Le but de la méthode est de générer une synapse immunologique qui est un exemple de conjugaison de cellule à cellule formée par une cellule antigène-présentation et un lymphocyte de T-helper. Notre objectif est d’enregistrer les premiers stades de la formation de synapse immunitaire et d’enregistrer les événements de trafic qui se produisent dans le lymphocyte T-helper. Ceux-ci mèneront par la suite à la sécrétion polarisée à la synapse immunisée.
L’approche présentée ici implique la conjugaison de cellule à cellule, l’acquisition de time-lapse, la microscopie de fluorescence à champ large, et le traitement ultérieur d’image. Cela améliore le rapport signal-bruit des images, améliore la résolution temporelle et permet l’acquisition simultanée de plusieurs fluorochromes dans les conjugués synaptiques émergents et diminue le blanchiment par fluorescence. En outre, le protocole est compatible avec les protocoles de fixation cellulaire de point final qui permettront la coloration et l’analyse d’immunofluorescence.
Ce protocole est également compatible avec la microscopie fluorescente à balayage laser et d’autres techniques de microscopie à la fine pointe de la technologie. Ana Bello, étudiante diplômée, Alejandro Garrido, technicien, et Solange Moreno, étudiante diplômée, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, ajouter 150 microlitres de fibronectine à chaque puits d’une diapositive de chambre de huit microwell et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure.
Après la période d’incubation, aspirer la fibronectine et bien laver avec 200 microlitres de PVS pendant deux minutes avec des secousses douces. Répétez ce lavage une fois de plus et laissez le deuxième lavage dans le puits. Transférer 10 millilitres d’une préculture confluente de cellules Raji dans un tube v-fond de 15 millilitres.
Centrifugeuse à 300 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez doucement la pastille cellulaire dans un milieu chaud et complet à une concentration de 1 million de cellules par millilitre. Pour étiqueter les cellules Raji, transférer le nombre requis de cellules dans le milieu de la culture à un tube de deux millilitres.
Pour la diapositive de chambre de huit micro puits, un total de 1,6 millilitres de suspension cellulaire est nécessaire. Ajouter le bleu de traqueur cellulaire à une concentration finale de 10 micromolaires. Resuspendez les cellules tachées de bleu de traqueur de cellules et transférez 200 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits des glissières préparées de chambre fibronectin-enduites.
Incuber la chambre glisser à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 30 minutes à une heure. Après cela, secouez doucement les glissières de chambre sur le microscope pour s’assurer que les cellules Raji sont respectées. Lavez chaque puits soigneusement avec le milieu chaud et complet de culture cellulaire pour éliminer l’excès de bleu de traqueur de cellules.
Assurez-vous que les cellules Raji sont adhérentes au fond des plaques, et qu’elles présentent des lacunes entre elles et qu’elles ne sont pas confluentes. 50-60% de la confluence cellulaire est appropriée. Tout d’abord, ajouter Staphylococcal Enterotoxin E à une concentration d’un microgramme par millilitre à chaque puits.
Assurez-vous que les cellules Raji sont pulsées avec superantigen sinon le récepteur des cellules T des cellules Jurkat ne reconnaîtra pas le SCE et synapse ne sera pas formé. Incuber la chambre glisser à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant au moins 30 minutes. Ensuite, obtenez une culture précédemment croissante des cellules de Jurkat à une concentration comprise entre 1 et 2 millions de cellules par millimètre.
Observez les cellules sous un microscope à contraste de phase, puis transférez les cellules dans un tube v-bottom de 15 millilitres. Centrifugeuse à 300 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez doucement les cellules dans un milieu de culture chaud et complet à une concentration de 1 million de cellules par millilitre.
Ensuite, maintenir les cellules de Jurkat en culture à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi. Récupérez les diapositives de chambre contenant les cellules Raji de l’incubateur, étiquetées bleu staphylococcus Enterotoxin E. Aspirez soigneusement le milieu de culture de chaque puits un par un avec une pipette placée dans un coin du puits.
