taille pour chaque condition sur une lamelle # 1.5 en utilisant un stylo de PAP. Pour une expérience de double couleur, il devrait y avoir quatre conditions: sans tache, double colorées, et les deux conditions colorées simples. Distribuer 200 pl de solution d&#39;anticorps dans chaque région et incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Laver les lamelles couvre-objet en immergeant doucement chacun dans 50 ml de PBS dans un tube conique de 50 ml à la température ambiante. Le lavage doit se faire immédiatement avant l&#39;ajout de cellules et de soins doivent être prises pour éviter le dessèchement des anticorps sur la lamelle. </li></ol></li></ol> 2. Activer les cellules NK sur la couverturefeuillets; réparer et perméabiliser <ol><li> Isoler 5 x 10 5 cellules par NK92 état. Centrifugeuse et surnageant décanter. Laver une fois avec 10 ml de médias préchauffé à partir de l&#39;étape 1.1. Centrifugeuse et surnageant décanter. <ol><li> Resuspendre les cellules dans des milieux préchauffés à partir de l&#39;étape 1.1, à une concentration de 2,5 x 10 6 / ml. </li><li> Décanter doucement 200 pi au centre de la région créée dans la section 1.2.1. Incuber à 37 ° C pendant 20 min à 5% de CO 2. (Remarque: cette durée peut être prolongée ou diminuée en fonction de la fonction biologique d&#39;intérêt pour NK granule cellulaire polarisation, 20 min est suffisante.). </li></ol></li><li> Suite à l&#39;incubation des cellules, de lavage des lamelles en immergeant doucement chacune dans 50 ml de PBS température ambiante dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Ajouter 1 pi de Triton X-100 à 1 ml de solution préchauffée Fix / Perm à partir de l&#39;étape 1.1 et en profondeur vortex. Fixer et perméabiliser par addition de 200 ul de tampon Fix / Perm (étape 2.3) aux cellules. Incuber pendant 10 mdans dans l&#39;obscurité à température ambiante. </li></ol> 3. Les cellules de taches <ol><li> Préparer le tampon de coloration: tampon phosphate salin (PBS), 1% de BSA, 0,1% de saponine. <ol><li> Préparer une solution d&#39;anticorps primaire dans 200 pl tampon de coloration (voir l&#39;étape 3.1). (Remarque: anticorps doit être titré avant l&#39;utilisation). Éviter l&#39;utilisation de l&#39;anticorps primaire qui se pose dans les mêmes espèces utilisées pour enrober la lamelle (étape 1.2). Evitez également les liens Strepatividin-biotine pour l&#39;imagerie STED. </li><li> Après la section 2.3.1, laver délicatement les lamelles dans 50 ml de tampon de coloration. Tamponnez les bords de la région de PAP-stylo avec coton-tige pour enlever l&#39;excès de tampon. Appliquer la solution d&#39;anticorps créé dans la section 3.1.1. Incuber 30 min à l&#39;obscurité à température ambiante. (Recommandé: incuber des lamelles dans la boîte de diapositives avec une serviette en papier humide pour maintenir l&#39;humidité). </li></ol></li><li> Préparer la solution d&#39;anticorps secondaire dans 200 pl colorationtampon. Fluorophores sont recommandées Alexa Fluor 488, Pacifique Orange, et V500. Généralement, une dilution 1:200 est adapté pour l&#39;imagerie STED. <ol><li> Lavez délicatement les lamelles dans 50 ml de tampon de coloration. Tamponnez les bords de la région de PAP-stylo avec un coton-tige pour enlever l&#39;excès de tampon. Appliquer la solution d&#39;anticorps secondaire. Incuber 30 min à l&#39;obscurité à température ambiante. </li></ol></li><li> Répétez le lavage et la coloration pour les protéines d&#39;intérêt supplémentaires. Si la détection de la F-actine avec phalloïdine, cela peut être inclus avec l&#39;anticorps secondaire, généralement à une dilution de 1:200. </li></ol> 4. Mont lamelles couvre-sur Diapositives <ol><li> Préparer le milieu de montage. Remarque: Prolonger ou prolonger or sont préférables. Vectashield doit être évitée, car elle n&#39;est pas compatible avec STED. 2,2-thiodioethanol doit être évitée si phalloïdine est utilisé. Mowiol est acceptable. </li><li> Placez environ 10-20 pi de milieu de montage sur une diapositive. Inverser lamelle (cellule vers le bas) et