Ce travail a été soutenu par le Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology, iBio, Inc. et l&#39;Agence pour les projets de recherche avancée de défense (subvention # HDTRA1-07-C-0054). Les auteurs remercient les généreux dons par les Drs. Stanton Gelvin de sciences biologiques Département, l&#39;Université de Purdue (Agrobacterium tumefaciens souches) et Wayne Fitzmaurice de biologie à grande échelle Corp (N. graines de excelsiana), ainsi que Jennifer Nicholson US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. graines excelsior ). Les auteurs remercient Margaret Shillingford et Christopher Hull pour fournir plantes et une excellente assistance technique. Les auteurs remercient également les Drs. Stephen Streatfield et Natasha Kushnir pour aide à la rédaction.

1. Culture des plantes Pour agroinfiltration suite, nous avons évalué deux espèces de Nicotiana de type sauvage (N. benthamiana et N. excelsior) et un hybrides (N. excelsiana) cultivées en hydroponie sur laine de roche dans les installations intérieures. <ol><li> Faire tremper les dalles de laine de roche dans une solution d&#39;engrais de l&#39;usine. </li><li> Semez les graines de type sauvage N. benthamiana, N. excelsior et N. excelsiana (hybride de N. benthamiana × N. excelsior) sur les éléments nutritifs trempé surface de la laine de roche. </li><li> Faire pousser des plantes à partir de graines dans des conditions contrôlées (24 ° C et 40-65% d&#39;humidité relative) et une photopériode de jours longs (14 heures de lumière et 10 h foncé, avec un éclairage de 130-150 uE m -2 s -1) pour 4-5 semaines pour N. benthamiana et N. excelsiana, et 5-6 semaines pour N. excelsior. </li></ol> 2. Construction de vecteurs pour Agroinfiltration <ol><li> Insérer un gène rapporteur synthétique (protéine verte fluorescente [GFP]), sur toute la longueur d&#39;hémagglutinine (HA) de la souche A/California/04/2009 de virus de la grippe (HAC1), et reconfiguré lichenase enzyme (LicKM) 18 séparément dans le vecteur de lancement pBID4 18 (vecteur à base de TMV) pour obtenir pBID4-GFP, pBID4-HAC1 et pBID4-LicKM, respectivement 18,32,41,47. </li><li> Présentez 10-50 ng de pBID4 portant GFP ou HAC1 dans des cellules électrocompétentes de A. tumefaciens souche GV3101 et LicKM dans des cellules électrocompétentes de A. tumefaciens souches GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 et A4 avec le électroporateur de MicroPulser de gène. </li><li> Utiliser le agrobactéries transformées pour des expériences d&#39;infiltration, sauf indication contraire. </li></ol> 3. Passez l&#39;aspirateur infiltration d&#39;Agrobacterium dans les plantes de Nicotiana <ol><li> Cultivez A. tumefaciens souches nuit (O / N) en milieu LB, med YEBium ou milieu AB supplémenté avec 50 mg / L de kanamycine à 28 ° C sous agitation à 200-250 rpm. </li><li> Diluer agrobactéries dans de l&#39;eau Milli-Q à une densité optique à 600 nm (A 600) de 0,5 ou centrifuger les cellules d&#39;Agrobacterium développée dans du milieu LB ou YEB ou AB à 4000 × g pendant 10 min à 4 ° C, re-suspend dans le milieu d&#39;induction (1x MS de sel, 10 mM de MES, acétosyringone 200 uM, 2% de saccharose [MMA]) à A 600 de 0,5, et on agite à température ambiante pendant 1 à 3 h, sauf indication contraire. </li><li> Infiltrer les plantes dans une chambre à vide en plongeant des tissus végétaux aériens Nicotiana en suspension d&#39;Agrobacterium et appliquer un vide de 50 à 400 mbar pendant 30 ou 60 secondes. L&#39;infiltration optimale est appliqué systématiquement à 50-100 mbar pendant 60 secondes. </li><li> Une fois que le vide est rompu, enlever les plantes à partir de la chambre à vide, rincer à l&#39;eau, et faire croître pendant 5-7 jours dans les mêmes conditions de croissance utilisées pour la croissance de pré-imprégnation. </li><li> Pour tester l&#39;efficacitédes produits chimiques induisant des gènes vir d&#39;Agrobacterium, des concentrations différentes de l&#39;acétosyringone (0, 100, 200 ou 400 uM) ont été ajoutés à la agrobactéries suspension dans du tampon d&#39;infiltration (MS 1x, 10 mM de MES, 2% de glucose). Par l&#39;effet du monosaccharide sur l&#39;induction de gènes vir, différents pourcentages de glucose (0, 1, 2 ou 4%) ont été ajoutés à agrobactéries en suspension dans le tampon d&#39;infiltration (MS 1x, 10 mM de MES, acétosyringone 200 uM). N. plantes benthamiana