Les auteurs remercient le Dr Kent Seeley, directeur du Centre pour la découverte de médicaments et l&#39;innovation (CDDI) Facility protéomique de base à l&#39;Université de Floride du Sud pour l&#39;utilisation de cette installation. Ce travail a été soutenu par le NIH / NIDCD subvention R01 DC004295 à BHAS

Déclaration d&#39;éthique Des expériences sur des souris tissu ont été approuvés par l&#39;Université de Floride du Sud institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Commission (protocoles 3931R, 3482R) comme figurant sous les lignes directrices des National Institutes of Health. Une. Extraction des protéines <ol><li> Isoler épithélium sensoriel cochléaire de 16 à 30 jours-vieux (P30) des souris CBA / J et conserver à -80 ° C. </li><li> Le jour de l&#39;expérience, le tissu de lavage avec 500 ul de 1 x tampon phosphate salin (PBS). Centrifuger 3 min à 1000 xg, et retirer le surnageant. Répéter pour un total de trois lavages. </li><li> Tissu ultrasons pendant 30 s sur de la glace dans 100 ul de tampon de lyse contenant 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM de NaCl, mM de NaF 50 mM, EDTA 5, 500 ug / AEBSF ml, 10 pg / ml de leupeptine, 100 ug / ml de pepstatine, 2 pg / ml d&#39;aprotinine, et 0,5 pg / ml microcystines utilisant un désintégrateur sonore (Modèle 100, Thermo Fisher). Lysat refroidir sur glacependant 1 minute entre chaque sonication. Soniquer un total de 3x. </li><li> Centrifuger à 750 xg à 4 ° C pendant 2 min et retirez le surnageant dans un nouveau microtube. Extraire le culot dans 50 ul de tampon de lyse par sonication pendant 30 secondes sur de la glace. Centrifuger à 750 xg à 4 ° C pendant 2 min. Combiner les deux lysats et centrifuger à 28 600 g à 4 ° C pendant 60 min. Retirer le surnageant dans un nouveau microtube et ajouter un tampon de lyse de 20 ul contenant 0,1% d&#39;ASB-14 de la pastille. Vortex pendant 1 minute et laisser incuber pendant 60 min à 4 ° C. </li><li> Chauffer l&#39;échantillon à 95 ° C pendant 5 min, puis refroidir à 4 ° C pendant 60 min. Suivez avec centrifugation à 16 000 g à 25 ° C pendant 10 min. Recueillir le surnageant et transférer dans un nouveau tube. </li><li> Centrifuger la suspension à 16 000 xg à 4 ° C pendant 5 minutes et conserver le surnageant pour la digestion. </li></ol> 2. Double tryptique digestion des protéines de lysat entier utilisant FASP <ol><li> Ajouter à 30 μl aliquote (≤ 400 ug) d&#39;extrait de protéine cochléaire, contenant 4% de dodécylsulfate de sodium (SDS), 100 mM de Tris-HCl, pH 7,6 et 0,1 M de dithiothréitol (DTT) directement à un filtre à rotation 30K et mélanger avec 200 ul de huit M d&#39;urée dans un tampon Tris-HCl. Centrifuger à 14 000 g pendant 15 min. </li><li> On dilue le concentré avec 200 ul d&#39;une solution d&#39;urée 8 M et centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min. </li><li> Ajouter 10 pl de 10x iodoacétamide (IAA) dans une solution d&#39;urée 8 M au concentré dans le filtre et le vortex pendant 1 min. Incuber le filtre rotatif pendant 20 min à température ambiante (RT) dans l&#39;obscurité, suivie d&#39;une centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. </li><li> Ajouter 100 ul de solution d&#39;urée 8 M au concentré sur l&#39;unité de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min. Répétez cette étape 2x. Ajouter 100 ul de 50 mM de bicarbonate d&#39;ammonium (ABC) solution de l&#39;unité de filtration et de centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 2x. </li><li> Ajouter 0,4 ug / ul de trypsine à 1:100 (p / p) à une enzyme-Protéine rapport et incuber pendant une nuit (O / N) à 37 ° C. </li><li> Après l&#39;incubation, ajouter 40 ul de solution 50 mM ABC unité de filtrage et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 1x. </li><li> Ajouter 50 ul de solution à 0,5 M de NaCl dans le filtre et centrifuger à 14 000 xg pendant 10 min. Transférer le filtrat contenant les peptides tryptiques à un nouveau microtube et acidifier avec de l&#39;acide formique (FA) à 1,0% pour arrêter la digestion. </li><li> Laver le filtre avec 40 pi de 8 M d&#39;urée, puis laver 2 fois avec 40 pl 18 MQ eau. </li><li> Laver l&#39;unité filtre 3x avec 100 ul de solution 50 mM ABC. Après le lavage final, ajouter 0,4 ug / ul de trypsine à 1:100 (p / p) rapport enzyme à protéine et incuber O / N à 37 ° C. </li><li> Éluer les peptides trypsiques de la seconde digérer en ajoutant 