lamelle monter doucement, en prenant soin deéviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air. Incuber les lames pendant 24 heures (lamelle up) avant l&#39;imagerie. </li><li> Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. </li></ol> 5. Expérimental <ol><li> Initier les lasers et les logiciels requis. Initier STED laser d&#39;épuisement à 100% de la puissance. Aligner laser STED, qui dans le cas de systèmes commerciaux est souvent une procédure automatisée. </li><li> Concentrer l&#39;échantillon, en commençant par le contrôle teinté unique, sur le microscope à l&#39;aide oculaires. </li></ol> 6. Optimisation des Paramètres <ol><li> Scannez le premier canal et d&#39;optimiser la puissance du laser, la position faisceau d&#39;excitation et la gamme de détection. Si possible, éviter un gain de&gt; 100. Capturez l&#39;image dans confocale pour optimiser les réglages. Ligne et / ou un cadre moyenne augmentera résolution. Vérifiez la saturation de pixels. Remarque: il est acceptable dans la saturation confocal en tant que demande de STED réduira l&#39;intensité d&#39;émission. Pour STED, une taille optimale de pixel sera inférieure à 30 nm commentjamais une meilleure résolution sera obtenue avec des tailles de pixels plus petits. La taille de la région d&#39;intérêt étant imagé dictera la limite inférieure de la taille des pixels. La taille des pixels plus petits peuvent augmenter photoblanchiment. <ol><li> Appliquer STED faisceau d&#39;appauvrissement et de capture d&#39;image, en commençant avec 50% de l&#39;appauvrissement puissance du laser. Si une amélioration de la résolution est vu, plus la puissance du laser d&#39;appauvrissement peut être appliquée. A ce stade, il peut être nécessaire d&#39;ajuster la puissance d&#39;excitation laser, de la ligne moyenne, et / ou le gain. </li><li> Appliquer déclenchement de temps pour réduire le fond (minimum 0,3 ns). Réglez les paramètres jusqu&#39;à une amélioration de la résolution sur confocale peut être vu. La résolution peut être approchée par l&#39;estimation à mi-hauteur de la largeur (FWHM). Cela représente la distance à la moitié de l&#39;intensité maximale d&#39;un pic gaussien créé en dessinant un profil de ligne en travers de la structure d&#39;intérêt, et est une méthode largement utilisée pour estimer la résolution. </li><li> Une fois que le premier canal est satisfaisante, initier une deuxième séquence de soiINDIRECTS balayage. En général, il est préférable de balayer la longueur d&#39;onde premier fluorophore. Répétez l&#39;étape 6.1 de la deuxième chaîne. </li></ol></li><li> Confirmer l&#39;absence de chevauchement spectral par imagerie contrôles colorées simples avec les deux séquences de balayage. Chevauchement spectral légère peut être corrigée à l&#39;aide des fonctionnalités de l&#39;ONU-mélange spectrales dans le logiciel, mais devrait être évité autant que possible. </li></ol> 7. Acquisition de l&#39;image <ol><li> Acquérir des images. Pour l&#39;imagerie quantitative, il est recommandé d&#39;obtenir au moins 20 images / état. Le nombre exact, cependant, doit être défini en fonction de la question expérimentale de concert avec une approche statistique comme le calcul de la taille de l&#39;échantillon. Enregistrer expérience. </li></ol> 8. Déconvolution <ol><li> Ouvrir le fichier avec le logiciel de déconvolution ou traitement par lots. Vérifier les paramètres pour chaque canal en utilisant le logiciel. Confirmez excitation et d&#39;émission de spectres de chaque canal, STED épuisement émission, et l&#39;imagerie directiontion (haut ou bas, si l&#39;image est en 3 dimensions) en particulier. </li><li> Déconvolutionner aide de l&#39;assistant de déconvolution. Les réglages par défaut sont généralement suffisantes, mais le rapport signal sur bruit (SNTR) varie de fluorophore à fluorophore et devra être déterminé pour chaque canal et chaque expérience individuelle. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents. Coût de la publication partielle de cet article a été défrayé par Leica Microsystems, Inc.