ont été infiltrés comme mentionné ci-dessus dans les étapes 3.3 et 3.4). </li><li> laboratoire d&#39;Agrobacterium souches GV3101, C58C1 et LB4404 et les souches de type sauvage A4, AT06, AT10, et At77 hébergeant le vecteur pBID4-LicKM ont été dilués dans de l&#39;eau Milli-Q au 600 de 0,5. N. plantes benthamiana ont été infiltrées par chaque souche particulière, comme mentionné ci-dessus dans les étapes 3.3 et 3.4. </li></ol> 4. Procédure de co-agroinfiltration pour la Silencing suppresseur viral <ol><li> Mix les Milli-Q cultures Agrobacterium GV3101 dilué à l&#39;eau portant le gène de la GFP et le silence virale p19 suppresseur de tomate virus du rabougrissement (TBSV) à 01h01, 02h01, 03h01 et 04h01 ratios. Infiltrez N. plantes benthamiana comme décrit ci-dessus. </li><li> Infiltrez N. plantes benthamiana avec un mélange de deux Agrobacterium GV3101 cultures dilué à l&#39;eau Milli-Q: la première portant le plasmide pBID4-HAC1 et le second portant l&#39;un des suppresseurs de silencing - p19 de TBSV ou p23 du virus de la tristeza, dans le plasmide pCassp ( pCassp19) et dans le plasmide binaire PGR sous le promoteur 35S (PGR-P23), respectivement, au rapport 4:1. </li></ol> 5. Western Blot Analysis <ol><li> Prélever des échantillons de feuilles aléatoires de N. benthamiana, N. excelsior ou N. plantes excelsiana à 4-7 dpi et pulvériser dans l&#39;azote liquide à une poudre fine. </li><li> Ajouter trois volumes de tampon PBS 1x contenant 0,5% de TritonX-100 à chaque échantillon. </li><li> Secouer doucement les échantillons prélevés pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Spin l&#39;extrait de 5 minutes et recueillir protéine soluble totale dans un tube propre Eppendorf. </li><li> Diluer les extraits à une dilution appropriée (1:50 à 1:100) dans du tampon d&#39;extraction PBS 1x, et à 5 x tampon d&#39;échantillon (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% de SDS, 0,5% de bleu de bromophénol, 50% de glycérol v / v, et de 500 mM de DTT) à une concentration finale de 1 x. </li><li> Échantillons Faire bouillir pendant 5 min. </li><li> Protéines séparées par 10% SDS-PAGE, transfert sur membrane Immobilon-P transfert, et de bloquer avec 0,5% de I-bloc. </li><li> Détecter la GFP en utilisant polyclonal de lapin anti-GFP antisérum à 1:5000 et HAC1 en utilisant un anticorps monoclonal anti-poly-histidine souris à 1:1000 dans la solution de blocage pendant 1 h. </li><li> Après marquage de l&#39;anticorps primaire, laver les membranes trois fois pendant 10 minutes chacune avec 1 x PBST-20 et incuber avec une peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à l&#39;anticorps anti-lapin à 1:5000 ou un conjugué HRPanticorps anti-souris de d à 1:10.000 pendant 1 heure, pour la GFP et la détection HAC1, respectivement. </li><li> Traiter des transferts de Western en utilisant le substrat SuperSignal West Pico Chemiluminescent. </li><li> Utiliser le logiciel de GeneTools pour analyser l&#39;intensité de la bande de la protéine et obtenir la bande quantité calibrée. </li></ol> La production de protéines: (calibrée quantité x dilution de l&#39;échantillon) / quantité d&#39;échantillon chargé) x 4 = mg / kg. Equation: Production de protéines (P), la quantité calibrée (C), la dilution de l&#39;échantillon (D) et la quantité de l&#39;échantillon chargé (S). 6. Zymogramme Assay <ol><li> N. collecter pBID4-LicKM infiltré benthamiana échantillons de tissus aléatoire. </li><li> Extraire les protéines en utilisant les mêmes procédés décrits ci-dessus pour l&#39;analyse Western blot et ensuite analyser par 10% de SDS-PAGE à 0,1% lichénane inclus dans les gels. </li><li> Après électrophorèse, les gels de lavage deux fois pendant 10 min chacune dans un tampon de lavage (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] et 0,1% de Triton X-100), Puis les incuber dans du tampon de lavage à 65 ° C pendant 1 heure. </li><li> Après incubation, éliminer le tampon de lavage et colorer les gels avec 0,5% de rouge Congo pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Rincer les gels dans l&#39;eau Milli-Q trois fois pendant 10 minutes à chaque fois, et ajouter 1 M de NaCl à visualiser l&#39;activité lichénase. La protéine de lichenase bactérienne purifiée a été utilisée comme contrôle positif pour l&#39;activité enzymatique. </li></ol> 7. GFP Imaging <ol><li> Effectuer une détection visuelle