40 ul de solution 50 mM ABC à l&#39;unité de filtration et de centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 1x. </li><li> Ajouter 50 ul de solution à 0,5 M de NaCl à l&#39;Unité de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Transférer le filtrat contenant les peptides tryptiques à un nouveau microtube et acidifier avec FA à 1,0%. </li><li> Les échantillons peuvent être quantifiés en utilisant le dosage colorimétrique de microplaques en utilisant la BSA comme standard. </li></ol> 3. Endoprotéinase LysC et tryptique digestion des protéines de lysat entier utilisant FASP <ol><li> Ajouter une fraction aliquote de 30 ul (≤ 400 ug) d&#39;extrait de protéine cochléaire contenant 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 et 0,1 M DTT directement à un filtre à rotation 30K et mélanger avec 200 ul d&#39;urée 8 M dans du Tris-HCl . Centrifuger à 14 000 g pendant 15 min. </li><li> On dilue le concentré avec 200 ul d&#39;une solution d&#39;urée 8 M et centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min. </li><li> Ajouter 10 pl de 10x AAI en solution d&#39;urée 8 M au concentré dans le filtre et le vortex pendant 1 min. Incuber le filtre centrifuge pendant 20 min à température ambiante dans l&#39;obscurité puis centrifuger à 14 000 g pendant 10 min. </li><li> Ajouter 100 pi de 8 M d&#39;urée solution au concentré sur l&#39;unité de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min. Répétez cette étape 2x. Ajouter 100 ul d&#39;une solution 100 mM ABC à l&#39;unité de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 2x. </li><li> Ajouter 0,1 pg / pl d&#39;endoprotéinase LysC dans un 01:50 (p / p) rapport enzyme à protéine et incuber O / N à 30 ° C. </li><li> Après l&#39;incubation, ajouter 40 ul de solution 100 mM ABC à l&#39;unité de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 1x. </li><li> Ajouter 50 ul de solution à 0,5 M de NaCl dans le filtre et centrifuger à 14 000 xg pendant 10 min. Transférer le filtrat contenant les peptides LysC à un nouveau microtube et acidifier avec FA à 1,0% pour arrêter la digestion. </li><li> Laver le filtre avec 40 pi de 8 M d&#39;urée, puis laver 2 fois avec 40 pl 18 MQ eau. </li><li> Laver l&#39;unité filtre 3x avec 100 ul de solution 50 mM ABC. Après le lavage final, ajouter 0,4 ug / ul de trypsine à 1:100 enzyme-à-prorapport protéine et incuber O / N à 37 ° C. </li><li> Éluer les peptides tryptiques en ajoutant 40 ul de solution 50 mM ABC à l&#39;unité de filtration et de centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 1x. </li><li> Ajouter 50 ul de solution à 0,5 M de NaCl à l&#39;unité de filtration et de centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Transférer le filtrat contenant les peptides tryptiques à un nouveau microtube et acidifier avec 1,0% FA. </li><li> L&#39;échantillon peut être quantifiée en utilisant le test colorimétrique microplaque avec de la BSA comme standard. </li></ol> 4. Les peptides de dessalage l&#39;utilisation des colonnes Spin <ol><li> Activer une colonne C 18 en macrospin en ajoutant 500 pl d&#39;acétonitrile (ACN) et centrifuger à 1100 g pendant 1 min. Jeter l&#39;effluent après centrifugation. </li><li> Équilibrer la colonne avec 500 ul de 0,1% de FA et centrifuger à 1100 g pendant 1 min. Jeter l&#39;effluent à travers et répétez cette étape 1x. </li><li> Ajouter jusqu&#39;à 500 pi du peptide digérer à la une de la colonned centrifuger à 1100 g pendant 1 min. Si le volume de l&#39;échantillon est supérieure à 500 pi puis répétez cette étape. </li><li> Laver la colonne avec 500 ul de 0,1% de FA et centrifuger à 1100 g pendant 1 min. Jeter l&#39;effluent à travers. Répétez cette étape 1x. </li><li> Ajouter 250 ul d&#39;un rapport de 90:10 d&#39;ACN-eau à la colonne et centrifuger à 1100 g pendant 1 min. Recueillir l&#39;éluant contenant les peptides dessalée et transférer à un nouveau microtube. Répétez cette étape 1x. </li><li> Sécher l&#39;échantillon de peptide dessalé dans une centrifugeuse sous vide et éviter de laisser l&#39;échantillon sécher complètement. </li></ol> 5. Échange chromatographie ionique <ol><li> Injecter 50-100 mg de l&#39;échantillon de protéines digérées sur un 200 x 2,1 mm, 5 um colonne SCX (Polysulfoethyl A) pour séparer les peptides. </li><li> Utiliser un gradient de 2-40% de B sur 50 min avec un débit de 250 ul / min. Le solvant A est le formiate d&#39;ammonium 5 