Les jeunes inflorescences en tant qu’explant pour la production de callus sont importantes pour établir une transformation génétique rapide et efficace et une méthode de régénération pour révéler la fonction génétique ainsi que pour l’amélioration des cultures. Les jeunes inflorescences en tant qu’explant pour la production de callus sont importantes pour établir une transformation génétique rapide et efficace et la méthode de régénération pour révéler la fonction génétique. La démonstration vidéo de cette technique aidera le spectateur à comprendre le processus d’entretien des matériaux pour produire l’alignement transgénique désiré sans perdre de temps et d’efforts.
Commencez par recueillir de jeunes inflorescences de riz dans la rizière ou une serre à l’étape de la méiose, en vous assurant qu’ils sont recouverts de la gaine des feuilles. Essuyer chaque inflorescence avec un écouvillon à 70% d’alcool et laisser sécher avant de couper. Apportez l’inflorescence sur un banc de laboratoire stérile et coupez-la en petits morceaux avec des ciseaux stérilisés, puis transférez les boutures sur une plaque Petri contenant du milieu NBD2.
Incuber la plaque dans l’obscurité à 26 degrés Celsius pendant 10 à 14 jours pour induire le callus. Pour effectuer la transformation, transférez une seule colonie de la plaque EB blanche avec des antibiotiques sélectifs à cinq millilitres de liquide YEB moyen contenant les mêmes antibiotiques dans un tube à essai stérile conique de 50 millilitres. Secouez le tube sur un shaker orbital à 250 fois g et 25 à 28 degrés Celsius jusqu’à ce que les bactéries se développent à un OD 600 de 0,5.
Ajouter un millilitre de suspension bactérienne à 100 millilitres de milieu YEB avec les mêmes antibiotiques sélectifs dans un flacon conique de 250 millilitres et secouer le flacon sur un shaker orbital à 250 fois g et 28 degrés Celsius pendant quatre heures. Centrifugez la culture à 4000 g pendant 10 minutes à température ambiante pour recueillir les bactéries. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille avec le milieu AAM AS, puis diluez la suspension à un OD 600 de 0,4.
Après l’incubation, recueillir environ 150 calli embryogénique jaune clair sain dans un flacon stérile de 150 millilitres. Ajouter 50 à 75 millilitres de suspension cellulaire bactérienne dans le flacon, puis ajouter 10 à 25 millilitres de milieu AAM AS frais pour immerger le calli pendant 10 à 20 minutes, en secouant de temps en temps. Versez soigneusement la suspension bactérienne hors du flacon et séchez le calli avec du papier filtre stérile, puis placez-les sur une boîte de Pétri avec le milieu NBD AS et recouvrez-les de papier filtre.
Incubez le calli à 25 à 28 degrés Celsius dans l’obscurité pendant trois jours, en vérifiant la surcroissance bactérienne. Après trois jours de co-culture, transférer le calli dans une boîte de Pétri stérile à l’aide de papier filtre, puis les sécher à l’air pendant deux heures sur un banc propre. Assurez-vous que les calli ne sont pas respectés au papier filtre et transférez-les vers le support de sélection primaire NBD2.
Après deux semaines, transférez le calli uniformément dans une nouvelle plaque contenant un milieu de sélection frais, puis déplacez le calli vers un milieu de SP frais pour la différenciation et les bourgeons de la pousse au milieu de la SP avec 10 milligrammes par litre d’hygromycine pour proliférer plus de pousses. Transférer les nouvelles pousses dans la moitié du milieu de la SP pour l’induction des racines et les culture sous la lumière à 25 à 28 degrés Celsius. Les plantes transformées devraient produire des racines dans les deux semaines.
Pour effectuer l’observation de phénotype reproducteur, retirez la palea et la lemme du fleuri et imagez les anthères entières sous un microscope stéréo. Pour observer la viabilité du pollen, cueillez des pointes de riz matures avant l’anthèse florale et retirez la palea et la lemme pour libérer les anthères. Prenez six anthères et placez-les sur une toboggan en verre.
Ajouter une goutte d’eau distillée, écraser l’anthère avec des pinces à épiler pour libérer les grains de pollen, puis ajouter deux à trois gouttes de solution d’iode et couvrir d’un coverslip. Observez la glissade au microscope à faible grossissement. Les grains de pollen colorants en noir montrent une viabilité plus vigoureuse tandis que les grains sans couleur ou ceux de brun jaune colorant sont rabougris ou dégénérés.
Pour effectuer la microscopie transversale de sectionnement, utilisez la solution bleue de toluidine de 0,5% pour tacher les glissières pendant 30 minutes, puis rincez-les avec de l’eau et séchez-les dans le capot de fumée. Une fois secs, sceller les glissières avec de la colle d’arbre neutre, placer délicatement un couvercle sur la glissière et les sécher dans le capot de fumée, puis l’image de l’échantillon sous un microscope. Ce protocole a été utilisé pour créer une lignée stérile masculine par agrobactérie ment médiatisée transformation génétique dans le riz.
Les calli embryogéniques ont été directement utilisés pour la transformation ou sous-cultivés pour la prolifération afin d’obtenir plus de calli pour d’autres infections. Après avoir co-cultivé pendant 48 heures, les calli ont été déplacés vers un deuxième tour de sélection moyen. Après 10 à 14 jours, calli transformé a montré le microcalli nouvellement formé tandis que le calli non transformé est devenu brun et est mort.
Plus tard, des calli colorés sains et crémeux ont été transférés dans le milieu de régénération. Les calli transformés ont progressivement montré des taches vertes. Ces taches vertes ont été cultivés dans le milieu de régénération pour permettre la croissance des pousses, puis déplacées en deux médiums de SP pour induire des racines.
Plus tard, des pousses saines et vigoureuses aux racines bien développées ont été récoltées. Au total, 21 semis régénérés ont été obtenus. L’amplification de PCR pour la région d’Hygromycin a prouvé que la fréquence de transformation était approximativement 85.71%Les transformateurs ont été génotypés pour identifier les mutations aux emplacements cibles de sgRNA.
Parmi les 18 plantes transgéniques, huit lignées hétérozygotes et trois lignées homozygotes étaient positives CRISPR CAS9. Les mutants homozygotes knockout ont été validés par l’observation masculine de base des organes reproducteurs. Les anthères d’osabcg15 étaient plus petites et plus pâles que celles du type sauvage et manquaient de grains de pollen matures.
La microscopie transversale de section a été exécutée pour étudier les défauts morphologiques d’anthère dans osabcg15. Au stade 10, les microspores de type sauvage sont devenues rondes et vacuolées avec de l’exine teintée de bleu foncé. En revanche, les microspores osabcg15 se sont effondrées et dégradées.
Lorsque vous essayez ce protocole, il est important de s’assurer que le matériel recueilli est au stade de la méiose et de contrôler le temps de séchage de l’air du calli.