de la fluorescence GFP dans les plantes entières transformées de façon transitoire en utilisant une lampe UV à grande longueur d&#39;onde qui s&#39;est tenue à la main. </li><li> Photo transitoire transformé plantes avec un appareil photo numérique à travers un jaune 8, ES 52 filtre (temps d&#39;exposition, 15 sec). </li><li> Obtenir des images de Western blot analyse en utilisant le logiciel GeneSnap sur un GeneGnome et quantifier les résultats en utilisant le logiciel de GeneTools, avec une courbe d&#39;étalonnage basée sur la norme de la GFP purifiée. </li><li> Quantifier la protéine HAC1 en utilisant une courbe d&#39;étalonnage sur la base de la purificationed HAC norme de protéine à partir de la souche A/Indonesia/05/05 de virus de la grippe. </li><li> Calculer les valeurs moyennes de 3 à 4 répétitions pour toutes les expériences. </li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Dans cette étude, nous avons mis au point un protocole de agroinfiltration simple routine production de protéines transitoire en espèces Nicotiana sélectionnés à l&#39;aide des souches d&#39;Agrobacterium portant le vecteur de lancement. En outre, nous avons identifié les conditions optimales pour obtenir le niveau de production plus élevé de protéines recombinantes dans le système d&#39;expression de plante transitoire. Vide infiltration de A. tumefaciens GV3101 dilué héberger les pBID4 vecteur de lancement en N. benthamiana, N. excelsiana et N. excelsior donné lieu à des niveaux plus élevés de production de protéine cible dans les 7 dpi rapport à d&#39;autres espèces végétales, comme Pisum sativum infiltré avec GV3101 hébergement Alfalfa mosaic virus - ou Cucumber mosaic vecteurs à base de virus exprimant le gène rapporteur GFP sous le promoteur 35S 41, ou Lactuca sativa, Solanum siconpersicum et Arabidopsis thaliana infiltré avec la souche de A. C58C1 tumefaciens portant le gène rapporteur de la bêta-glucuronidase 57. N. benthamiana et N. excelsiana était facile de passer l&#39;aspirateur s&#39;infiltrer à 50 mbar pour 30-60 sec, avec 90-95% d&#39;efficacité de l&#39;infiltration. Le reste 5 à 10% de la surface foliaire n&#39;a pas été infiltré à cause de certaines feuilles de flottement sur ​​la surface de la suspension d&#39;Agrobacterium pendant l&#39;application du vide. Étant donné que le vecteur de lancement a la capacité de cellule à cellule mouvement 18, l&#39;accumulation de la protéine transitoire se produit en feuilles entières ainsi que des pétioles à 7 dpi. À 10 dpi, la production de GFP estimée était légèrement plus faible parce que le vecteur d&#39;expression pBID4 est capable de se déplacer de cellule à cellule, mais pas de se déplacer de manière systémique 18; Par conséquent, les feuilles nouvellement cultivées ne contiennent pas le vecteur et ne contribuent pas à la production de cible. En outre, la dégradation de la protéine recombinante dans le temps may contribuer à la teneur en protéines réduite à 10 dpi. Nos résultats ont montré que l&#39;infiltration de l&#39;A. niveaux élevés tumefaciens souche GV3101 médiation de la production de protéine transitoire dans N. benthamiana. En outre, la protéine cible peut être conçue sous forme de fusions N-terminales, C-terminales ou internes de lichénase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, qui est une enzyme thermostable à partir de Clostridium thermocellum et confère une stabilité thermique à un grand nombre cible protéine de fusion 18. Infiltration de N. benthamiana avec A. tumefaciens souches de type sauvage (AT6, AT10 et at77) hébergeant le gène d&#39;intérêt suscité symptômes bénins ou graves: curling de feuille, pétiole allongement, et le curling. Pas de symptômes pathologiques ont été observés dans N. benthamiana infiltrée par la souche de laboratoire GV3101 hébergeant vide pBID4 vecteur, tandis que certains gènes insérés dans pBID4 et transformés en laboratoire des souches GV3101, C58C1 ou LBA4404 suscité des réponses nécrotiques doux et feuilleschlorose / jaunissement des symptômes dans les régions infiltrées de feuilles. Symptômes nécrotiques causées par type sauvage Agrobacterium ou souches désarmés dans solanacées ont été signalés auparavant 56,57. La réponse nécrotique peut résulter de facteurs de virulence du système de sécrétion de type III, les protéines bactériennes transférées à la cellule végétale par le système