mM, pH 3,0 dans 25% d&#39;acétonitrile et de 75% le trou DDH 2 O. Le solvant B est le formiate d&#39;ammonium 500 mM, pH6,0 à 25% d&#39;ACN et 75% le trou DDH 2 O. </li><li> Surveiller les fractions peptidiques à 280 nm et de recueillir les fractions dans des intervalles de 2 min à l&#39;aide d&#39;un collecteur de fractions. </li><li> Fractions séchées dans un concentrateur sous vide et remettre en suspension dans 500 ul d&#39;acétonitrile à 50% dans le trou DDH 2 O contenant 5% de FA pour aider à l&#39;élimination des sels. </li><li> Fractions Redry et conserver à -80 ° C jusqu&#39;au moment de servir pour l&#39;analyse nano LC-MS/MS. </li></ol> 6. Précipitation à l&#39;acétone Avant la séparation de GELFrEE le surnageant de protéine cochléaire doit être dessalée. Précipitation à l&#39;acétone peut être utilisé pour dessaler et concentrer les protéines. <ol><li> Ajouter trois volumes d&#39;acétone glacée au surnageant cochléaire. Vortex doucement et incuber à -20 ° CO / N. </li><li> Centrifuger le mélange de l&#39;échantillon à 15 000 g pendant 15 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. </li><li> Laver le culot protéique 3x avec de l&#39;acétone refroidie et centrifuger à 14 000 g pendant 5 min à 4° C. </li><li> Air-sécher le culot et le dissoudre dans 112 ul de 18 MQ eau. </li><li> Déterminer la concentration en protéine en utilisant le dosage colorimétrique de microplaques. </li></ol> 7. GELFrEE fractionnement de Cochlear sensorielle épithélium <ol><li> Ajouter 30 ul de tampon d&#39;échantillon de 5 x (0,25 M de Tris-HCl pH 6,8, 10% (p / v) de SDS, 50% de glycerol, 0,5% (p / v) de bleu de bromophénol) à la protéine dessalée en suspension dans 112 ul de 18 MQ eau. </li><li> Ajouter 8 pi de 1M TNT et de la chaleur à 95 ° C pendant 5 min pour réduire les liaisons disulfures de protéines. Après chauffage de permettre le refroidissement jusqu&#39;à la température ambiante. </li><li> Ajouter 8 ml de tampon courante de réservoir d&#39;anode, 150 ul de tampon de migration pour échantillonner chambre de collecte, et 6 ml de tampon courante pour réservoir de cathode. </li><li> Retirez tout tampon qui pourrait avoir coulé dans la chambre échantillon-chargement à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Charge 150 pi (≤ 1 mg) du mélange de protéines cochléaire, dans la chambre d&#39;échantillonnage chargement à l&#39;aide de 8% Trest-acétate de cartouche avec une gamme de masse de 3,5 à 150 kDa. </li><li> Électrodes inférieures et fermer le couvercle de l&#39;appareil pour commencer la course. </li><li> Au premier temps de pause de l&#39;instrument ajouter 2 ml de tampon courante dans le réservoir de cathode et de reprendre l&#39;exécution. </li><li> A chaque intervalle de pause sur l&#39;instrument, prélever l&#39;échantillon à partir de la chambre de collecte d&#39;échantillon à l&#39;aide d&#39;une pipette et l&#39;ajouter à un microtube fraîchement marqué. Laver les 2x chambre de collection avec 150 pi de tampon de migration et le jeter. </li><li> Ajouter 150 pi de tampon frais de fonctionnement de la chambre de collecte d&#39;échantillon et de reprendre l&#39;exécution. On récupère les fractions de protéines sur une période de temps de 2,6 heures dans un volume total de 150 pl / fraction. </li></ol> 8. 1D électrophorèse sur gel GELFrEE fractions Électrophorèse sur gel 1D peut être utilisé pour visualiser les résultats de GELFrEE fractionnement préalable à la digestion enzymatique et l&#39;analyse MS. GELFrEE fractions protéiques peuvent être séparés sur un gel de Tris-HCl 4-15%. </p&gt; <ol><li> Mélanger une partie aliquote de 5 ul de chaque fraction de GELFrEE avec 5 pl de tampon de dilution échantillon (350 mM de DTT dans un tampon d&#39;échantillon). </li><li> Chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 3 min. </li><li> Échantillons refroidir à température ambiante. </li><li> Charger 10 ul de chaque fraction de GELFrEE dans les voies individuelles de gel et de la charge 5 pi de standard de poids moléculaire dans la dernière voie inutilisé. </li><li> Exécuter le gel à 125 V pendant 1,5 heure ou jusqu&#39;à ce que le front de colorant atteint le bas du gel. </li><li> Retirer soigneusement le gel et la coloration à l&#39;argent Stain Plus pour visualiser la séparation des protéines. </li></ol> 9. La digestion des protéines de fractions GELFrEE Utilisation FASP Une procédure de FASP modifiée est