Il s’agit d’une démonstration d’une méthode simple pour l’expression, l’extraction et la purification de l’IgG humain recombinant fusionné au GFP dans les plantes nicotiana benthamiana liées au tabac. Ce protocole peut être utilisé pour la purification et la visualisation des anticorps produits par les plantes, des fusions d’anticorps et de la plupart des protéines qui peuvent être purifiées par chromatographie des colonnes. Ce protocole permet aux chercheurs et aux étudiants des laboratoires de travail universitaires de visualiser les protéines étiquetées GFP à la plupart des étapes du processus de production de protéines.
Déposer les granulés de tourbe du sol sur un plateau et verser de l’eau préalablement bouillie et encore chaude sur les granulés de tourbe pour une expansion complète. Les granulés ront quelques minutes pour se développer complètement. Une fois les palettes complètement élargies, placez deux à trois graines de nicotiana benthamiana sur chaque granule de tourbe à l’aide d’une pince à épiler.
Une fois cela fait, vous aurez besoin de verser environ 0,5 pouces d’eau pour couvrir le fond du plateau. N’oubliez pas d’étiqueter le plateau avec la date d’ensemencement. Continuer à arroser les semis tous les jours avec des quantités appropriées d’engrais.
Le plateau doit être recouvert d’un dessus humidome et placer dans une chambre de croissance. La pastille de tourbe ensemencée doit être conservée dans la chambre de croissance à 23 à 25 degrés Celsius avec une période photo de 16 heures et une humidité relative de 60 %. Après une semaine, retirer une plante supplémentaire de la pastille en laissant chaque palette de tourbe avec un seul semis.
Lorsque les plantes ont de deux à trois semaines, transférer chaque granule de tourbe dans un pot individuel contenant un sol contrôlé par l’humidité. Continuer à arroser les semis tous les jours avec un gramme par litre d’engrais, ne jamais laisser le sol complètement sec. Les plantes sont prêtes pour l’infiltration quand elles ont cinq à six semaines.
Les étapes suivantes doivent être effectuées à côté d’un brûleur Bunsen et des techniques aseptiques de base doivent être appliquées pour éviter la contamination. Vous aurez besoin d’une plaque de kanamycine Lb. Un microgramme par concentration millilitres de kanamycine.
strict avec deux mutations EHA105 hébergeant votre construction désirée résistante à la kanamycine et cultivé du jour au lendemain. EHA105 est l’une des souches les plus couramment utilisées d’Agrobacterium deux mutations. Pour commencer la culture, remplissez le tube conique avec 10 millilitres de lb de médias, ensuite, à 10 microlitres de 100 microgrammes par kanamycine millilitre, vous pouvez également ajouter 10 microlitres de 2,5 microgrammes par millilitre de rifampicine pour prévenir la contamination par e-coli.
À partir de la plaque, vous utiliserez une seule colonie isolée vérifiée par PCR pour développer votre nouvelle culture. Choisissez votre colonie isolée et inoculer dans le lb. Placer l’inoculation sur le shaker.
incuber à 30 degrés Celsius et 120 à 150 RPM pendant la nuit. Le lendemain, si la culture Agrobacterium est attirée par OD600 égalant 0,6 à 0,9, elle peut être utilisée pour l’infiltration. S’il est envahi OD600 au-dessus d’un à deux millilitres devrait être transféré à un lb frais avec des antibiotiques et cultivé à l’OD600 requis.
Une fois à od600 approprié placer les cultures dans une centrifugeuse, en s’assurant que la centrifugeuse est équilibrée. Peler les bactéries par centrifugation à 4500G pendant 20 minutes à température ambiante. Ils ne peuvent pas se superposer des deux échantillons.
Puis résuspendez chaque granulé et un tampon d’infiltration X pour porter l’OD final à 0,4. Combinez des volumes égaux de chaque construction de fusion IgG avec la construction de la chaîne de lumière, pour obtenir l’OD final de 0,2 par construction dans chaque tube. Prenez un trombones et une plante benthamiana de cinq à six semaines dès la première étape.
En utilisant le bord tranchant du trombone déplié faire une petite crevaison dans la première couche épidermique de la feuille. Évitez de percer la feuille jusqu’au bout. Remplissez une seringue millilitre sans aiguille fixée avec la solution Agrobacterium préparée dès la deuxième étape.
Couvrez le trou fait dans l’étape précédente avec l’extrémité de la seringue. Et poussez lentement pour injecter les bactéries dans la feuille tout en appliquant la contre-pression douce de derrière la feuille. Essayez d’infiltrer la majeure partie de la feuille et de piquer la feuille un maximum de trois à quatre fois, l’excès de dommages causés par les feuilles peut nuire au rendement en protéines.