de sécrétion de type IV, et / ou de la sensibilité à la flagelline de 58 à 60. Nous avons trouvé que la production transitoire de protéines hétérologues peut également susciter la pathogénicité et une réaction d&#39;hypersensibilité à l&#39;usine infiltré feuilles. De nombreux chercheurs ont rapporté que agroinfiltration d&#39;espèces végétales différentes avec des vecteurs binaires de plantes produites jusqu&#39;à 5-20 fois plus hauts niveaux de production de protéine transitoire par rapport à des plantes transformées de façon stable avec 28,57. Nos données montrent que N. benthamiana infiltré avec GV3101 hébergeant pBID4-GFP exprimées de manière transitoire un niveau élevé de GFP, qui est similaire à la production de GFP consigné pourN. benthamiana infiltrée avec des agrobactéries portant le vecteur viral PICH-GFPSYS (jusqu&#39;à 80% des protéines solubles totales) 44. Agroinfiltration utilisant notre vecteur de lancement a donné lieu à une forte production de la protéine thermostable de LicKM, 50 fois supérieure à celle observée en utilisant un plasmide binaire standard 18. Afin de tester l&#39;infectivité de A. tumefaciens et la stabilité du vecteur de lancement, nous infiltré un plat de N. benthamiana toutes les heures pendant jusqu&#39;à 8 heures en utilisant la même culture diluée dans de l&#39;eau Milli-Q de GV3101 hébergeant le plasmide pBID4-GFP. Nos données ont montré que la souche GV3101 est efficace infectieux pendant au moins 8 heures et pBID4 (le vecteur de lancement) est très stable au cours de l&#39;heure-longue infiltration 8. Stock de glycérol de souche GV3101 hébergeant le vecteur de lancement pBID4-HAC1 (banque de cellules) stockés à -80 ° C a été montré pour être très stable pendant trois ans sans changements dans prote transitoirede la production dans les usines infiltrés. plantes de N. benthamiana cultivés dans des conditions optimales et entre 35 et 42 jours après le semis étaient optimales pour le vide expression transitoire de gènes infiltration médiation 40. Plantes jeunes (âgés de 3-4 semaines) ne peuvent pas être infiltrés entièrement à cause de feuilles flottant à la surface de cellules en suspension et des dommages aux tissus des effets mécaniques de l&#39;application d&#39;un vide. Dans les installations de plus de 45 jours, N. benthamiana étape boulonnage, dans les conditions optimales de lumière utilisés, le niveau d&#39;expression transitoire est faible. Moléculaires des composés de faible poids phénoliques (acétosyringone) et monosaccharaides (glucose) sont connus pour induire gènes vir dans A. tumefaciens 55,61. En outre, l&#39;infiltration de N. benthamiana avec le vecteur binaire pCAMBIA (gfp), en présence d&#39;acétosyringone à des concentrations de 50 à 600 pM a montré une légère augmentation transitoirel&#39;expression du gène 40. Nous avons étudié l&#39;effet de différentes concentrations de glucose et acétosyringone dans notre système par l&#39;ajout de ces composés aux cultures GV3101 hébergeant pBID4-GFP dans le MMA pendant 3 heures, et n&#39;avons trouvé aucune différence dans l&#39;expression de la GFP. Fait intéressant, les cultures GV3101 hébergeant pBID4-GFP et dilué dans de l&#39;eau Milli-Q à un A 600 de 0,5 et infiltrés sans l&#39;induction du gène vir ont exprimé les mêmes quantités de GFP que ceux infiltrés avec des cultures induites. A. gène vir tumefaciens (s) pourrait être induite par des composés phénoliques de plantes (acétosyringone et de l&#39;acide sinapinique) et monosaccharaides végétales (glucose et fructose) présents dans le tissu foliaire. Par conséquent, nous supposons que des niveaux similaires d&#39;expression de GFP en présence ou en l&#39;absence de exogènes inducteurs de gènes vir peut être le résultat de l&#39;effet de cytoplasmiques inducteurs de gènes vir présents lors de la réplication du vecteur de lancement exprimant la GFP dans des cellules végétales. N. benthamiana a été utilisée comme hôte pour la production du modèle de protéine transitoire 49. Toutefois, le rendement relativement faible de la biomasse de N. benthamiana entrave son application pour la production à grande échelle de protéines recombinantes. L&#39;hôte optimale doit combiner un haut niveau d&#39;expression transitoire, la croissance facile dans une serre, et être sensibles à Agrobacterium infiltration 2. Pour sélectionner un autre hôte, nous infiltré