utilisée pour l&#39;élimination du détergent et la digestion des fractions de GELFrEE. <ol><li> Ajouter chaque fraction individuelle directement à une unité de filtre 30K; mélanger avec 200 ul d&#39;urée 8 M dans du Tris-HCl et centrifuger à 14 000 xg pendant 25 min. </li><li> On dilue le concentré avec 200 ul de solution d&#39;uréeet centrifuger à 14 000 g pendant 12 min. Répétez cette étape 1x. </li><li> Ajouter 10 pl de 10x IAA dans une solution d&#39;urée au concentré dans chaque unité de filtre, vortex pendant 1 min, et incuber pendant 30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Ajouter 100 ul de solution d&#39;urée au concentré sur les unités de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min. Répétez cette étape 2x. Ajouter 100 ul d&#39;une solution 100 mM ABC vers les unités de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 2x. </li><li> Ajouter 0,1 pg / pl de LysC de 1:50 (p / p) rapport enzyme à protéine pour les unités de filtrage et incuber O / N à 30 ° C. </li><li> Après l&#39;incubation, ajouter 40 ul de solution 100 mM ABC aux filtres de spin et centrifuger à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 1x. </li><li> Ajouter 50 ul de solution à 0,5 M de NaCl à des filtres de spin et centrifuger à 14 000 xg pendant 10 min. Transférer le filtrat contenant les peptides LysC de chaque filtre rotatif à un nouveau microtube et acidifier avec trifluoroacacide étique (TFA). </li><li> Laver les filtres de spin avec 40 pi de 8 M d&#39;urée, puis laver 2 fois avec 40 pl 18 MQ eau. </li><li> Laver les filtres de spin 3x avec 100 pi d&#39;une solution 50 mM ABC. Après le lavage final, ajouter 0,4 pg / pl de la trypsine dans un 1:100 (p / p) rapport enzyme à protéine et incuber O / N à 37 ° C. </li><li> Éluer les peptides trypsiques de chaque unité de filtration en ajoutant 40 ul de solution 50 mM ABC et centrifuger à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 1x. </li><li> Ajouter 50 ul de solution à 0,5 M de NaCl à des unités de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Transférer le filtrat contenant les peptides trypsiques de chaque unité de filtre à un nouveau microtube et on acidifie avec du TFA. </li><li> Séchez tous les résumés dans un concentrateur sous vide. </li></ol> 10. Préparation de l&#39;échantillon pour LC-MS/MS <ol><li> Reconstituer LysC et séché peptide trypsique des fractions de digestion dans 20 ul de 0,1% de FA et de vortex. </li><li> Centrifuger les échantillons à 20 000 g pendant 10min et retirez la partie supérieure de 95% de l&#39;échantillon à un nouveau flacon de l&#39;échantillon. </li><li> Injecter 5 ul de chaque fraction de peptide sur une 100 um x 25 mm échantillon piège pour éliminer les sels et les contaminants et effectuer une séparation chromatographique sur un 75 x 10 cm um C 18 colonne. </li><li> Utiliser un gradient de 2-40% de B sur 100 min avec un débit de 200 nl / min. Le solvant A est de 95% ddH2O et 5% d&#39;acétonitrile contenant 0,1% de FA. Solvant B est de 80% et 20% ACN ddH2O contenant 0,1% de FA. </li><li> Recueillir dix tandem spectres de masse pour chaque scan MS sur un spectromètre de masse à haute résolution. Un spectromètre de masse LTQ Orbitrap a été utilisé dans cette expérience. </li></ol> 11. Identification des protéines <ol><li> Identifier les protéines en utilisant la base de données de la souris UniProt contenant à la fois avant et arrière séquences de protéines et contaminants communs. Logiciel MaxQuant moteur de recherche MASCOT avec est utilisé pour rechercher la base de données de protéines. </li><li> Les paramètres de recherche qui peuvent être utilisés comprennent, MODIFIC fixeation de carbamidomethyl de la cystéine, modifications variables de l&#39;oxydation de la méthionine, la protéine N-terminale acétylation, maximum de 2 manqué clivage. La longueur du peptide minimum à considérer pour l&#39;identification est de 6 acides aminés. Entrer un peptide de masse erreur de concentration de ± 8 ppm et une tolérance de masse de fragment de 1,2 Da (erreur de masse dépend du spectromètre de masse utilisé). </li><li> Dans le logiciel de MaxQuant, utiliser un taux de faux positifs de 1% (FDR) pour le peptide et l&#39;identification des protéines. L&#39;identification des protéines est listé avec le nombre de peptides appariées, la couverture de séquence de la protéine pour cent, et les séquences peptidiques. </li></ol>