L&#39;amélioration de la résolution sur confocale sera un peu dépend de facteurs qui ne peuvent être contrôlées. Ces facteurs comprennent les aberrations mineures d&#39;épaisseur et les incohérences dans les médias montage glissement couverture. Il est important de maintenir la température et l&#39;humidité dans la salle d&#39;imagerie aussi cohérente que possible, et le faisceau STED doit être réaligné environ toutes les 60 min. Comme mentionné dans les procédures, l&#39;utilisation de Vectashield milieu de montage doit être évitée, car ce n&#39;est pas compatible avec STED. En plus de ce qui, il faut toujours utiliser # 1.5 lamelles, et, si possible, utiliser ceux qui ont été vérifiées pour une épaisseur spécifique. Une modification de l&#39;approche décrite ici est à l&#39;image des canaux supplémentaires en confocale, en utilisant des fluorophores qui émettent à une longueur d&#39;onde que le faisceau STED. De cette manière, une image de boîte jusqu&#39;à quatre canaux (deux en confocale, deux dans STED). Si cette approche, cependant, les canaux avec des fluorophores emitting au-dessus du laser à appauvrissement STED devra être imagée d&#39;abord, comme l&#39;application du faisceau STED se videra photons dans ces canaux. Un avantage de cette technique est la demande de déclenchement de temps, ce qui permettra également d&#39;améliorer la résolution en éliminant confocale par émission de photons de courte durée de vie 34. En particulier, l&#39;utilisation de déclenchement de temps, le temps de détecteurs d&#39;émissions de correspondre avec excitation pulsée STED, diminue la fluorescence de fond de la réflexion sur le verre de la lamelle lors de l&#39;imagerie proche. Même dans une expérience ne convient pas pour STED, si vous utilisez une source d&#39;excitation pulsé, ouverture de porte de temps peut être un outil utile pour améliorer la résolution dans confocale. Il existe différentes modifications qui peuvent être utilisés pour améliorer la résolution dans STED. La première consiste à diminuer la taille du trou d&#39;épingle de la une unité d&#39;Airy standard, bien que cela va également diminuer la quantité de lumière atteignant l&#39;échantillon. Ceci peut être compensé en augmentant laspuissance er ou de gain. Une autre est d&#39;augmenter la moyenne de la ligne, ce qui augmentera la quantité de renseignements recueillis pour chaque photon, amélioration de la résolution. Encore une fois, cependant, cela peut se faire au détriment de photoblanchiment de l&#39;échantillon, de sorte qu&#39;un équilibre devra être trouvé entre la résolution et le blanchiment. De même, l&#39;utilisation de protéines fluorescentes comme la GFP, il faudra veiller à éviter l&#39;optimisation blanchiment. Ceci peut être réalisé en diminuant la puissance laser STED si nécessaire. Points de plus longues seront également permettre une plus grande récupération de photons et de réduire blanchiment. Correction pour photoblanchiment doit être comptabilisé lors de l&#39;analyse en direct STED. Bien entendu, l&#39;imagerie en trois dimensions dans STED est également possible, et donnera également une amélioration par rapport à l&#39;imagerie confocale classiques. Cela est particulièrement vrai si elle est faite en combinaison avec une déconvolution, bien que des précautions doivent être prises pour corriger la dérive qui se produit au cours de l&#39;imagerie des plans multiples dans l&#39;axe z. Si vous utilisez un logiciel Huygensà déconvolutionner, cette correction est obtenu en utilisant la fonction «stabiliser l&#39;image&quot;. En utilisant cette approche, la résolution dans l&#39;axe z sera améliorée. C&#39;est une grande amélioration par rapport à l&#39;imagerie confocale classique, qui a une résolution axiale pauvres, et même plus simplement se STED, qui a aussi résolution relativement faible de l&#39;axe z. Bien que l&#39;acquisition de plusieurs piles en STED, il faut prendre soin d&#39;éviter le blanchiment de l&#39;échantillon, et, si nécessaire, on peut réduire la moyenne de la ligne ou de l&#39;intensité de puissance laser afin de le faire. Là encore, il convient de noter que si l&#39;imagerie d&#39;autres fluorophores qui ne conviennent pas pour STED, l&#39;application du faisceau d&#39;appauvrissement dans le premier balayage séquentiel permettrait d&#39;éviter l&#39;émission à partir de ces canaux. Par conséquent, une approche mixte STED / confocale (en utilisant confocale à balayage dans les canaux qui émettent à une longueur d&#39;onde supérieure à 592 nm) ne sera malheureusement pas adapté pour la 3D. Pour résumer, nous avons choisi STED comme une approche en raison de sa relative facilité d&#39;applicationblication et amélioration de la résolution sur l&#39;imagerie confocale standard. Pour l&#39;imagerie de la synapse immunologique, il s&#39;est avéré une technique efficace et précieux qui nous permet de voir les détails de l&#39;architecture n&#39;est pas possible F-actine à une résolution de plus de 200 nm. Alors que beaucoup de ces détails semblent subtile, ils peuvent avoir un effet profond sur la fonction des cellules NK. Ainsi, nous appliquons la dernière technologie d&#39;imagerie nanoscopique à dériver des informations qui est essentiel pour le maintien de la santé humaine.