deux espèces de Nicotiana (N. de benthamiana et N. excelsior) de type sauvage différents et un N. hybride excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) avec le A. tumefaciens souche GV3101 hébergeant le plasmide pBID4-GFP. Parmi ces trois espèces, le niveau d&#39;expression de la GFP a été légèrement supérieure à N. benthamiana. N. plantes excelsior ont montré la difficulté à agroinfiltration à vide en raison de leurs feuilles coriaces, et N. excelsianaproduit environ deux fois plus de biomasse dans les mêmes conditions de croissance. La production transitoire de la GFP à 7 dpi est relativement similaire à N. benthamiana et N. excelsiana. Par conséquent, N. excelsiana peut y avoir une multitude de plus adapté pour la production de protéine recombinante. transitoire production de protéine à médiation par Agrobacterium est limitée par PTGS 26, qui peut être surmontée par la co-expression de le gene silencing suppresseurs d&#39;origine du virus de la plante 62. La production de protéine transitoire a été précédemment montré pour être améliorée de 50 fois en présence de la protéine p19 de TBSV, qui inhibe la PTGS dans les tissus infiltrés 34. Dans notre étude, nous avons évalué l&#39;effet de deux suppresseurs de silencing virales (p19 et p23) séparément co-infiltrées avec le vecteur de lancement pBID4-HAC1. Le co-infiltration de ces suppresseurs de silencing semblait avoir peu d&#39;influence sur l&#39;expression transitoire de HAC1, avec seulement une légère augmentation HAC1l&#39;accumulation de la protéine (15-25%) en présence de p23 co-infiltrée ou p19. Pour influer positivement sur ​​la production de protéines, peuvent avoir besoin d&#39;être spécifiquement sélectionnée pour être efficace pour les espèces végétales ciblées et vecteur viral 63 suppresseurs de silencing. TMV hélicase a un suppresseur de l&#39;activité RNA silencing 64,65. Nos données confirment cette observation en tant que co-infiltration de p23 ou p19 avec pBID4-HAC1 entraîné aucune augmentation de la GFP ou une légère augmentation de la production de protéines transitoire de HAC1. En conclusion, nous avons modifié et optimisé plante et des conditions de croissance d&#39;Agrobacterium et l&#39;amélioration de l&#39;efficacité de l&#39;infiltration sous vide. Cette technologie nous a permis de croître et de s&#39;infiltrer dans des centaines de kilogrammes de matière végétale en quelques heures. Nous avons automatisé avec succès la technique d&#39;expression transitoire de l&#39;usine de production de vaccins à haut débit à l&#39;échelle industrielle dans les bonnes pratiques de fabrication (cGMP) Acceptables. Pour plus d&#39;informations about automatisation et l&#39;utilisation du système d&#39;installation transitoire de protéines de production pour la production de protéines recombinantes, y compris les candidats vaccins sous-unitaires, dans des conditions cGMP, le lecteur se reportera au site Web <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Les plantes sont maintenant reconnus comme une plate-forme sûre, fiable, évolutive et économique pour la production de produits biopharmaceutiques recombinants hétérologues et des protéines industrielles 1-3 et ont des avantages importants par rapport aux systèmes d&#39;expression de cellules microbiennes et animales 4. Les plantes sont capables d&#39;exprimer des protéines correctement repliées avec des modifications post-traductionnelles, notamment des anticorps multimères assemblés 5-7. Plusieurs protéines recombinantes pharmaceutiques d&#39;origine végétale sont en cours d&#39;évaluation clinique 8. Cela comprend des vaccins spécifiques au patient recombinants idiotype (scFv) pour le traitement du lymphome non hodgkinien 9, pandémie base hémagglutinine et saisonniers candidats vaccins contre la grippe 10,11 (Cummings et al., Soumis à des vaccins), anti-Streptococcus antigène de surface je / anticorps II pour le traitement de la carie dentaire 12, et de l&#39;insuline humaine pour le traitement du diabète 13. En outre, reco humaineglucocérébrosidase mbinant pour la thérapie de remplacement enzymatique chez les patients atteints de la maladie de Gaucher a été approuvé en Israël et aux États-Unis et il est prévu dans le cadre du programme d&#39;accès élargi à l&#39;extérieur des États-Unis 14,15. Des protéines hétérologues peuvent être produites dans transformée de