<ol>
	<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+-+Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Review - Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312, 212-217 (2006).</li><li>Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+induced+changes+in+the+expression+of+p38/MAPK+signaling+proteins+in+the+sensory+epithelium+of+the+inner+ear.">Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear.</a> J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).</li><li>Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+analysis+of+proteins+in+inner+ear+tissues+and+fluids+with+emphasis+on+endolymphatic+sac,+otoconia,+and+organ+of+Corti.">Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti.</a> Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).</li><li>Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+of+Corti-specific+polypeptides:+OCP-I+and+OCP-II.">Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II.</a> J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).</li><li>Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , (2009).</li><li>Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics+of+mouse+models+for+deafness,+a+discovery+strategy.">Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy.</a> Brain Res. 1091, 113-121 (2006).</li><li>Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+the+Organ+of+Corti+Using+Nanoscale+Liquid+Chromatography+Coupled+with+Tandem+Mass+Spectrometry.">Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).</li><li>Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Transcriptomics,+Proteomics,+and+MicroRNA+Analyses+Reveals+Novel+MicroRNA+Regulation+of+Targets+in+the+Mammalian+Inner+Ear.">Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/K+-ATPase+&#945;1Identified+as+an+Abundant+Protein+in+the+Blood-Labyrinth+Barrier+That+Plays+an+Essential+Role+in+the+Barrier+Integrity.+.">Na+/K+-ATPase &#945;1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. .</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Bundles+Are+Specialized+for+ATP+Delivery+via+Creatine+Kinase.">Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase.</a> Neuron. 53, 371-386 (2007).</li><li>Chen, Z. Y., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inner+ear+gene+expression+database.">An inner ear gene expression database.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).</li><li>Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+gene+expression+in+the+inner+ear.">Ion channel gene expression in the inner ear.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).</li><li>Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+in+analysing+complex+proteomics+samples.">Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples.</a> J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).</li><li>Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+chromatographic+techniques+and+methods+in+shotgun+proteome+analysis.">Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis.</a> Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).</li><li>Wu, C. C., MacCoss, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics:+Tools+for+the+analysis+of+complex+biological+systems.">Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).</li><li>Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Two-Dimensional+Separation+of+Intact+Proteins+for+Bottom-Up+Tandem+Mass+Spectrometry+of+the+Human+CSF+Proteome.">Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome.</a> J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).</li><li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry:+Bottom-up+or+top-down.">Mass spectrometry: Bottom-up or top-down.</a> Science. 314, 65-66 (2006).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li><li>Reid, G. E., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+down'+protein+characterization+via+tandem+mass+spectrometry.">Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).</li><li>Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+for+proteomics.">Mass spectrometry for proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).</li><li>Thalmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics:+A+fad+or+hear+to+stay.">Inner ear proteomics: A fad or hear to stay.</a> Brain Res. 1091, 103-112 (2006).</li><li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney.">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).</li><li>Darville, L. N., Sokolowski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Proteomic+Analysis+of+Mouse+Cochlear+Sensory+Epithelium+by+Mass+Spectrometry.">In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).</li><li>Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PRoteomics+IDEntifications+(PRIDE)+database+and+associated+tools:+status+in+2013.">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêts.