La synapse immunologique est un milieu complexe de protéines du cytosquelette et des éléments de signalisation. La synapse cytolytique a été décrit comme ayant un «œil de bœuf» comme la structure d&#39;un anneau de filaments d&#39;actine et molécules d&#39;adhésion autour d&#39;un domaine sécrétoire central 1-4. Cependant, nous savons maintenant qu&#39;il est constitué de domaines microscopiques de signalisation actif qui nécessitent une réorganisation du cytosquelette dynamique continue de la fonction 5-11. La plupart des informations que nous avons maintenant sur la synapse est dérivé de la microscopie, et immunologistes ont été les premiers à adopter la technologie d&#39;imagerie de pointe. Une telle nouvelle technologie est super-résolution microscopie. La microscopie optique conventionnelle est spatialement limitée par la barrière de la diffraction de la lumière, qui définit la limite inférieure de résolution pour toute la microscopie par fluorescence, confocal, y compris, à environ 200 nm. Au cours des dernières années, plusieurs techniques ont été developed qui permettent la résolution ci-dessous la barrière de diffraction. Il s&#39;agit notamment de la stimulation émission épuisement microscopie (STED), la microscopie illumination structurée (SIM), la microscopie stochastique résolu (STORM) et la microscopie optique photo-activable (PALM). Ces techniques ont été examinés en détail par ailleurs 12-15, mais sont décrites ci-dessous. résolution limitée de Subdiffraction est généré de façon unique dans chaque système. Le choix d&#39;une technique de super-résolution, par conséquent, doit être dicté par l&#39;expérience et le système expérimental d&#39;intérêt. Super-résolution STED est réalisé en utilisant une haute intensité toroïdal faisceau de déplétion sélective que &quot;silences&quot; de fluorescence autour de chaque fluorophore d&#39;intérêt après excitation, ce qui subdiffraction microscopie de fluorescence limitée 16-18. Un avantage de STED est que l&#39;acquisition de l&#39;image est rapide et nécessite relativement peu de post-traitement. Bien que la sélection de colorant est dictée par les spécificationstral de la position de faisceau d&#39;appauvrissement, qui, dans le système disponible dans le commerce est situé à 592 nm, à plusieurs colorants disponibles dans le commerce sont disponibles que faire des combinaisons de deux fluorophores possible. En outre, les reporters fluorescents couramment utilisés tels que la GFP peuvent être imagées, ce qui rend expériences sur des cellules vivantes 19,20 possible. Nous avons déjà utilisé STED pour identifier et quantifier les régions du hypodensité F-actine qui sont utilisés par les cellules NK pour la dégranulation 21,22. Nous proposons que STED est un bon choix pour l&#39;imagerie de la synapse immunologique en raison de sa disponibilité relativement souple de fluorophores et une amélioration supérieure dans la résolution dans l&#39;axe xy. En outre, sur le système STED disponibles dans le commerce utilisés pour ces expériences, l&#39;utilisation d&#39;un scanner à résonance à haute vitesse (12 000 Hz) permet une acquisition rapide des images avec des dommages minimes pour les échantillons. Une flexibilité limitée dans la sélection de colorant est considéré comme un inconvénient de STED 12,Toutefois double couleur STED est relativement simple avec plusieurs fluorophores disponibles dans le commerce. L&#39;intégration de la STED avec un microscope confocal à balayage laser permet également d&#39;imagerie confocale supplémentaire en combinaison avec STED, donc pendant STED est limité à deux canaux, des structures supplémentaires peuvent être imagés dans confocal avec une résolution d&#39;environ 200 nm (E. Mace, observations non publiées ). Bien que nous décrivons l&#39;utilisation de STED pour imager des cellules immunitaires, cette technologie est appliquée à une variété de types de cellules, y compris les cellules neurales, et pour la visualisation d&#39;une variété de structures de cellules 23-26. SIM utilise une approche différente pour générer des images de subdiffraction limitée. En visualisant les modèles d&#39;excitation périodique connus, l&#39;information peut alors être obtenue sur la structure inconnue est étudiée après transformation mathématique 27. Cela donne une augmentation de la résolution à ~ 100 nm latéralement 28,29. L&#39;avantage de la carte SIM est qu&#39;il is compatible avec tous les colorants et les sondes confocaux classiques, cependant l&#39;inconvénient est qu&#39;il est beaucoup plus lente pour acquérir des images et ceux-ci nécessitent une longue post-traitement 12. Cela limite également son utilisation pour l&#39;imagerie des cellules vivantes. Enfin, des images de super-résolution peuvent être générés par stochastique photo-commutation de fluorophores. Cette approche est exploitée dans la localisation microscopie photo-activé (PALM) et la microscopie optique reconstruction stochastique (STORM). Par la numérisation de plusieurs cadres de l&#39;appareil photo et la localisation de molécules activées de façon aléatoire qui sont activés &quot;sur&quot; et &quot;off&quot; au fil du temps, des images avec la résolution 20-30 nm sont générées à partir d&#39;images accumulées 30-32. Le compromis de cette résolution est le temps nécessaire pour acquérir des images. Ici, nous montrons, en détail, le protocole de préparation et l&#39;imagerie des échantillons de couleurs en double STED. Dans ce système, avec une excitation est puisé, accordable, un laser à lumière blanche. En raison de la naturedu faisceau d&#39;excitation pulsée, ouverture de porte de temps de détection est rendue possible et en outre la résolution augmente. En outre, le système est équipé de gadolinium hybride (HYD) des détecteurs, qui sont plus sensibles que les tubes photomultiplicateurs classiques, permettant ainsi à des exigences de puissance de laser inférieure. Le faisceau d&#39;épuisement pour STED est appliqué en continu et est accordé sur 592 nm, ce qui va dicter le choix des colorants disponibles, aux deux couleurs STED. Combinaisons de colorants couramment utilisés comprennent généralement un excitable par 488 nm (comme Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights verts, ou Chromeo 488) et un excitable par 458 nm (comme Pacifique Orange ou Horizon V500). Ainsi, alors que la détection des deux colorants sera dans une gamme similaire (et les deux sont accessibles par le laser à appauvrissement), l&#39;excitation se produit avec différentes longueurs d&#39;onde. Avec un accordables blanches laser de lumière et accordables détecteurs, maximiser le signal tout en éliminant le chevauchement spectral est fait assez facile. En tant que tel, nous avons eu un bon succès avec combinations de colorants disponibles dans le commerce, telles que le Pacifique Orange et Alexa Fluor 488 (utilisé ici). Notre protocole est adapté vers et décrit l&#39;évaluation des cellules NK humaines que représente le foyer historique de notre laboratoire. Nous sommes précisément en utilisant la lignée cellulaire NK92 dans cet exemple car c&#39;est celui que nous avons régulièrement appliquée dans notre expérimental 21,33 de travail.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:602px;" width="602">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:230px;">#1.5 cover slips</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">BD Cytofix/Cytoperm</td>
			<td style="width:222px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:150px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Cotton tipped applicator</td>
			<td style="width:222px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S450941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Falcon centrifuge tubes (50 ml)</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Fetal calf serum (FCS) (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:150px;">S11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Goat anti-rabbit Pacific Orange</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P31584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Laboratory tissue wipers</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Nail polish</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">100491-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">NK-92 cells</td>
			<td style="width:222px;">ATCC</td>
			<td style="width:150px;">CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phalloidin Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Prolong anti-fade reagent</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-CD18</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">301202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-NKp30</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">325202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-perforin</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">308102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">RPMI 1640 medium (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Saponin from Quillaja bark</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Super PAP pen</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">008899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:222px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:150px;">22142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Material Name</td>
			<td style="height:27px;">Company</td>
			<td style="height:27px;">Catalogue Number</td>
			<td style="height:27px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Huygens deconvolution software</td>
			<td style="height:27px;">SVI</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Leica SP8 TCS STED microscope</td>
			<td style="height:27px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (sted) nanoscopy