manière stable (ou transplastomique transgénique) ou des plantes transformées de façon transitoire. La production de protéine transitoire offre plusieurs avantages par rapport à la production dans les plantes transgéniques, y compris le court laps de temps pour obtenir l&#39;expression et l&#39;accumulation 16, et peut être réalisé en introduisant des vecteurs binaires bactérienne ou végétale recombinante vecteurs viraux dans les tissus végétaux 4. Le système d&#39;expression transitoire la plus avancée est basée sur l&#39;utilisation de «vecteurs de lancement» qui associent des composants de virus de plantes et des plasmides binaires, et sont livrées par agro-infiltration 17,18. Agroinfiltration d&#39;un vecteur de lancement sur ​​la base de virus de la mosaïque du tabac (TMV) a été appliquée avec succès au laboratoirel&#39;échelle pour produire des antigènes de vaccins contre des pathogènes tels que le virus du papillome humain 19, 20 Yersinia pestis, virus influenza A 21,22, Bacillus anthracis 23, et le virus de la variole dans 24 N. benthamiana feuilles. expression transitoire à médiation par Agrobacterium est également un procédé prometteur pour la production simultanée de multiples protéines 2,25-27. Par exemple, les systèmes d&#39;expression transitoire de plantes ont été utilisées pour produire des anticorps spécifiques de la tumeur recombinants 28,29, un anticorps recombinant dirigé contre le récepteur glycosylé epidermal growth factor 30, et un anticorps monoclonal spécifique de l&#39;antigène protecteur 31,32 anthrax. Co-infiltration de plants de Nicotiana benthamiana avec un gène cible et un suppresseur de résultats d&#39;inactivation de gène dans une expression accrue de la protéine cible 33,34. Agroinfiltration est une méthode courante pour introdu uniformémentCing bactéries hébergeant un gène d&#39;intérêt dans des tissus végétaux 35-37. Vide infiltration d&#39;Agrobacterium pour l&#39;expression transitoire de gènes dans plante intacte feuilles est une méthode rapide, évolutive et utile pour la production de protéines étrangères sans la nécessité de produire des plantes transgéniques 38-41. Pendant agroinfiltration à vide, les plantes sont retournées à l&#39;envers et les parties aériennes immergés dans Agrobacterium suspension. Ensuite, on applique le vide causant des gaz à évacuer des espaces intercellulaires feuille par les stomates. Rapid libération re-pressurisation suivante des résultats de vide dans l&#39;infusion de la suspension d&#39;Agrobacterium dans la feuille. À la suite de l&#39;infiltration sous vide d&#39;agrobactéries, les plantes sont en outre cultivées et l&#39;expression de la cible est surveillée. Les plus hauts niveaux d&#39;expression de cible sont généralement observées 2-3 jours après l&#39;infiltration (dpi) avec un vecteur binaire et 4-7 dpi avec un vecteur de lancement, après quoi le niveau d&#39;expression généralement dimi17,18,42-45 session. Agrobacterium tumefaciens est le véhicule le plus largement utilisé pour délivrer un gène d&#39;intérêt dans une plante pour la production de protéines. Agroinfiltration fonctionne exceptionnellement bien en N. benthamiana mais relativement peu dans la plupart des autres plantes, y compris Arabidopsis thaliana 46. Dans cette étude, nous avons développé une méthode simple, efficace et économique pour la production de protéines transitoire dans 5-6 semaines, âgé de N. benthamiana en utilisant A. tumefaciens infiltration. L&#39;inconvénient majeur de la mise à l&#39;échelle industrielle de la technique de centrifugation est agro-infiltration de bactéries récoltées et remise en suspension du culot bactérien dans un milieu contenant du 4&#39;-hydroxy-3 &#39;, 5&#39;-diméthoxyacétophénone (acétosyringone), les monosaccharides, et 2 - (N-morpholino) acide éthanesulfonique (MES) en mémoire tampon pour l&#39;induction des gènes vir. Nous avons été en mesure de résoudre ces problèmes par l&#39;optimisation de la Agrobacterium </em&gt; croissance dans du milieu AB (milieu minimal) suivie directement par dilution dans de l&#39;eau Milli-Q et par le contrôle de la durée et des conditions d&#39;infiltration. Nous avons également comparé la production de protéine cible dans l&#39;N. type sauvage espèce tabac hôte benthamiana et N. laine de bois, ainsi que dans hybride N. excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