<html> Les étapes clés pour maximiser l&#39;identification des protéines à partir de l&#39;épithélium sensoriel cochléaire sont: 1) l&#39;utilisation de multiples endoprotéinases pour la digestion, 2) l&#39;utilisation de techniques de séparation multiples, et 3) l&#39;utilisation d&#39;un spectromètre de masse à haute résolution. L&#39;application de plusieurs enzymes augmente le nombre de peptides et améliore la couverture de la séquence de protéine, d&#39;où l&#39;amélioration du nombre de protéines ...

La protéomique est l&#39;étude des systèmes biologiques complexes par l&#39;analyse de l&#39;expression des protéines, la fonction, les modifications, et les interactions 1. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour l&#39;analyse du protéome de l&#39;oreille interne, y compris l&#39;anticorps microarray 2, électrophorèse bidimensionnelle sur gel 3-5, et DIGE 6. Toutefois, seul un nombre limité de protéines ont été identifiées et caractérisées 2,7-10, par rapport aux plus de 10.000 gènes et des marqueurs de séquences exprimées (EST) identifiés dans l&#39;oreille interne 11,12, MS est la technique la plus couramment utilisée complet et en protéomique pour la caractérisation des protéines. L&#39;analyse des échantillons protéomiques complexes, comme la cochlée, peut être difficile. Cependant, la combinaison de plusieurs techniques de séparation avec MS permet l&#39;identification d&#39;un grand nombre de peptides et de protéines, en raison d&#39;une gamme de concentration dynamique accrue et la capacité de pointe 13. Chroma multidimensionnellephie réduit mélanges de protéines très complexes en permettant l&#39;utilisation de mécanismes d&#39;adsorption différentes. Il existe deux approches de SEP d&#39;analyse du protéome couramment utilisés, fusil de chasse et de la protéomique bottom-up. Dans la protéomique de fusil de chasse, un mélange de protéines intactes est digéré par voie enzymatique et on le sépare par chromatographie multidimensionnelle avec une Chromatographie d&#39;échange de cations forte (SCX), puis par Chromatographie liquide en phase inverse (RPLC) 14,15. Les peptides séparés sont soumis à SM en tandem et base de données de recherche 15. Un avantage majeur de cette technique est que des milliers de protéines peuvent être identifiées dans une seule analyse et la technique convient mieux pour des protéines membranaires. Dans l&#39;approche du bas vers le haut, le mélange de protéines est séparé, généralement par une ou-électrophorèse bidimensionnelle, et les bandes de protéines individuelles ou des taches coupé et digéré avec une enzyme telle que la trypsine, ce qui entraîne habituellement en plusieurs peptides. Cependant, une autre plus récentement développé approche électrophorétique, utilisé en protéomique bottom-up, est GELFrEE. Cette technique fractionne les échantillons de protéines en phase liquide et les rend moins complexe avant l&#39;analyse. Cette technique est reproductible, offre une récupération élevée en protéines, et de réduire la distribution des protéines abondantes élevés dans les échantillons de protéines complexes 16. Peptides, issus de protéines séparées, sont analysés par MS, en utilisant peptide empreinte de masse tandem ou MS (MS / MS), pour créer des étiquettes de séquence pour la base de données de recherche 17-19. Certains des principaux avantages de l&#39;utilisation de l&#39;approche bottom-up sont la capacité d&#39;obtenir des séparations à haute résolution et une couverture complète de la protéine. protéomique bottom-up est la technique la plus largement utilisée en protéomique 20, donc, plusieurs outils bioinformatiques sont disponibles. En outre, les protéines peuvent être séparées dans un mélange complexe avant la digestion, il n&#39;y a donc plus de chances d&#39;identification. L&#39;un des principaux défisen utilisant l&#39;oreille interne pour l&#39;analyse protéomique est sa petite taille, l&#39;accessibilité restreinte, et le type de cellule diversité 21. En outre, les protéines clés qui permettent de distinguer un fonctionnement, tels que les canaux ioniques, les transporteurs et les récepteurs, sont des protéines membranaires, qui peuvent être difficiles à isoler 22. Ainsi, la préparation de l&#39;échantillon filtre assistée (FASP) est avantageux pour les analyses protéomiques de tissus qui sont limités pour l&#39;extraction de protéines et qui nécessitent des détergents pour solubiliser les membranes 23. Ce filtrage permet l&#39;analyse de membrane et des protéines solubles MS et pour la capacité à isoler des peptides à partir de contaminants de faible poids moléculaire 23,24. Le présent protocole décrit des approches de protéomique couramment utilisés qui sont combinés et modifiés pour analyser les protéines solubles et membranaires et pour maximiser le nombre d&#39;ID de protéine à partir de l&#39;épithélium sensoriel cochléaire. Nous allons décrire en utilisant la protéomique de fusil de chasse avec FASP multi-digérerions, la chromatographie d&#39;échange d&#39;ions, SM à haute résolution, et l&#39;analyse des données. En outre, nous allons décrire la protéomique bottom-up avec GELFrEE, FASP multi-digestion, SM à haute résolution, et l&#39;analyse des données.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