Regardez la feuille s’assombrir au fur et à mesure que la solution est injectée sans appliquer trop de pression sur la seringue. La feuille de plante infiltrée apparaîtra la plupart du temps foncée de la vue du bas. Notez que cette solution bactérienne devrait suffire pour au moins trois à quatre plantes par construction.
Autoclave toute solution bactérienne restante avant de jeter. Après avoir terminé l’infiltration sans aiguille, remettre les plantes dans la chambre de croissance et continuer à arroser quotidiennement. Observé les feuilles pour la chlorose, la nécrose ainsi que pour la fluorescence GFP, hiver longue et courte vague lampe UV.
Habituellement, les feuilles les jours quatre et cinq montrent la fluorescence GFP la plus élevée. Récoltez toutes les feuilles à quatre à cinq jours après l’infiltration et pesez la quantité totale de matière folio. Vous pouvez utiliser le matériau folio immédiatement pour le traitement en aval, ou vous pouvez le congeler en négatif 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à utiliser Placez les plantes infiltrées dans la chambre de croissance et continuer à arroser tous les jours.
observé les feuilles pour la chlorose, la nécrose, les changements de couleur et la mort des tissus foliaire dans les zones infiltrées. Plantes observées pour la fluorescence GFP. Si GFP est présent sous une lampe UV à ondes longues et courtes.
L’expression des protéines augmente au fil du temps, la fluorescence la plus élevée des deux constructions de GFP se produisant généralement entre les jours quatre et cinq. Récoltez toutes les feuilles à quatre à cinq jours après l’infiltration et pesez la matière totale des feuilles. Utilisez-le immédiatement pour les processus en aval ou congelez à 80 degrés Celsius négatifs jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi.
Pendant le processus de mélange, assurez-vous de garder les tampons et les tasses de mélangeur sur la glace ou à quatre degrés Celsius avant utilisation. Placer le tissu végétaux de la quatrième étape dans la tasse du mélangeur pré-procès. À tampon d’extraction réfrigéré contenant des concentrations respectives de PMSF et d’ascorbate de sodium à la tasse de mélangeur.
Déposer la tasse du mélangeur sur le mélangeur, prendre une feuille pré-coupée de para film et l’étirer sur le dessus de la tasse du mélangeur. Mélanger le tissu folio avec le tampon d’extraction pour imaginer 80 avec 22e intervalles. Vous devrez bien mélanger entre les cycles de mélange au besoin.
Le mélange doit sembler homogène sans morceaux de matériau folio. Transférer le matériel mélangé dans un bécher. À une barre d’agitation et remuer pendant quatre degrés Celsius pendant 30 minutes pour améliorer la solubilité des protéines et permettre la précipitation des solides.
Placez deux couches de tissu nu sur un bécher propre sur la glace et versez l’extrait à travers elle pour enlever les gros débris de feuilles. Après tout l’extrait est versé à travers le tissu miroir plier le tissu miroir pour presser l’extrait de feuille résiduelle. L’extrait doit apparaître vert foncé sans particules visibles.
Transférer l’extrait dans des tubes de centrifugeuse. Centrifugeuse l’extrait à 16 000 G pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius. Ceci granulera n’importe quel matériel insoluble restant.
Assurez-vous que les deux tubes sont équilibrés et que le couvercle du rotor est solidement serré. Après centrifugation, la pastille doit être visible, par exemple supernatant et jeter la pastille. Filtrer le supernatant à l’aide d’une seringue de 50 millilitres et d’un filtre à fibres de verre.
Recueillir 50 microlitres d’un échantillon et étiqueter l’extrait brut pour une analyse ultérieure. Installez une colonne de polypropylène qui contient 20 millilitres d’échantillon. Estimer la quantité de boue nécessaire en fonction du type d’immunoglobuline cible et de son affinité avec la résine.
Dans cette démonstration, nous utilisons trois millilitres de boue. Généralement trois millilitres de boue totale avec 1,5 millilitres de volume de lit est efficace pour la purification de plusieurs milligrammes d’anticorps. Pipette soigneusement la quantité requise de boue résuspendée dans la colonne plafonnée.
Ouvrez la sortie de colonne à partir du bas de la colonne et laissez-la s’écouler jusqu’à ce que la majeure partie du tampon soit partie. Versez immédiatement 10 millilitres de tampon de lavage une fois PBS sur le dessus. Laissez-le s’écouler et répétez cette étape de lavage deux fois.
Appliquez l’échantillon filtré de l’étape cinq à la colonne et recueillez le flow-through. Aliquot 50 microlitres de flow-through pour une analyse ultérieure. Enregistrez le reste de l’écoulement au cas où l’anticorps ne se lierait pas à la résine.