Remplacez immédiatement le milieu par 200 microlitres des cellules de Jurkat résuspendées dans le milieu de culture cellulaire. Si un laps de temps est effectué, passez rapidement au microscope. Localisez la glissière chambée sur le serveur de mise en scène au microscope et sélectionnez quelques champs appropriés.
Préparer le microscope et la chambre d’incubation avant l’imagerie. Après que les cellules de Jurkat ont été ajoutées à chaque puits contenant les cellules raji, localisez rapidement la glissière de chambre micro-gonflée sur l’incubateur mis en scène au microscope préchauffé et sélectionnez quelques positions XY. Si seulement une expérience de point de terminaison est prévue, incuber la glissière de chambre à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant une à deux heures.
Après la période de culture, vérifiez la formation conjuguée et réparez ensuite les conjugués tels qu’ils sont décrits dans le protocole du texte. Pour fixer les cellules, ajouter le RPMI chaud sans FCS et secouer doucement. Aspirez le RMPI et ajoutez 200 microlitres d’acétone PFA ou préchilled à chaque puits.
Incuber la glissière de chambre à température ambiante ou sur la glace pendant 20 minutes. Ensuite, lavez chaque puits deux fois avec pvs et ajouter 200 microlitres de solution d’assaisons. Dans cette étude, des conjugués immunos synapse de Jurkat-Raji sont générés et les premiers stades de la formation immunologique de synapse sont correctement imités.
Cette stratégie induit la formation immunologique de synapse tout en exécutant simultanément la formation image de laps de temps. Les conjugués synaptiques représentatifs Jurkat-Raji obtenus à partir de cette technique sont montrés ici, y compris une image du canal de transmission, du canal bleu de traqueur cellulaire, et ces deux canaux ont fusionné. Certains conjugués synaptiques peuvent être vus, y compris ceux composé d’une seule cellule Jurkat et plusieurs cellules Raji, qui sont des conjugués complexes.
La diminution des concentrations cellulaires contournera la formation de conjugués cellulaires complexes, mais pourrait ne pas fournir suffisamment de conjugués cellulaires pour l’analyse subséquente du trafic polarisé, ce qui diminuera les chances de trouver et d’imager les conjugués synaptiques émergents. Une déconvolution des images du canal de fluorescence GFP-CD63 est effectuée avec un logiciel de déconvolution approprié utilisant l’option optique à champ large et les paramètres optiques appropriés. Ce canal déconterté a ensuite été fusionné au canal large bleu de traqueur cellulaire.
Il y a une amélioration du rapport signal-bruit et de la netteté. Une pile Z représentative d’un conjugué synapse immunologique fixe est montrée ici. L’immunofluorescence est effectuée à l’aide de la phalloidine pour visualiser la F-actine, anti-CD63 pour visualiser le MVB, et anti-gamma-tubulin pour visualiser MTOC tandis que le traqueur cellulaire bleu étiqueté les cellules Raji.
Le transfixage facultatif des cellules de Jurkat permettra la visualisation du trafic des granules sécrétaires dans les cellules vivantes. Par exemple, lorsque GFP-CD63 est exprimé, le mouvement des vésicules décorées GFP-CD63 peut être enregistré. Le protocole est compatible avec les protocoles de fixation des points de fin qui permettront d’autres protocoles et analyses de coloration de l’immunofluorescence.
Il existe des modèles expérimentaux de productivité qui peuvent simplifier l’imagerie dans la synapse immunitaire, mais ces modèles n’imitent pas la surface complexe et irrégulière des cellules antigènes-présentateurs qui peuvent produire des interactions non physiologiques à la synapse immunitaire. L’approche décrite ici est appropriée pour reproduire et confirmer certaines complexités biologiques se produisant à la synapse immunisée. Superantigen est une toxine dangereuse alors s’il vous plaît assurez-vous de porter des gants, et laisser tomber la pointe utilisée sur la boîte dangereuse.