La protéomique est une approche couramment utilisé qui peut fournir des informations dans les systèmes biologiques complexes. L&#39;épithélium sensoriel cochléaire qui contient des récepteurs transduisent l&#39;énergie mécanique de l&#39;énergie sonore dans un électro-chimique traitées par les systèmes nerveux périphérique et central. Plusieurs techniques de protéomique ont été développés pour étudier l&#39;oreille interne cochléaire, tels que l&#39;électrophorèse bidimensionnelle sur gel de différence (2D-DIGE), des puces à anticorps, et la spectrométrie de masse (MS). MS est l&#39;outil le plus complet et polyvalent en protéomique et en conjonction avec les méthodes de séparation peut fournir un protéome en profondeur des échantillons biologiques. méthodes de séparation combinés avec MS a la capacité d&#39;enrichir les échantillons de protéines, de détecter de bas poids moléculaire et de protéines hydrophobes, et identifier des protéines de faible abondance par la réduction de la plage dynamique du protéome. Différentes stratégies de digestion peuvent être appliqués à tout ou lysat à fractionnée lysat protéique pour améliorer le peptide et la protéineune couverture de séquence. L&#39;utilisation de différentes techniques de séparation, y compris l&#39;échange de cations fort (SCX), en phase inverse (RP), et le liquide électrophorèse fraction de piégeage de gel-élué (GELFrEE) peut être appliquée pour réduire la complexité de l&#39;échantillon avant l&#39;analyse MS pour l&#39;identification des protéines.