Cellules tueuses naturelles constituent strictement réglementés, les synapses immunologiques finement réglé (IS) afin de lyser les cellules infectées par des virus ou tumorigènes. Réorganisation dynamique de l&#39;actine est essentielle pour la fonction des cellules NK et la formation de l&#39;IS. Imagerie de la F-actine à la synapse est traditionnellement utilisé la microscopie confocale, mais la limite de diffraction de la lumière limite la résolution de la microscopie à fluorescence, confocal, y compris, à environ 200 nm. Les progrès récents dans la technologie d&#39;imagerie ont permis le développement de subdiffraction limitée super-resolution imaging. Afin de visualiser l&#39;architecture F-actine à l&#39;IS, nous récapitulons le NK cytotoxique des cellules synapse en respectant les cellules NK à l&#39;activation du récepteur sur le verre. Nous avons ensuite l&#39;image protéines d&#39;intérêt en utilisant deux couleurs épuisement de l&#39;émission stimulée microscopie (STED). Il en résulte &lt;80 nm de résolution à la synapse. Nous décrivons ici les étapes de préparation des échantillons et l&#39;acquisition d&#39;images à l&#39;aide de la double colou STED nanoscopie de visualiser la F-actine au NK EST. Nous illustrons également une optimisation de l&#39;acquisition de l&#39;échantillon en utilisant le logiciel Leica SP8 et temps-dépendants STED. Enfin, nous utilisons le logiciel Huygens pour le post-traitement déconvolution des images.