transitoire production de protéine à médiation par Agrobacterium dans des plantes est une approche prometteuse pour produire des antigènes de vaccins et de protéines thérapeutiques au sein d&#39;une courte période de temps. Cependant, cette technologie ne fait que commencer à être appliquée à la production à grande échelle comme de nombreux obstacles technologiques à grande échelle sont maintenant surmonter. Ici, nous démontrons une méthode simple et reproductible pour la production de protéines transitoire à l&#39;échelle industrielle basée sur l&#39;infiltration sous vide de plantes Nicotiana avec Agrobacteria vecteurs porteurs de lancement. Optimisation de la culture d&#39;Agrobacterium en milieu AB permet dilution directe de la culture bactérienne dans l&#39;eau Milli-Q, ce qui simplifie le processus d&#39;infiltration. Parmi les trois espèces testées de Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) a été choisi comme l&#39;hôte le plus prometteur en raison de la facilité d&#39;infiltration, de haut niveau de la production de protéine rapporteur, et environ deux-fancienne production de biomasse supérieure dans des conditions environnementales contrôlées. L&#39;induction d&#39;Agrobacterium hébergeant pBID4-GFP (virus de la mosaïque du tabac à base) en utilisant des produits chimiques tels que l&#39;acétosyringone et monosaccharide n&#39;a eu aucun effet sur ​​le niveau de production de protéines. Infiltrant plante sous 50 à 100 mbar pendant 30 ou 60 secondes a donné lieu à environ 95% de l&#39;infiltration des tissus foliaires de plantes. Infiltration avec la souche de laboratoire d&#39;Agrobacterium GV3101 a montré la production de protéines plus élevé par rapport à des souches de laboratoire agrobactéries LBA4404 et C58C1 et de type sauvage Agrobacteria souches at6, AT10, at77 et A4. La co-expression d&#39;un virus RNA silencing suppresseur, p23 ou p19, dans N. benthamiana a entraîné une accumulation plus tôt et la production accrue (15-25%) de la protéine cible (hémagglutinine du virus de la grippe).