Pour obtenir le protéome la plus complète de l&#39;épithélium sensoriel cochléaire, la dissection des tissus rapide est nécessaire avant l&#39;extraction de la protéine et la préparation des échantillons. Deux techniques protéomiques peuvent être utilisés, fusil de chasse et de bas en haut de la protéomique. Pour préparer des échantillons pour la protéomique de fusil de chasse, FASP procédure de digestion a été utilisé comme l&#39;illustre la figure 1. La méthode de FASP permet de c...

Watch this Scientific Journal Video about Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome at JoVE.com

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

l&#39;analyse de protéome de l&#39;épithélium sensoriel cochléaire peut être difficile en raison de sa petite taille et parce que les protéines membranaires sont difficiles à isoler et à identifier. Les deux protéines membranaires et solubles peuvent être identifiés par la combinaison de plusieurs méthodes de préparation et les techniques de séparation avec haute résolution spectrométrie de masse.

Bottom-up et de fusil de chasse protéomique pour identifier une complète Cochlear protéome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

bottom-up-shotgun-proteomics-to-identify-comprehensive-cochlear

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K vues.  University of South Florida.  l'analyse de protéome de l'épithélium sensoriel cochléaire peut être difficile en raison de sa petite taille et parce que les protéines membranaires sont difficiles à isoler et à identifier. Les deux protéines membranaires et solubles peuvent être identifiés par la combinaison de plusieurs méthodes de préparation et les techniques de séparation avec haute résolution spectrométrie de masse. 

Vidéo: Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Recherche

Biologie

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

Protéomique pour identifier les protéines interagissant avec P2X2 canaux cationiques ligand-dépendants

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - Une méthode pour identifier transcriptome à l&#39;échelle des sites de liaison des protéines liant l&#39;ARN

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

La quantification des protéines à l&#39;aide d&#39;enrichissement d&#39;immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Protein Purification Orthogonal Animé par une étiquette d&#39;affinité bispécifiques petits

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Production d&#39;<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Œuf Extraits pour identifier les ARN associée aux microtubules

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly using MALDI (matrix&#160;assisted laser desorption/ionization)-based analytical techniques. New matrices for small-molecule MSI, which can improve the analysis of low-molecular weight (MW) compounds, are needed. These matrices should provide increased analyte signals while decreasing MALDI background signals. In addition, the use of ultrahigh-resolution instruments, such as Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometers, has&#160;the ability to resolve analyte signals from matrix signals, and this can partially overcome many problems associated with the background originating from the MALDI matrix. The reduction in the intensities of the metastable matrix clusters by FTICR MS can also help to overcome some of the interferences associated with matrix peaks on other instruments. High-resolution instruments such as the FTICR mass spectrometers are advantageous as they can produce distribution patterns of many compounds simultaneously while still providing confidence in chemical identifications. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging. In this work, a protocol for the use of DT for MALDI imaging of endogenous lipids from the surfaces of mammalian tissue sections, by positive-ion MALDI-MS, on an ultrahigh-resolution hybrid quadrupole FTICR instrument has been provided.

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging of small molecules; protocols for the use of DT for the MALDI imaging of endogenous lipids on the surface of tissue sections&#160;by positive-ion MALDI-MS on an ultrahigh-resolution quadrupole-FTICR instrument are provided here.

Dithranol en tant que matrice pour Matrix Assisted Laser Désorption / Ionisation imagerie sur une transformée de Fourier Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.