De toute évidence, l&#39;objectif premier des super-résolution imagerie sera une amélioration par rapport à la microscopie confocale classique. Cependant, il ya certains pièges courants qui peuvent conduire à la résolution optimale. Ceux-ci exigent que chaque expérience est optimisé individuellement. Dans notre expérience représentative, nous sommes imagerie du réseau F-actine dans une des cellules NK activées par l&#39;anticorps lié au verre. Les causes courantes de (et corrections) un manque de résolution améliorée de STED sur confocale sont les suivantes: <ol><li> Sous-échantillonnage (figure 1a). Cela peut conduire à la granulation et la perte d&#39;informations de pixels, comme le montre une faible résolution de filaments F-actine. Ligne a augmenté ou châssis moyenne peuvent souvent corriger cela. </li><li> Blanchiment et / ou sur-échantillonnage (figure 1b). Cela peut être causé par pixel longue durée de temporisation par suite d&#39;étalement excessif de la ligne. Alternativement, il peut être le résultat de la numérisation sur-de l&#39;image avant l&#39;acquisition, y compris sur l&#39;utilisation dele laser à appauvrissement. Il en résulte souvent des images floues ou brouillées. Ceci peut être corrigé par balayage de la zone d&#39;intérêt que très peu avant l&#39;acquisition et, si possible, augmentation de la vitesse de balayage du laser. Si le problème persiste, la puissance du laser d&#39;appauvrissement peut être réduite. </li></ol> En atteignant le bon équilibre du temps de séjour de pixels, l&#39;excitation puissance du laser, et l&#39;épuisement puissance du laser, une image avec une meilleure résolution et des informations suffisantes peuvent être générés (figure 1c). La résolution peut être encore améliorée par l&#39;utilisation de déconvolution (figure 1d). Lorsque l&#39;acquisition est optimisée, déconvolution permettra d&#39;améliorer la résolution à la fois qualitativement et quantitativement et sous-résolution de 100 nm devrait être systématiquement réalisable. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" /> Figure 1. Optimisation de l&#39;acquisition et les pièges courants de l&#39;imagerie STED. NK92 cellules ont été activées sur l&#39;anti-CD18 et-NKp30 verre revêtu pendant 20 min puis fixe, perméabilisées et colorées pour la F-actine avec phalloïdine Alexa Fluor 488. A) Un exemple de perte d&#39;informations d&#39;image en raison de sous-échantillonnage. b) Un exemple de perte de résolution due au blanchissement / sur-échantillonnage c) les conditions de d optimisé) des conditions optimisées conduisent à une plus grande amélioration de la résolution de déconvolution. Barre d&#39;échelle = 5 um.