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Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

La production de protéines dans les plantes de Nicotiana transitoire basée sur l&#39;infiltration sous vide avec Agrobacteria transportait des vecteurs de lancement (virus de la mosaïque à base de tabac) est une approche rapide et économique pour produire des antigènes de vaccins et de protéines thérapeutiques. Nous avons simplifié la procédure et amélioré l&#39;accumulation de cible en optimisant les conditions de culture de bactéries, la sélection des espèces hôtes, et co-introduction de RNA silencing suppresseurs.

Optimisation et l&#39;utilisation des<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par la production de protéines transitoire dans<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

optimization-utilization-agrobacterium-mediated-transient-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

41.0K vues.  Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology.  La production de protéines dans les plantes de Nicotiana transitoire basée sur l'infiltration sous vide avec Agrobacteria transportait des vecteurs de lancement (virus de la mosaïque à base de tabac) est une approche rapide et économique pour produire des antigènes de vaccins et de protéines thérapeutiques. Nous avons simplifié la procédure et amélioré l'accumulation de cible en optimisant les conditions de culture ...

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Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

Production de réplication défectueuse Rétrovirus par transfection transitoire de cellules 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Recherche

Biologie

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Un procédé de production de protéine recombinante mCD1d en cellules d&#39;insectes.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

Agroinfiltration et PVX Agroinfection dans la pomme de terre et Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) and Wuschel2 (Wus2). Bbm is regulated by the maize phospholipid transferase gene (Pltp) promoter, and Wus2 is under the control of a maize auxin-inducible (Axig1) promoter. An Agrobacterium strain carrying these morphogenic genes on transfer DNA (T-DNA) and extra copies of Agrobacterium virulence (vir) genes are used to infect maize immature embryo explants. Somatic embryos form on the scutella of infected embryos and can be selected by herbicide resistance and germinated into plants. A heat-activated cre/loxP recombination system built into the DNA construct allows for removal of morphogenic genes from the maize genome during an early stage of the transformation process. Transformation frequencies of approximately 14%, 4%, and 4% (numbers of independent transgenic events per 100 infected embryos) can be achieved for W22, B73, and Mo17, respectively, using this protocol.

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Plant morphogenic genes can be used to improve genetic transformation of recalcitrant genotypes. Described here is an Agrobacterium-mediated genetic transformation (QuickCorn) protocol for three important public maize inbred lines.

Agrobacterium-Transformation d’embryon immature médié des lignées consanguines de maïs récalcitrants utilisant des gènes morphogènes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

Agrobacterium-Transformation génétique médiée, production transgénique et application pour l’étude du développement de la reproduction masculine dans le riz

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Production de protéines de fusion IgG exprimées transitoirement à Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...