Des mesures quantitatives précises des protéines sont cruciales pour comprendre la coopération dynamique et spatiale entre les protéines afin de comprendre la maladie jusqu’à la biologie. L’objectif global de cette expérience est de fournir un flux de travail protéomique quantitative intégré pour les échantillons de tissus, combinant un profilage protéique sans étiquette et basé sur une étiquette pour la découverte de biomarqueurs. Dans cette étude, nous avons utilisé l’instrument Orbitrap Fusion pour quantifier les protéines en utilisant des approches basées sur l’étiquette et sans étiquette.
La lyse tissulaire est l’une des étapes les plus cruciales pour le succès d’une expérience LC-MS-MS. Prendre 30 mg de tissu dans un tube de battement de perles. Après le lavage avec le PBS, ajouter 300 microlitres de tampon de lyse de l’urée contenant huit molaires d’urée, Tris, NaCl et MgCl2.
À l’aide d’un sondeur, lyser le contenu du tissu. Répétez cette opération pour un autre cycle. Si vous observez un tissu intact au fond du tube, ajoutez des billes de zirconium au tube et homogénéisez le tissu à l’aide d’un batteur de perles pendant 90 secondes, avec cinq minutes d’incubation sur glace.
Centrifugez les échantillons autour de 6000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour séparer les débris cellulaires du surnageant. Recueillir le surnageant dans un tube frais et mélanger la solution uniformément. Quantifier la concentration de protéines dans le lysate tissulaire à l’aide du réactif de Bradford.
Pour cela, mesurez la DO de l’échantillon à 595 nanomètres et extrapolez-la à l’aide d’un graphique standard comme indiqué sur cet écran. Après la quantification des protéines, faire couler 10 microgrammes de lysate tissulaire sur du gel SDS-PAGE à 12% pour vérifier la qualité des lysates. La première étape de la digestion en solution implique la réduction des liaisons disulfures, à l’aide de TCEP.
Après l’ajout de TCEP, incuber le contenu du tube pendant une heure à 37 degrés Celsius. L’étape suivante consiste en une alkylation pour empêcher les liaisons disulfures réduites de se reformer. Ajouter un agent alkylant comme l’iodoacétamide et incuber le tube dans l’obscurité pendant 10 minutes.
Après incubation, abaisser la concentration finale d’urée à moins d’une molaire en diluant avec quatre à huit volumes de tampon de dilution. À ce stade, il est conseillé de vérifier le pH. L’étape suivante consiste à ajouter de la trypsine au tube et à incuber le tube pendant la nuit pour une digestion efficace.
Le lendemain, séchez les peptides digérés dans un concentrateur sous vide et procédez à l’étape de dessalage. Pour effectuer le dessalement des peptides, utilisez des embouts de stade C18. Activez la pointe de l’étage C18 en ajoutant 50 microlitres de méthanol, centrifugez la pointe à 1000 G pendant deux minutes.
Maintenant, ajoutez 50 microlitres d’acétonitrile dans 0,1% d’acide formique pour laver la pointe de la scène, et encore une fois, centrifugez la pointe. Reconstituer les peptides digérés séchés dans 50 microlitres d’acide formique à 0,1%. Ajouter les peptides reconstitués dans la pointe de l’étape activée.
Répétez cette étape au moins quatre fois. Pour laver l’échantillon, ajoutez 50 microlitres d’acide formique à 0,1 % et répétez l’étape de centrifugation. Pour l’élution des peptides, ajoutez 50 microlitres d’ACN à 40% dans de l’acide formique à 0,1% et passez-le à travers la pointe de l’étape par centrifugation.
Répétez cette étape avec 50% et 60% d’ACN dans 0,1% d’acide formique et collectez le filtrat dans un tube frais. Sécher les peptides dessalés à l’aide d’un concentrateur à vide. Avant l’exécution de LC-MS-MS, quantifiez les peptides à l’aide de la méthode Scopes.
Pour cela, chargez deux microlitres d’échantillon reconstitué dans le puits d’une plaque de microgouttes, et mesurez l’absorbance à 205 nanomètres et 280 nanomètres. Calculez la concentration à partir de la formule décrite sur cette diapositive. Une fois les peptides dessalés séchés, ils sont prêts pour la quantification basée sur l’étiquette.
Pour le étiquetage iTRAQ, les peptides séchés doivent être reconstitués dans 20 microlitres de tampon de dissolution, fournis dans le kit de étiquetage iTRAQ. Reconstituer les étiquettes en ajoutant de l’éthanol à partir du flacon fourni dans la trousse et bien mélanger. Il est conseillé que toutes les étapes soient effectuées conformément aux instructions du fabricant.
Ajouter les étiquettes iTRAQ mélangées de manière homogène à leurs tubes respectifs et permettre la réaction d’étiquetage. À la fin de la réaction, éteindre tout excès d’étiquette non liée dans le tube en ajoutant de l’eau de qualité MS et incuber pendant une demi-heure à une heure. Maintenant, transférez tout le contenu étiqueté dans un seul tube et séchez les peptides marqués.