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Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Ici, nous montrons le protocole pour l&#39;imagerie par deux couleurs STED nanoscopie la synapse immunitaire cytotoxique des cellules NK récapitulés sur le verre. En utilisant cette méthode, on obtient la résolution nm sous-100 de protéines synaptiques et le cytosquelette.

Visualisation du immunologique Synapse par double couleur Temps-dépendants émission stimulée épuisement (STED) nanoscopie

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

77.9K vues.  Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine.  Ici, nous montrons le protocole pour l'imagerie par deux couleurs STED nanoscopie la synapse immunitaire cytotoxique des cellules NK récapitulés sur le verre. En utilisant cette méthode, on obtient la résolution nm sous-100 de protéines synaptiques et le cytosquelette. 

Vidéo: Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Appauvrissement des populations de cellules spécifiques par l&#39;épuisement Complément

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Recherche

Immunologie et infection

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

Faciliter l&#39;analyse des données immunologiques avec Visual techniques analytiques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

L&#39;épuisement et la reconstitution des macrophages chez la souris

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Cholestérol des macrophages épuisement et ses effets sur la phagocytose des<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-résolution de l&#39;imagerie cellulaire Synapse immunologique Natural Killer sur un verre soutenu par Planar lipidique en deux couches

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Analyse qualitative et Quantitative de la Synapse immunitaire dans le système humain à l’aide d’imagerie de cytométrie en flux

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure that optimizes B-cell receptor (BCR) signaling and BCR-mediated antigen acquisition. Both the remodeling of the actin cytoskeleton and the reorientation of the microtubule network towards the antigen contact site are essential for immune synapse formation. Remodeling of the actin cytoskeleton into a dense peripheral ring of F-actin is accompanied by polarization of the microtubule-organizing center towards the immune synapse. Microtubule plus-end binding proteins, as well as cortical plus-end capture proteins mediate physical interactions between the actin and microtubule cytoskeletons, which allow them to be reorganized in a coordinated manner. Elucidating the mechanisms that control this cytoskeletal reorganization, as well as understanding how these cytoskeletal structures shape immune synapse formation and BCR signaling, can provide new insights into B cell activation. This has been aided by the development of super-resolution microscopy approaches that reveal new details of cytoskeletal network organization. We describe here a method for using stimulated emission depletion (STED) microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and transfected GFP-tagged microtubule plus-end binding proteins in B cells. To model the early events in immune synapse formation, we allow B cells to spread on coverslips coated with anti-immunoglobulin (anti-Ig) antibodies, which initiate BCR signaling and cytoskeleton remodeling. We provide step-by-step protocols for expressing GFP fusion proteins in A20 B-lymphoma cells, for anti-Ig-induced cell spreading, and for subsequent cell fixation, Immunostaining, image acquisition, and image deconvolution steps. The high-resolution images obtained using these procedures allow one to simultaneously visualize actin structures, microtubules, and the microtubule plus-end binding proteins that may link these two cytoskeletal networks.

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

We present a protocol for using STED microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and microtubule plus-end binding proteins in B cells that have spread on coverslips coated with antibodies to the B-cell receptor, a model for the initial phase of immune synapse formation.

Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

Étudier la dynamique d'Organelle dans les cellules B pendant la formation immunitaire de synapse

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic fever and autoimmune diseases. Since thousands of antibodies with different epitopes are circulating in blood, no universal method, except for the dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF), was reported to target specific harmful antibodies. The development of DCAF molecules makes significant contribution to the progress of targeted therapy, which were demonstrated to eliminate the antibody dependent enhancement (ADE) effect in a Dengue virus (DENV) infection model and to boost the acetylcholine receptor activity in a myasthenia gravis model. Here, we describe a protocol for the synthesis of a DCAF molecule (DCAF1), which can selectively block 4G2 antibody to attenuate ADE effect during Dengue virus infection, and illustrate the binding of DCAF1 to 4G2 antibody by an ELISA assay. In our method, DCAF1 is synthesized by the conjugation of a hydrazine derivative of a Fc-III peptide and a recombinant expressed long &#945;-helix with antigenic sequence through native chemical ligation (NCL). This protocol has been successfully applied to DCAF1 as well as other DCAF molecules for targeting their cognate antibodies.

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) is novel for the elimination of harmful antibodies. Here, we describe a detailed protocol for the synthesis of DCAF1 molecule, which can selectively block 4G2 antibody to eliminate antibody dependent enhancement effect during Dengue virus infection.

Blocage ciblé d'anticorps par un conjugaison bifonctionnel de peptide antigénique et de mimétrie fc-III (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...