Lavez la résine deux fois avec 10 millilitres d’une fois PBS pour réduire la liaison non spécifique. Si désiré, aliquot 50 microlitres de lavage que le tampon draine à travers la colonne pour vérifier que l’anticorps cible n’est pas fait allusion avec un tampon de lavage. Alors que le tampon de lavage est en cours d’exécution à travers la résine, la configuration et l’étiquette de cinq tubes de centrifugeuse micro avec 125 microlitres de stérile, un tris-HCL molaire au pH huit pour neutraliser le tampon d’élitution.
Sinon, ajoutez 30 microlitres de deux tris molaires de base pour obtenir plus concentré eluate. Pendant l’élitution, la lumière UV peut être utilisée pour la visualisation. Cela n’a pas besoin d’être fait pour la durée de l’élitution.
Si vous avez des UV, assurez-vous de porter l’équipement de protection individuelle approprié pour éviter les dommages aux yeux et à la peau. Une lumière UV n’a pas besoin d’être utilisée pendant l’étape d’élitution. Elute les anticorps en appliquant cinq millilitres de tampon d’élitution à la colonne et de recueillir une fraction millilitre, à chaque tube désigné de l’étape précédente.
Régénérez immédiatement la colonne en appliquant 20 millilitres suivis de 10 millilitres de tampon de lavage. Assurez-vous que la résine n’est pas laissée dans un environnement acide pendant une période prolongée. L’élitution doit apparaître fluorescente.
Souvent, la fluorescence la plus élevée est observée dans la deuxième élitution, mais peut varier d’une extraction à l’autre. Pour le stockage, laver la résine avec 10 millilitres de 20% d’éthanol et de PBS et laisser égoutter à mi-chemin. Récapitulez le haut, puis le bas de la colonne et maintenez la verticale à quatre degrés C.Déterminez la concentration d’anticorps à l’aide d’un spectromètre photo en mesurant l’absorption à 280 nanomètres.
Stockez les évasifs dans des températures négatives de 80 degrés Celsius et aliquot 50 microlitres de chaque fraction dans un tube séparé pour une analyse plus approfondie. En général, les durées protéiques peuvent être réutilisées jusqu’à 10 fois sans perte significative d’efficacité. Consultez les lignes directrices du fabricant pour plus de détails déterminer la concentration d’anticorps, à l’aide d’un spectrophotomètre en mesurant l’absorption à 280 nanomètres.
Stockez les évasifs en moins 80 degrés Celsius et aliquot 50 microlitres de chaque fraction dans un tube séparé pour une analyse plus approfondie. L’analyse des protéines purifiées par page Zs peut être effectuée en suivant les protocoles standard. Fluorescence observée en conséquence indiquant le succès du clonage, de l’infiltration et de l’expression d’une construction contenant du GFP.
Au cours de quelques jours, les fluorescents devraient augmenter progressivement avec une fluorescence élevée les jours quatre et cinq. Lorsque la protéine G est utilisée, la liaison protéique fluorescente et l’élitution subséquente de la colonne indiquent la purification d’une fusion IgG contenant comme GFP stable. Et le gel exposé aux UV, vous pouvez voir seulement les bandes 25KDa et 75KDa de l’échelle.
Vous pouvez également voir, l’échantillon d’elution 2 non réduite. L’elution non réduite conserve sa fluorescence comme la taille relative que l’on pourrait attendre d’un IgG intact comme sa fusion GFP stable. Dans le gel de tache de coomassie les échantillons réduits et non réduits sont visualisés.
Tous les composants de l’échelle sont visibles, les protéines indigènes et les fusions IgG peuvent être observées dans l’extrait total supernatant et couler à travers les échantillons. Le lavage contient une petite quantité de fusion IgG. Elution un et quatre contenaient moins de protéines concentrées comme on s’y attend car la plupart des protéines ont généralement échappé aux deuxième et troisième étapes d’élitution.
Elution 2 non réduction peut également être vu plusieurs bandes existent dans tous les échantillons d’élitution de réduction. 75KDa indique un fusible à chaîne lourde à GFP. 50KDa indique une chaîne lourde seule, 25KDa indique une chaîne légère seule, et 10 KDA indique probablement la dégradation qui peut être empêchée par l’ajout d’inhibiteurs de protéase.
Ce protocole peut être utilisé pour la purification de n’importe quel anticorps fusionné à n’importe quelle protéine cible désirée. Le processus peut être modifié pour accueillir diverses quantités de matériau foliique, et permet également la détermination visuelle de la présence de protéines avant, pendant et après la conclusion des processus d’extraction et de purification des protéines. Ces méthodes peuvent être utiles en tant que contrôles et peuvent être utiles pour les techniques d’enseignement.