Après avoir reconstitué les échantillons en acide formique à 0,1%, ouvrez l’échantillonneur automatique de NanoLC et placez les échantillons à l’intérieur de l’échantillonneur automatique. Une fois que les échantillons ont été placés dans l’échantillonneur automatique, il est important de définir les bons paramètres pour la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse. Ici, nous décrivons les paramètres de la quantification sans étiquette et de la quantification basée sur iTRAQ à l’aide de LC-MS.
En cas de quantification sans étiquette, un gradient de 120 minutes a été utilisé lorsqu’un seul échantillon non fractionné est injecté. Cette durée peut être augmentée ou diminuée en fonction de la complexité de l’échantillon. Dans cette expérience, un débit de 300 nanolitres par minute a été défini avec le gradient suivant pour la solution B, qui est de 80% d’acétonitrile dans 1% d’acide formique, dans ce cas.
De la même manière, nous pouvons définir un gradient pour une expérience iTRAQ. Comme les échantillons ne sont pas fractionnelés, un gradient de 90 minutes a été utilisé. Les paramètres MS pour la quantification sans étiquette, ainsi que la quantification basée sur l’étiquette iTRAQ, peuvent être consultés ici.
La première étape consiste à définir le mode d’application en cliquant sur les paramètres globaux. Sélectionnez le mode peptidique et définissez la durée de la méthode en fonction du gradient LC utilisé. Définissez les paramètres d’analyse de l’expérience.
En cliquant sur l’option MS-OT, les paramètres deviennent visibles. Le type de détecteur utilisé est défini sur Orbitrap. L’autre option disponible sur cet instrument comprend un piège à ions.
La résolution a été fixée à 60 000, et on peut choisir entre différentes options disponibles, en fonction du besoin et du type d’expérience. La plage de masse est normale et la plage de balayage est définie de 375 à 1700. Les autres paramètres sont par défaut pour MS Application.
Le seuil d’intensité a été défini et l’état de charge défini entre deux et six. L’exclusion dynamique a été réglée sur 40 secondes et la tolérance de masse a été maintenue à 10. L’ensemble de paramètres suivant inclut les paramètres MS-MS.
Le mode d’isolement a été sélectionné avec quadrupôle, la fenêtre d’isolement réglée à deux, le décalage d’isolement a été désactivé et le type d’activation est généralement HCD pour l’expérience de protéomique. L’énergie de collision peut être soit fixe, soit assistée. Les échantillons étiquetés nécessitent des énergies de collision plus élevées, par conséquent, pour les expériences iTRAQ, il est conseillé que l’énergie de collision soit réglée sur 35, tandis que pour les expériences LFQ, elle peut être réglée sur 30.
Le type de détecteur utilisé ici est Orbitrap. Le mode de plage de balayage sera automatique. Les autres paramètres sont par défaut pour les expériences iTRAQ et les expériences quantitatives sans étiquette.
En cliquant sur le résumé, vous obtiendrez un aperçu de tous les paramètres LC et MS utilisés pour l’expérience. Vous pouvez jeter un coup d’œil sur chaque paramètre et faire la relecture. Une fois cela fait, cliquez sur le fichier et enregistrez-le en tant que fichier de méthode.
Une fois que vous avez enregistré, vous pouvez exécuter la méthode et vous obtiendrez les fichiers bruts. Et puis ces fichiers bruts peuvent être analysés à l’aide du logiciel Proteome Discoverer. Cette figure montre la couverture séquentielle de BSA dans trois réplications techniques, qui est de 91% dans les trois réplications.
Cela indique la reproductibilité de l’instrument. Maintenant, cette figure montre l’uniformité du nombre de correspondances spectrales peptidiques, de peptides et de protéines identifiées dans trois échantillons biologiques différents, ce qui, encore une fois, donne une idée de la reproductibilité de l’instrument. Ici, le diagramme de Venn représente les protéines communes et exclusives identifiées dans trois échantillons différents dans une expérience sans étiquette et une expérience basée sur une étiquette.
Ces graphiques à barres montrent le nombre de correspondances spectrales peptidiques, de groupes peptidiques, de protéines totales, de groupes protéiques et d’nombre de protéines après 1% FDR, identifiés dans l’expérience LFQ et iTRAQ. La protéomique tissulaire des échantillons biologiques nous permet d’explorer de nouveaux biomarqueurs potentiels associés à différents stades de progression de la maladie. Le protocole décrit pour l’analyse protéomique quantitative des tissus fournit de bonnes données de couverture reproductibles.
L’utilisation de répliques techniques garantit une bonne reproductibilité, même si les échantillons sont exécutés à des moments différents. Ici, nous avons montré l’analyse d’échantillons de tissus en utilisant deux méthodes de quantification: la protéomique sans étiquette et la protéomique basée sur l’étiquette. Le choix des techniques protéomiques quantitatives peut dépendre du nombre d’échantillons, de la disponibilité des plateformes de SEP et de la question biologique à traiter.
